Name: isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting at JoVE.com

Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'ndeki Patoloji ve Nöroşirürji üyelerine, tanımlanmamış beyin dokusunun ve uzman tavsiyesi için ISMMS'nin Akış Sitometrisi CORE'unun tedarikinde yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Çalışma kısmen NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (N.M.T.'ye) ve R61DA048207 (SA'ya) tarafından finanse edildi.

NOT: Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'ndeki (ISMMS) İnsan Deneklerin Korunması Programı ve Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB), araştırmanın etik olarak yürütülmesini ve federal, eyalet ve kurumsal düzenlemelere uyumu garanti eder. Bu çalışmada, kullanılan tüm ölüm sonrası örnekler kimliksizleştirilmiş, biyodepo yoluyla uygun rıza altında elde edilmiş ve ISMMS'nin IRB'si (HS # 14-01007) tarafından "insan araştırması" tanımından muaf tutulmuştur.
1. Tampon hazır...

<ol>
	<li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain.">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).</li><li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PsychENCODE+project.">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).</li><li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy.">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse.">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions.">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li><li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor.">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).</li><li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurogenesis-controlling+factor,+Pax6,+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes.">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus.">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li><li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development.">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li><li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX6:+25th+anniversary+and+more+to+learn.">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li><li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy.">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li><li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue:+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium.">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li><li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+&#945;A.">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin &#945;A.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li></ol>

Özetlenen protokolü takip eden deneysel tasarım, çeşitli biyolojik ve teknik faktörler göz önünde bulundurularak sonuçlandırılmalıdır. Başlangıç doku örnekleri, sabitlenmeden taze dondurulur ve tercihen çekirdek iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak için kısa bir postmortem toplama aralığına sahiptir. Deneyime dayanarak, 24 saate kadar bir PMI, yeterli çekirdek geri kazanımına izin verir; Bununla birlikte, bozulmamış çekirdek geri kazanımını optimize etmek için 12 saat veya daha düş...

İnsan astrositlerinin moleküler karmaşıklığı, birincil dokuda zayıf bir şekilde tanımlanmıştır ve hem sağlıkta hem de hastalıkta yüksek çözünürlükte izolasyonları ve karakterizasyonları için daha iyi araçlar gerektirmektedir. Bozulmamış insan nöronlarının ve glia'nın nişlerinden ayrılmasının, taze beyin dokusu örneklerinin sınırlı erişimi, glial ve nöronal süreçlerin yoğun bir şekilde birbirine bağlı doğası ve işleme sırasında kaçınılmaz hücresel aktivasyon nedeniyle zor olduğu kanıtlanmıştır; bunların hepsi bu hücre tiplerinin moleküler karakterizasyonunu ex vivo1 . Floresanla aktive edilen çekirdek ayıklama (FANS), canlı hücre sıralamaya alternatif olarak ortaya çıkmış ve çekirdek popülasyonlarının donmuş dokudan ayrışmasını ve immün etiketlemesini sağlamıştır. Son on yılda, FANS, çeşitli beyin örneklerinde ve anatomik bölgelerdeinsan nöronal (NeuN +) çekirdek popülasyonlarını izole etmek ve moleküler olarak karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3,4.
Bununla birlikte, spesifik glial çekirdek alt popülasyonlarını insan korteksinden izole etmek için benzer yöntemler sınırlandırılmış ve hem normal hem de hastalıklı dokularda astrosit karmaşıklığının anlaşılmasında göreceli bir karmaşıklık eksikliğine yol açmıştır. Bu amaçla, FANS4 kullanarak insan nöronal popülasyonlarını izole etmek için daha önce yayınlanmış bir protokol uyarlandı ve üçlü bir antikor kombinasyonu kullanarak astrositler (ve oligodendroglial progenitörler) için zenginleştirmek için bir yöntem doğrulandı ve astrositleri hem dinlenme hem de reaktif koşullarda yakaladı5. NeuN fraksiyonundaki astrositler için spesifik olarak zenginleştirmek için, antikorlar astrosit popülasyonları arasında farklı olarak eksprese edildiği bilinen iki transkripsiyon faktöründen birine karşı kullanıldı, PAX6 veya SRY-box transkripsiyon faktörü 9 (SOX9)6,7. PAX6, germinal bölgelerdeki radyal glia benzeri progenitörlerde erken fetal gelişim sırasında yüksek oranda eksprese edilir ve hem nörogenez hem de gliogenez 8,9,10,11'e ve retinal nöronal spesifikasyona katkıda bulunur 12. Yetişkinlerde, PAX6, istirahat eden insan astrositlerinde6 farklı şekilde aşırı eksprese edilir ve insan epilepsi dokusu astrositlerinde glial fibriler asidik protein (GFAP) ile protein birlikte ekspresyonu gösterir13.
Bu protokol, neokortikal nöronal ve astrositle zenginleştirilmiş çekirdek popülasyonlarının FANS tarafından eşzamanlı izolasyonunu tanımlar. Yetişkin korteksten toplanan taze (sabitlenmemiş) çıtçıtlı dondurulmuş (yani, taze-dondurulmuş) postmortem doku ilk önce mekanik ve kimyasal olarak ayrışır. Bir sakkaroz gradyanında lizis ve ultrasantrifüjlemeden sonra, çekirdekler korunurken sitoplazmik ve hücre dışı bileşenler atılır. Çekirdekler daha sonra istenen hedef soylara karşılık gelen floresan konjuge nükleer antikorlarla etiketlenir ve FANS kullanılarak sıralanır. Bu yaklaşımı takiben, astrositlerin zenginleştirilmesi, toplanan PAX6 + NeuN- popülasyonlarında, hem hedeflenen bir qPCR paneli hem de aşağı akış nükleer RNA dizilimi ile doğrulanarak gösterilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>70013073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377A5MI</td>
			<td>mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN50A4MI</td>
			<td>mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C614-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 40 &#181;M</td>
			<td>SP Scienceware</td>
			<td>136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Library Kit</td>
			<td>Illumina, Nextera</td>
			<td>FC-121&#8211;1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>BD FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M13-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP234705J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td>
			<td>Clontech Laboratories</td>
			<td>635005</td>
			<td>Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J22638AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>non-ionic surfactant in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>reagent for isolation of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Optima XE-100</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td>referred to as distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting

