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April 28th, 2022
DOI :
April 28th, 2022
•0:04
Introduction
0:44
Lysate Digestion
2:08
Off‐Line HpH‐RP Chromatographic Fractionation of Peptides
2:53
R‐Methylated Peptide Immuno‐Affinity Enrichment
6:47
Results: R‐Methylation Analysis by Mass Spectrometry
8:39
Conclusion
Transcript
यह प्रोटोकॉल अत्यधिक महत्वपूर्ण है क्योंकि यह मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन आर्जिनिन मिथाइलेशन के वैश्विक विश्लेषण के लिए अत्याधुनिक वर्कफ़्लो का प्रतिनिधित्व करता है। यह एकल शैली संकल्प के साथ आर-मिथाइलेटेड प्रोटीन की पहचान और प्रोफाइल करने का एकमात्र तरीका है जो अन्य जैव रासायनिक तकनीकों के साथ प्राप्त करने योग्य नहीं है। जब पीआरएमटी इनहिबिटर के उपयोग के साथ युग्मित किया जाता है, जिनमें से कई नैदानिक परीक्षणों और कैंसर विरोधी दवाओं में होते हैं, तो यह प्रोटोकॉल उनकी कार्रवाई के तंत्र के गहन विश्लेषण की अनुमति देता है।
शुरू करने के लिए, 4.5 मिलीमोलर की अंतिम सांद्रता पर अल्ट्राप्योर पानी में घुलने वाले डीटीटी के स्टॉक समाधान का उपयोग करके प्रोटीन के थिओल समूह की कमी करें और प्रतिक्रिया को 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तक चलने दें। 10 मिलीमोलर की एकाग्रता पर आयोडोसेटामाइड जोड़कर और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करके प्रोटीन के थिओल समूह का क्षारीकरण करें। प्रोटियोलिसिस दक्षता को सत्यापित करने के लिए, एसडीएस-पेज कूमासी-दाग वाले जेल पर बाद के विश्लेषण के लिए प्रोटीन अर्क का एक एलिकोट सहेजें और पाचन पर नमूने की इसी मात्रा के साथ इसकी तुलना करें।
शेष प्रोटीन अर्क को पीएच 8.0 पर 20 मिलीमोलर एचईपीईएस के चार संस्करणों के साथ पतला करें ताकि दो मोलर की अंतिम यूरिया एकाग्रता तक पहुंचा जा सके। नमूने को दो भागों में विभाजित करें, फिर अनुक्रमण ग्रेड संशोधित ट्रिप्सिन को एक में और लिसार्गीनेस प्रोटीज को दूसरे में जोड़ें। एंजाइमैटिक पाचन की अनुमति देने के लिए थर्मोमिक्सर में 600 रोटेशन प्रति मिनट पर 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को रात भर छोड़ दें।
प्रत्येक क्रोमैटोग्राफिक ढाल के लिए, सभी अंशों को एक गहरी 96-वेल प्लेट में एकत्र करें। ढाल की शुरुआत से पहले एकत्र किए गए अंशों को पूर्व नामक एक एकल अंश में पूल करें। उच्च पीएच से 60 अंशों को 14 अंतिम अंशों में गैर-सन्निहित तरीके से पूल करके चरण तरल क्रोमैटोग्राफिक ढाल को उलट दिया जाता है।
गैर-सन्निहित संयोजन प्राप्त करने के लिए, पाठ पांडुलिपि में वर्णित उच्च पीएच उलट चरण अंशों को पूल करें। ढाल के बाद एकत्र किए गए अंशों को पोस्ट नामक एक अद्वितीय अंश में पूल करें। ट्रिप्सिन और लिसारगीनेस पाचन से दो नमूनों के लिए संशोधित पेप्टाइड के अनुक्रमिक इम्यूनो-आत्मीयता संवर्धन को अलग-अलग करें।
10एक्स केंद्रित इम्यूनो-एफिनिटी शुद्धिकरण या आईएपी बफर को 10 बार पतला करें। पेप्टाइड्स को ट्यूब के तल तक घुमाने के लिए पांच मिनट के लिए 2,000 जी पर लियोफिलाइज्ड पेप्टाइड्स को सेंट्रीफ्यूज करें। पेप्टाइड्स को प्रति 15 मिलीलीटर ट्यूब में पतला आईएपी बफर के 250 माइक्रोलीटर के साथ पुन: निलंबित करें और 1.5 मिलीलीटर कम बाइंडिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें।
