Name: isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00
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Ci piace ringraziare i membri in Patologia e Neurochirurgia presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai per l'aiuto con l'approvvigionamento di tessuto cerebrale de-identificato e la citometria a flusso CORE di ISMMS per la consulenza di esperti. Lo studio è stato parzialmente finanziato da NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (a N.M.T.) e R61DA048207 (a S.A.).

NOTA: Il programma per la protezione dei soggetti umani presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai (ISMMS) e il suo Institutional Review Board (IRB) assicurano la condotta etica della ricerca e la conformità con le normative federali, statali e istituzionali. In questo studio, tutti i campioni post-mortem utilizzati sono stati de-identificati, ottenuti con il consenso appropriato attraverso il biorepository, e sono stati esenti dalla designazione di "ricerca umana" dall'IRB dell'ISMMS (HS # 14-01007).
<p cla...

<ol>
	<li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain.">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).</li><li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PsychENCODE+project.">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).</li><li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy.">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse.">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions.">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li><li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor.">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).</li><li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurogenesis-controlling+factor,+Pax6,+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes.">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus.">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li><li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development.">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li><li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX6:+25th+anniversary+and+more+to+learn.">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li><li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy.">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li><li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue:+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium.">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li><li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+&#945;A.">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin &#945;A.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li></ol>

La progettazione sperimentale secondo il protocollo delineato dovrebbe essere finalizzata dopo aver considerato diversi fattori biologici e tecnici. I campioni di tessuto di partenza sono freschi di congelamento, senza essere stati fissati, e preferibilmente hanno un breve intervallo di raccolta post-mortem per massimizzare il recupero dei nuclei. Sulla base dell'esperienza, un PMI fino a 24 ore consente un adeguato recupero dei nuclei; tuttavia, un PMI di 12 ore o meno è preferibile per ottimizzare il recupero dei nucl...

La complessità molecolare degli astrociti umani rimane scarsamente definita nel tessuto primario, richiedendo strumenti migliori per il loro isolamento e caratterizzazione ad alta risoluzione, sia in salute che in malattia. La separazione dei neuroni umani intatti e della glia dalla loro nicchia si è dimostrata difficile a causa dell'accesso limitato di campioni di tessuto cerebrale fresco, della natura fortemente interconnessa dei processi gliali e neuronali e dell'inevitabile attivazione cellulare durante l'elaborazione, che limitano la caratterizzazione molecolare di questi tipi di cellule ex vivo1 . Lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS) è emerso come alternativa allo smistamento delle cellule vive, consentendo la dissociazione e l'immunotagging delle popolazioni di nuclei dal tessuto congelato. Negli ultimi dieci anni, FANS è diventato ampiamente utilizzato per isolare e caratterizzare molecolarmente le popolazioni di nuclei neuronali umani (NeuN +) in una varietà di campioni cerebrali e regioni anatomiche 1,2,3,4.
Tuttavia, metodi simili per isolare specifiche sottopopolazioni di nuclei gliali dalla corteccia umana sono stati limitati, portando a una relativa mancanza di sofisticazione nella comprensione della complessità degli astrociti sia nei tessuti normali che in quelli malati. A tal fine, un protocollo precedentemente pubblicato è stato adattato per isolare le popolazioni neuronali umane utilizzando FANS4 e un metodo è stato convalidato per arricchire gli astrociti (e per i progenitori oligodendrogliali) utilizzando una combinazione di tripli anticorpi, catturando gli astrociti sia in condizioni di riposo che reattive5. Per arricchire specificamente gli astrociti nella frazione NeuN-, sono stati utilizzati anticorpi contro uno dei due fattori di trascrizione noti per essere espressi in modo differenziale tra le popolazioni di astrociti, PAX6 o SRY-box transcription factor 9 (SOX9)6,7. PAX6 è altamente espresso durante lo sviluppo fetale precoce all'interno di progenitori radiali simili a glia nelle zone germinali e contribuisce sia alla neurogenesi e alla gliogenesi 8,9,10,11, sia alla specifica neuronale retinica12. Nell'adulto, PAX6 è differenzialmente sovraespresso negli astrociti umani a riposo6 e mostra co-espressione proteica con la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) negli astrociti del tessuto epilettico umano13.
Questo protocollo descrive l'isolamento simultaneo di popolazioni di nuclei neocorticali neuronali e arricchiti di astrociti da parte di FANS. Il tessuto post-mortem fresco (non fissato) congelato a scatto (cioè fresco-congelato) raccolto dalla corteccia adulta viene prima dissociato meccanicamente e chimicamente. Dopo la lisi e l'ultracentrifugazione in un gradiente di saccarosio, i componenti citoplasmatici ed extracellulari vengono scartati mentre i nuclei vengono trattenuti. I nuclei vengono quindi etichettati con anticorpi nucleari coniugati fluorescentemente corrispondenti ai lignaggi bersaglio desiderati e ordinati utilizzando FANS. Seguendo questo approccio, l'arricchimento degli astrociti è dimostrato nelle popolazioni PAX6+ NeuN- raccolte, convalidate sia da un pannello qPCR mirato che dal sequenziamento dell'RNA nucleare a valle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>70013073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377A5MI</td>
			<td>mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN50A4MI</td>
			<td>mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C614-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 40 &#181;M</td>
			<td>SP Scienceware</td>
			<td>136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Library Kit</td>
			<td>Illumina, Nextera</td>
			<td>FC-121&#8211;1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>BD FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M13-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP234705J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td>
			<td>Clontech Laboratories</td>
			<td>635005</td>
			<td>Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J22638AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>non-ionic surfactant in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>reagent for isolation of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Optima XE-100</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td>referred to as distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting

La complessità degli astrociti umani rimane scarsamente definita nel tessuto umano primario, richiedendo strumenti migliori per il loro isolamento e caratterizzazione molecolare. Lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS) può essere utilizzato per isolare e studiare con successo le popolazioni di nuclei neuronali umani (NeuN +) dal tessuto d'archivio congelato, evitando così problemi associati alla manipolazione di tessuto fresco. Tuttavia, mancano sforzi per isolare in modo simile l'astroglia dall'elemento non neuronale (NeuN-). Una strategia di immunotagging recentemente sviluppata e convalidata utilizza tre anticorpi del fattore di trascrizione per isolare simultaneamente popolazioni di nuclei neuronali arricchiti (NeuN +), astrociti (paired box protein 6 (PAX6) + NeuN-) e oligodendrociti progenitori (OLIG2 + NeuN-) da tessuto temporale temporale umano postmortem non malato, fresco (non fisso) congelato a scatto.
Questa tecnica si è dimostrata utile per la caratterizzazione delle alterazioni del trascrittoma specifiche del tipo cellulare nella neocorteccia patologica primaria dell'epilessia. Le analisi trascrittomiche hanno confermato che le popolazioni selezionate pax6 + NeuN sono robustamente arricchite per i marcatori pan-astrocitari e catturano gli astrociti sia in condizioni di riposo che reattive. Questo articolo descrive la metodologia FANS per l'isolamento di popolazioni di nuclei arricchiti di astrociti dalla corteccia umana appena congelata, compresa la dissociazione dei tessuti in sospensione a nucleo singolo (sn); immunotagging di nuclei con anticorpi coniugati fluorescenti anti-NeuN e anti-PAX6; FANS gating strategie e metriche di controllo qualità per ottimizzare la sensibilità e la specificità durante lo smistamento e per confermare l'arricchimento degli astrociti; e l'approvvigionamento raccomandato per il sequenziamento dell'accessibilità del trascrittoma e della cromatina a valle alla risoluzione bulk o sn. Questo protocollo è applicabile per campioni corticali umani non necrotici, congelati freschi, con varie patologie e raccolta di tessuto post mortem raccomandata entro 24 ore.

I nuclei sono stati raccolti da tessuto neocorteccia temporale fresco (non fissato) congelato a scatto con un tempo di raccolta post mortem di 12 ore. Dopo la dissociazione dei tessuti in sospensione nucleica, i campioni sono stati incubati con anticorpi contro NeuN, PAX6 e OLIG2 e ordinati in base al gating mostrato in Figura 1 e Figura 2. I nuclei sono stati raccolti da popolazioni ordinate NeuN+, PAX6+NeuN- e OLIG2+NeuN- (Figura 1E,F</str...

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Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

Abbiamo sviluppato un metodo che arricchisce e isola le popolazioni di astrociti umani da tessuti freschi congelati per l'uso in analisi molecolari a valle.