İnsan astrositlerinin karmaşıklığı, birincil insan dokusunda zayıf bir şekilde tanımlanmıştır ve izolasyonları ve moleküler karakterizasyonları için daha iyi araçlar gerektirmektedir. Floresan ile aktive edilen çekirdek sıralama (FANS), insan nöronal çekirdek (NeuN +) popülasyonlarını donmuş arşiv dokusundan başarılı bir şekilde izole etmek ve incelemek için kullanılabilir, böylece taze dokuyla ilgili sorunlardan kaçınılır. Bununla birlikte, astroglia'yı nöronal olmayan (NeuN-) elementten benzer şekilde izole etme çabaları eksiktir. Yakın zamanda geliştirilen ve doğrulanmış bir immünoetiketleme stratejisi, zenginleştirilmiş nöronal (NeuN +), astrosit (eşleştirilmiş kutu protein 6 (PAX6) + NeuN-) ve oligodendrosit progenitör (OLIG2 + NeuN-) çekirdek popülasyonlarını hastalıksız, taze (sabitlenmemiş) dondurulmuş postmortem insan temporal neokorteks dokusundan eşzamanlı olarak izole etmek için üç transkripsiyon faktörü antikoru kullanır.
Bu tekniğin primer patolojik epilepsi neokorteksindeki hücre tipine özgü transkriptom değişikliklerinin karakterizasyonunda yararlı olduğu gösterilmiştir. Transkriptomik analizler, PAX6 + NeuN sıralanmış popülasyonların pan-astrosit belirteçleri için sağlam bir şekilde zenginleştirildiğini ve hem dinlenme hem de reaktif koşullarda astrositleri yakaladığını doğruladı. Bu makalede, astrositle zenginleştirilmiş çekirdek popülasyonlarının taze dondurulmuş insan korteksinden, doku ayrışmasının tek çekirdekli (sn) süspansiyona ayrıştırılması da dahil olmak üzere izolasyonu için FANS metodolojisi açıklanmaktadır; çekirdeklerin anti-NeuN ve anti-PAX6 floresan konjuge antikorlarla immünoetiketlenmesi; FANLAR, sıralama sırasında hassasiyeti ve özgüllüğü optimize etmek ve astrosit zenginleştirmesini onaylamak için geçit stratejileri ve kalite kontrol metrikleri; ve toplu veya sn çözünürlükte aşağı akış transkriptom ve kromatin erişilebilirlik sıralaması için önerilen tedarik. Bu protokol, çeşitli patolojileri olan nekrotik olmayan, taze dondurulmuş, insan kortikal örnekleri ve 24 saat içinde önerilen postmortem doku toplanması için geçerlidir.