यह जांचने के लिए कि पीएच छह से अधिक है, लिटमस पेपर का उपयोग करें। बाद के एमएस विश्लेषण के लिए इनपुट के रूप में प्रत्येक अंश का एक छोटा एलिकोट रखें। समानांतर में असममित रूप से डाइमिथाइलेटेड, या एडीएमए, और सममित रूप से डिमेथिलेटेड, या एसडीएमए, पेप्टाइड्स के इम्यूनो संवर्धन को करने के लिए प्रत्येक अंश को दो भागों में विभाजित करें।
चयनित एंटी-पैन आर-मिथाइलेटेड एंटीबॉडी की तीन शीशियां तैयार करें जो प्रारंभिक प्रोटीन अर्क के प्रति 10 मिलीग्राम प्रोटीन ए अगारोस मोतियों से संयुग्मित होती हैं। प्रत्येक शीशी को 30 सेकंड के लिए 2,000 जी पर सेंट्रीफ्यूज करके और मोतियों से बफर को हटाकर अगारोस मोतियों के लिए संयुग्मित एंटीबॉडी की सही मात्रा तैयार करें। मोतियों को 1X PBS के एक मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं, उन्हें 30 सेकंड के लिए 2,000 G पर सेंट्रीफ्यूज करके।
अंतिम धोने के बाद, प्रत्येक शीशी के लिए 40 माइक्रोलीटर 1 एक्स पीबीएस में मोतियों को फिर से निलंबित करें, उन्हें पूल करें और फिर अंत में उन्हें 16 अंशों में समान रूप से विभाजित करें। प्रत्येक ट्यूब में 1X IAP बफर के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें और इनवर्ट करके मिलाएं। फिर चार डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए घूर्णन पहिया पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के बाद, पेप्टाइड्स और पैन आर-मिथाइल एंटीबॉडी संयुग्मित मोतियों वाले 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों को 30 सेकंड के लिए 2,000 जी पर सेंट्रीफ्यूज करें ताकि मोतियों को पेलेट किया जा सके और प्रत्येक अंश से प्रवाह को एक साफ 1.5 मिलीलीटर कम बाध्यकारी ट्यूब में स्थानांतरित किया जा सके। आर-मोनो मिथाइलेशन के खिलाफ एंटीबॉडी के माध्यम से संयुग्मित प्रवाह में मोतियों को जोड़ें और पीबीएस में पुन: निलंबन दोहराएं, आईएपी बफर और सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ इनक्यूबेशन। मोनो-मिथाइलाइजेशन या एमएमए बीड्स के साथ पेप्टाइड नमूनों के इनक्यूबेशन के दौरान, उन अंशों को धोएं जो पहले एंटी-एडीएमए और एसडीएमए के साथ 250 माइक्रोलीटर आईएपी बफर के साथ इम्यूनोप्रेसिटेट थे और प्रत्येक धोने के बाद सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
फिर एलसी-एमएस ग्रेड के पानी से तीन बार धो लें। प्रत्येक ट्यूब में 0.15 टीएफए के 50 माइक्रोलीटर जोड़कर अगारोस मोतियों से एसडीएमए या एडीएमए पेप्टाइड्स को समृद्ध किया गया। इस घोल को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए छोड़ दें, ट्यूबों को हर दो से तीन मिनट में उलट दें।
पहले क्षालन को साफ 1.5 मिलीलीटर कम बाइंडिंग ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 0.15 टीएफए के 50 माइक्रोलीटर के साथ क्षालन को दोहराएं। दो क्षालन अंशों को एक ट्यूब में पूल करें। इस प्रक्रिया को आर-मोनो-मिथाइलेटेड पेप्टाइड्स के लिए दोहराएं जिन्हें एंटी-एमएमए एंटीबॉडी बीड्स के साथ इनक्यूबेट किया गया था।