Isolamento di popolazioni di astrociti umani adulti dalla corteccia appena congelata mediante selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Questo protocollo può aiutare gli scienziati che sono interessati a studiare la funzione molecolare degli astrociti umani nella loro nicchia nativa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'isolamento e l'arricchimento di un tipo di cellula specifica, astrociti adulti da campioni di tessuto cerebrale umano alla rinfusa utilizzando la selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza. Questa metodologia può essere applicata per isolare altri tipi di cellule dalla neocorteccia umana, come i neuroni e le cellule progenitrici degli oligodendrociti utilizzando altri anticorpi coniugati fluorescenti appropriati.Iniziare a sezionare circa 200-400 milligrammi di tessuto da un campione di tessuto della corteccia umana adulta fresco congelato. Posizionare il tessuto in un douncer di tessuto di vetro da sette millilitri contenente quattro millilitri di tampone di lisi ghiacciato sul ghiaccio e macinare il tessuto circa 50 volte. Trasferire l'omogeneizzato in un tubo di polipropilene ultracentrifuga da 12 millilitri.Utilizzare una pipetta da cinque millilitri per aggiungere 6,5 millilitri di tampone di saccarosio ghiacciato sul fondo del tubo ultracentrifugato senza disturbare l'interfaccia tra il saccarosio e l'omogeneizzato tissutale. Per raccogliere i nuclei, ultracentrifugare il lisato per un'ora a 101, 814 volte G e aspirare accuratamente il surnatante e i detriti senza disturbare il pellet. Aggiungere lo 0,1% di BSA in PBS al tubo ultracentrifuga per un'incubazione di 10 minuti sul ghiaccio prima di risospendere il pellet di nuclei.Quindi, utilizzare il tripano blu per visualizzare i nuclei intatti al microscopio ottico e per assicurarsi che la concentrazione sia superiore a 10-quinto nucleo per millilitro Per lo smistamento attivato dalla fluorescenza dei nuclei isolati, aggiungere circa 20 microlitri del campione risospeso a una soluzione anticorpale contenente l'anticorpo anti-NeuN del topo coniugato Alexa fluor 555. Aggiungere circa 20 microlitri del campione risospeso a una soluzione anticorpale contenente anticorpi anti-PAX6 di topo coniugati apc. Dopo un'incubazione di un'ora a quattro gradi Celsius con agitazione, al riparo dalla luce, aggiungere DAPI con un rapporto 1:1000 a tutti i campioni e controlli.Per includere nuclei delle dimensioni appropriate ed escludere globuli rossi e detriti, utilizzare un tubo di controllo per bloccare le cellule dalle loro aree di dispersione anteriore e laterale. Per selezionare la popolazione di nuclei singoletti, gate per area di dispersione in avanti rispetto alla larghezza o altezza di dispersione in avanti e area di dispersione laterale rispetto alla larghezza o altezza di dispersione laterale. Gate by DAPI per includere solo le singolette dei nuclei intatti ed escludere eventuali detriti e doppietti.Dopo aver gating in base a eventuali controlli di fluorescenza aggiuntivi, eseguire il campione di controllo solo DAPI. Esegui il controllo NeuN Alexa fluor 555-only per determinare il cutoff per la colorazione NeuN-positiva nel canale Alexa fluor 555. Eseguire il controllo PAX6 solo APC per determinare il cutoff per la colorazione PAX6-positiva nel canale APC.Dopo che tutti i controlli sono stati eseguiti, gate le cellule NeuN-positive per raccogliere i neuroni e gate le cellule PAX6-positive con la popolazione NeuN-negativo per raccogliere gli astrociti. Gate e raccogliere eventuali ulteriori popolazioni gliali di interesse dalla popolazione NEUN-negativa PAX6-negativa. Per il sequenziamento dell'RNA monocucleno di massa, dopo aver raccolto da 50.000 a 500.000 nuclei in PBS integrato con BSA allo 0,04%, aggiungere due millilitri di soluzione di saccarosio, 50 microlitri di cloruro di calcio monomolare e 30 microlitri di acetato di magnesio monomastre al campione.Portare il volume finale della sospensione fino a 10 millilitri con PBS. Mescolare il contenuto del tubo per inversione e incubare la reazione sul ghiaccio per 15 minuti. Pellet i nuclei per centrifugazione e risospesso i nuclei in un millilitro di reagente di estrazione dell'RNA.Quindi, ruotare il tubo, congelare il campione su ghiaccio secco e conservare i nuclei a meno 80 gradi Celsius. Per il sequenziamento della cromatina accettabile per la trasposasi a singolo nucleo alla rinfusa, raccogliere da 50.000 a 75.000 nuclei in PBS integrato con BSA allo 0,04% in un tubo di microcentrifuga rivestito con BSA al 5% e congelare i nuclei fino alla loro analisi a valle. Le popolazioni di nuclei progenitori neuronali, astrociti e oligodendrociti possono essere ordinate da un campione di neocorteccia temporale umana post-mortem fresco congelato, come dimostrato.Gli studi di sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo hanno ulteriormente dato priorità a PAX6 come fattore di trascrizione nucleare differenzialmente espresso in entrambe le sottopopolazioni di astrociti adulti protoplasmatici e fibrosi. Dopo l'ordinamento, possono essere caratterizzate alterazioni del trascrittoma specifiche del tipo cellulare nella neocorteccia patologica primaria dell'epilessia. In questa analisi, le analisi trascrittomiche hanno confermato che le popolazioni NeuN-negative PAX6-positive erano robustamente arricchite per i marcatori panastrocitari e impoverite per i marcatori neuronali.La colorazione a immunofluorescenza può essere utilizzata per confermare la co-localizzazione di PAX6 con la proteina acida fibrillare gliale negli astrociti corticali umani. Intervalli post-mortem più brevi sono associati a un maggiore recupero di nuclei intatti da campioni di tessuto fresco. Un alto rendimento di nuclei intatti può essere recuperato dal tessuto congelato fino a 24 ore dopo la mortem, ma a 30 ore, pochissimi nuclei intatti possono essere recuperati.La cosa più importante da ricordare è ottenere la popolazione PAX6-positiva dalla popolazione NeuN-negativa, perché ci sono neuroni che esprimono anche PAX6, e vogliamo escluderli. Questa tecnica ha anche permesso lo studio degli astrociti in campioni cerebrali chirurgici di epilessia, chiarendo ulteriormente la disregolazione molecolare degli astrociti umani nel contesto di una specifica nicchia patologica.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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