Çekirdekler taze (sabit olmayan) çıtçıtlı dondurulmuş temporal neokorteks dokusundan toplandı ve postmortem toplama süresi 12 saat idi. Çekirdek süspansiyonuna doku ayrışmasından sonra, örnekler NeuN, PAX6 ve OLIG2'ye karşı antikorlarla inkübe edildi ve Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilen kapıya göre sıralandı. Çekirdekler NeuN+, PAX6+NeuN- ve OLIG2+NeuN- sıralanmış popülasyonlardan toplandı (Şekil 1E,F<...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting at JoVE.com

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

İnsan astrosit popülasyonlarını aşağı akış moleküler analizlerinde kullanılmak üzere taze dondurulmuş dokudan zenginleştiren ve izole eden bir yöntem geliştirdik.

Floresan Aktive Edilmiş Çekirdekler Ayıklama Kullanılarak Yetişkin İnsan Astrosit Popülasyonlarının Taze Dondurulmuş Korteksten İzolasyonu

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Bu protokol, insan astrositlerinin moleküler fonksiyonlarını doğal nişlerinde incelemek isteyen bilim insanlarına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, floresan ile aktive olmuş çekirdekleri sıralamayı kullanarak toplu insan beyin dokusu örneklerinden belirli bir hücre tipinin, yetişkin astrositlerin izole edilmesine ve zenginleştirilmesine izin vermesidir. Bu metodoloji, diğer uygun floresan konjuge antikorları kullanarak nöronlar ve oligodendrosit progenitör hücreleri gibi diğer hücre tiplerini insan neokorteksinden izole etmek için uygulanabilir.Taze dondurulmuş bir insan yetişkin korteks doku örneğinden yaklaşık 200 ila 400 miligram doku diseksiyonuna başlayın. Dokuyu buz üzerinde dört mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu içeren yedi mililitrelik bir cam doku dağıtıcısına yerleştirin ve dokuyu yaklaşık 50 kez öğütün. Homojenatı 12 mililitrelik ultrasantrifüj polipropilen tüpe aktarın.Sakkaroz ve doku homojenatı arasındaki arayüzü bozmadan ultrasantrifüj tüpünün dibine 6,5 mililitre buz gibi soğuk sakkaroz tamponu eklemek için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Çekirdekleri toplamak için, lizatı 101, 814 kez G'de bir saat boyunca ultrasantrifüj yapın ve peleti rahatsız etmeden süpernatant ve kalıntıları dikkatlice aspire edin. Çekirdek peletini yeniden askıya almadan önce buz üzerinde 10 dakikalık bir inkübasyon için PBS'de% 0.1 BSA'yı ultrasantrifüj tüpüne ekleyin.Daha sonra, bozulmamış çekirdekleri bir ışık mikroskobu altında görselleştirmek ve konsantrasyonun mililitre başına 10 ila beşinci çekirdeğin üzerinde olmasını sağlamak için tripan mavisi kullanın İzole çekirdeklerin floresan ile aktive edilmiş sıralanması için, Alexa fluor 555 konjuge fare anti-NeuN antikoru içeren bir antikor çözeltisine yeniden askıya alınmış numunenin yaklaşık 20 mikrolitresini ekleyin. Yeniden askıya alınan numunenin yaklaşık 20 mikrolitresini, APC konjuge fare anti-PAX6 antikoru içeren bir antikor çözeltisine ekleyin. Dört santigrat derecede sallantılı, ışıktan korunan bir saatlik inkübasyondan sonra, tüm numunelere ve kontrollere 1:1000 oranında DAPI ekleyin.Uygun büyüklükteki çekirdekleri dahil etmek ve kırmızı kan hücrelerini ve kalıntıları dışlamak için, hücreleri ileri ve yan saçılma alanlarına göre kapılamak için bir kontrol tüpü kullanın. Tekli çekirdek popülasyonunu seçmek için, ileri saçılma alanına karşı ileri saçılma genişliğine veya yüksekliğine ve yan saçılma alanına karşı yan saçılma genişliğine veya yüksekliğine karşı kapı kapı dolaşın. Sadece bozulmamış çekirdek teklilerini içerecek ve herhangi bir enkaz ve çifti dışlayacak şekilde DAPI tarafından kapı.Ek floresan kontrollerine göre geçit yaptıktan sonra, yalnızca DAPI kontrol örneğini çalıştırın. Alexa fluor 555 kanalındaki NeuN-pozitif boyama için kesintiyi belirlemek üzere NeuN Alexa fluor 555'e özel kontrolü çalıştırın. APC kanalındaki PAX6 pozitif lekelenmenin kesilmesini belirlemek için yalnızca PAX6 