हल्के और भारी लेबल वाली कोशिकाओं को मिलाने के बाद, प्रोटीन निकाला गया और ट्रिप्सिन और लिसारगीनेस द्वारा पाचन के अधीन किया गया। पेप्टाइड्स में कुल प्रोटीन के कुशल एंजाइमेटिक पाचन को सत्यापित करने के लिए एक एसडीएस-पेज कूमासी-सना हुआ जेल का उपयोग किया गया था। सी 18 सितंबर-पाक कॉलम द्वारा किए गए शुद्धिकरण चरण की दक्षता का मूल्यांकन किया गया था, जो सी 18 कॉलम के प्रवाह में पेप्टाइड्स की अनुपस्थिति की पुष्टि करता है और पहले और दूसरे धोने के साथ-साथ एलुएंट में उनकी अपेक्षित उपस्थिति की पुष्टि करता है।
भारी चैनल में उचित एमईटी 4 निगमन और सही भारी या हल्के मिश्रण का मूल्यांकन किया गया था। ऑफ़लाइन उच्च पीएच से क्रोमैटोग्राम पेप्टाइड्स के रिवर्स चरण तरल क्रोमैटोग्राफी फ्रैक्शनेशन और बाद में अंशों के गैर-सन्निहित संयोजन को यहां दिखाया गया है। पेप्टाइड्स का पता 250 नैनोमीटर यूवी द्वारा लगाया गया था, जबकि संभावित रूप से शेष बिना पचे प्रोटीन का मूल्यांकन 280 नैनोमीटर यूवी द्वारा किया गया था। सच्चे सकारात्मक मिथाइल पेप्टाइड एनोटेशन का प्रतिनिधित्व करने वाले पेप्टाइड्स के पूर्ण एमएस स्पेक्ट्रा प्राप्त किए गए थे।
तीन चोटियों के बीच देखे गए एम ओवर जेड अंतर एंजाइमेटिक रूप से मिथाइलेटेड अवशेषों की उपस्थिति के अनुरूप हैं। झूठे सकारात्मक मिथाइल पेप्टाइड एनोटेशन का प्रतिनिधित्व करने वाले पेप्टाइड्स का पूर्ण एमएस स्पेक्ट्रा प्राप्त किया गया था। हल्के मिथाइलेटेड पेप्टाइड और इसके दंडात्मक भारी समकक्ष के बीच देखा गया एम ओवर जेड अंतर 0.0312 द्वारा अपेक्षित मूल्य से विचलित होता है।
प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो समग्र रैखिक है, लेकिन कुछ चरण हैं जिन पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, आईपीएच क्रोमैटोग्राफी पृथक्करण गैर-सन्निहित अंश संयोजन के साथ-साथ आईपी सेटअप भी है। एक ही प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के गड़बड़ी के जवाब में आर्जिनिन मिथाइलेशन गतिशीलता को प्रोफाइल करने के लिए मानक एसआईएलएसी या लेबल-मुक्त परिमाणीकरण के साथ जोड़ा जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल कई सेल प्रकारों और मॉडल प्रणालियों में प्रोटीन मिथाइलेशन की सीमा और गतिशीलता के लक्षण वर्णन का मार्ग प्रशस्त करता है जो पीआरएमटी पर केंद्रित बुनियादी और ट्रांसलेशनल अनुसंधान के सभी पहलुओं का समर्थन करता है।
प्रोटीन आर्गिनिन (आर) -मिथाइलेशन एक व्यापक प्रसार पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जो कई जैविक मार्गों को विनियमित करता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री संशोधित पेप्टाइड संवर्धन के लिए जैव रासायनिक दृष्टिकोण के साथ युग्मित होने पर आर-मिथाइल-प्रोटिओम को विश्व स्तर पर प्रोफाइल करने के लिए सबसे अच्छी तकनीक है। मानव कोशिकाओं में वैश्विक आर-मिथाइलेशन की उच्च आत्मविश्वास पहचान के लिए डिज़ाइन किया गया वर्कफ़्लो यहां वर्णित है।
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