APC kontrolünü çalıştırın.Tüm kontroller yapıldıktan sonra, nöronları toplamak için NeuN-pozitif hücreleri kapıya koyun ve astrositleri toplamak için PAX6-pozitif hücreleri NeuN-negatif popülasyonla kapılayın. NeuN-negatif PAX6-negatif popülasyondan ilgilenilen ek glial popülasyonları kapılayın ve toplayın. Toplu tek çekirdekli RNA dizilimi için,% 0.04 BSA takviyeli PBS'de 50.000 ila 500.000 çekirdek topladıktan sonra, numuneye iki mililitre sakkaroz çözeltisi, 50 mikrolitre bir molar kalsiyum klorür ve 30 mikrolitre bir molar magnezyum asetat ekleyin.PBS ile süspansiyonun son hacmini 10 mililitreye kadar getirin. Tüp içeriğini ters çevirerek karıştırın ve reaksiyonu 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Çekirdekleri santrifüjleme ile toplayın ve çekirdekleri bir mililitre RNA ekstraksiyon reaktifinde yeniden askıya alın.Ardından, tüpü vorteksleyin, numuneyi kuru buz üzerinde dondurun ve çekirdekleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Toplu tek çekirdekli transpozaz-kabul edilebilir kromatin dizilimi için, %5 BSA ile kaplanmış bir mikrosantrifüj tüpünde %0,04 BSA takviyeli PBS içine 50.000 ila 75.000 çekirdek toplayın ve çekirdekleri aşağı akış analizlerine kadar dondurun. Nöronal, astrosit ve oligodendrosit progenitör çekirdek popülasyonları, gösterildiği gibi taze dondurulmuş bir postmortem insan temporal neokorteks örneğinden ayrılabilir.Tek çekirdekli RNA dizileme çalışmaları, PAX6'yı hem protoplazmik hem de fibröz yetişkin astrositler alt popülasyonlarında diferansiyel olarak eksprese edilen bir nükleer transkripsiyon faktörü olarak daha da önceliklendirmiştir. Sıralamadan sonra, primer patolojik epilepsi neokorteksindeki hücre tipine özgü transkriptom değişiklikleri karakterize edilebilir. Bu analizde, transkriptomik analizler, PAX6-pozitif NeuN-negatif popülasyonların panastrosit belirteçleri için sağlam bir şekilde zenginleştirildiğini ve nöronal belirteçler için tükendiğini doğruladı.İmmünofloresan boyama, PAX6'nın insan kortikal astrositlerinde glial fibriler asidik protein ile birlikte lokalizasyonunu doğrulamak için kullanılabilir. Daha kısa postmortem aralıklar, taze doku örneklerinden daha fazla bozulmamış çekirdek geri kazanımı ile ilişkilidir. Dondurulmuş dokudan 24 saat sonrasına kadar yüksek miktarda bozulmamış çekirdek geri kazanılabilir, ancak 30 saatte çok az sayıda sağlam çekirdek geri kazanılabilir.Hatırlanması gereken en önemli şey, PAX6-pozitif popülasyonu NeuN-negatif popülasyondan almaktır, çünkü PAX6'yı da ifade eden nöronlar vardır ve bunları dışlamak istiyoruz. Bu teknik aynı zamanda epilepsi cerrahi beyin örneklerinde astrositlerin incelenmesine izin verdi ve insan astrositlerinin moleküler düzensizliğini belirli bir patolojik niş bağlamında daha da aydınlattı.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Fetal Fare Visseral Organlardan Otonom Sinir progenitörlerin Floresans aktive Hücre Sıralama (FACS) İzolasyon için bir optimize Prosedürü

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Nörobilim

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Yüksek alan fMRI kullanılarak Yetişkin kedilerde işitme korteksi Fonksiyonel Görüntüleme

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Mikrodisseksiyon tarafından Gelişmekte Serebellumunda farklı olarak hücre popülasyonlarının İzolasyonu

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) ve Taze ve Dondurulmuş Rat Beyin Dokusu gelen Fos-ifade nöronlar Gen İfadesi Analizi

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Floresans ile kurulan Purified Gabaerojik veya glutamaterjik nöronların primer hücre kültürü-aktif hücre sıralama

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Radyoaktif Sinyalin Hücresel Kökenini Belirlemek için Floresan Aktive Hücre Sıralama-Radyoligand ile Tedavi Edilmiş Doku (FACS-RTT)

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...