Die XChem-Anlage an der Diamond Light Source bietet ein routinemäßiges, großflächiges Kristall-Grafik-Fragment-Screening, das den gesamten Prozess der Kristallabscheidung unterstützt. Die Röntgenkristallographie ist ein wesentlicher Bestandteil des FBDD-Toolkits. Es ist empfindlich genug, um schwache Bindemittel zu identifizieren und liefert direkt strukturelle Informationen über die Wechselwirkungen auf molekularer Ebene.
Die fragmentbasierte Wirkstoffforschung ist eine weit verbreitete Strategie für die Entdeckung von Leitstrukturen. Das Unternehmen hat sechs Medikamente für den klinischen Einsatz geliefert und mehr als 50 Moleküle wurden in klinische Studien überführt. Die Auswirkungen der Fortschritte und der Effizienz, die die XChem-Plattform im Vergleich zu herkömmlichen Einweichmethoden, Datenerfassungs- und Analysemethoden bietet, lassen sich am besten visuell veranschaulichen.
Beginnen Sie mit der Auswahl der Kristalle und der Position der Verbindung. Öffnen Sie TextRank auf einem PC und wählen Sie das Kristallfach aus, entweder aus der Liste unten rechts oder indem Sie den Barcode in das Feld oben links eingeben. Wählen Sie das richtige Bildformat und die einzelne Well-Ansicht aus.
Um Lösungsmittel oder Verbindungen zu einem Tropfen hinzuzufügen, ohne den Kristall zu treffen, klicken Sie mit der rechten Maustaste innerhalb des Tropfens, aber weg vom Kristall, wenn ein geeigneter Kristall für ein Experiment gefunden wird, während Sie sich durch die Tropfenbilder bewegen. Öffnen Sie die Echo-Software und wählen Sie Neu aus, um Lösungen mit dem akustischen Spender zu dosieren. Wählen Sie die richtige Quellwellenplatte und die richtige Flüssigkeitsklasse.
Stellen Sie sicher, dass der richtige Plattentyp als Zielplatte ausgewählt ist. Aktivieren Sie dann das benutzerdefinierte Kontrollkästchen und fahren Sie fort. Wählen Sie Importieren aus, und wählen Sie die entsprechende Batchdatei aus.
Führen Sie dann die Importschritte aus, wie von der Software gefordert. Verwenden Sie die Plattenkarten, um die zu dosierende Lösung und die Bestimmungsorte zu überprüfen. Führen Sie dann das Protokoll aus, indem Sie den Eingabeaufforderungen folgen, sobald sie angezeigt werden.
Die Lösungen von der Ausgangsplatte werden in die ausgewählten Kristalltropfen abgegeben. Bewahren Sie die Platte für die erforderliche Zeit im Inkubator auf. Um die Kristalle mit dem halbautomatischen Kristallerntegerät zu ernten, drücken Sie die Schaltfläche "Arbeitsablauf starten", um zur ersten ausgewählten Well-Position zu gelangen.
Wenn der Kristall überlebt hat, montieren Sie ihn in der Schleife und tauchen Sie ihn in den flüssigen Stickstoff, um ihn auf Position eins im ersten Puck in der Liste zu platzieren. Wählen Sie in der Benutzeroberfläche die entsprechende Beschreibung für den Kristall aus. Wenn es sich bei dem Tropfen um ein zusammengesetztes Einweichen handelt, notieren Sie die Beschreibung des zusammengesetzten Zustands.
Wenn der Quarz erfolgreich gemountet wurde, wählen Sie mounted aus, andernfalls wählen Sie fail. Sobald die Kristalle geerntet sind, bringen Sie die Pucks zum Barcode-Scanner und legen Sie sie einzeln in den Halter, um den Puck zu scannen und die Barcodes anzuheften. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, legen Sie die Deckel auf die Pucks und lagern Sie sie in einem Flüssigstickstoff-Lagerdewar.
Um die falsch zentrierten Samples zu erfassen, sehen Sie sich die Sample-Wechsler-Ansicht in ISPyB an und wählen Sie Ranking by AP Resolution, um die Samples nach automatisch verarbeiteter Auflösung in einer Farbabstufung von Grün bis Rot zu bewerten. Klicken Sie auf die Proben, um zu prüfen, ob rote oder gelbe Proben vorhanden sind. Überprüfen Sie dann die Kristall-Schnappschüsse, um zu sehen, ob der Kristall zentriert wurde.
Um die Ergebnisse der automatischen Verarbeitung von Diamond über XChem Explorer oder XCE abzurufen und zu analysieren, gehen Sie in einem Terminal in den Unterordner processing und verwenden Sie den Alias XCE, um XChem Explorer zu öffnen. Wählen Sie auf der Registerkarte "Übersicht" die Schaltfläche "Tabellen aus Datenquelle aktualisieren" aus, um die Zusammenfassung der experimentellen Daten zu aktualisieren. Wählen Sie auf der Registerkarte "Einstellungen" das Datenerfassungsverzeichnis aus, und öffnen Sie die Registerkarte "Datasets".
Wählen Sie das Ziel aus dem Dropdown-Menü "Ziel auswählen" aus, wählen Sie im Dropdown-Menü "Datensätze" die Option "Neue Ergebnisse aus der automatischen Verarbeitung abrufen" aus und klicken Sie auf "Ausführen". Um die ersten Karten mit Dimple zu berechnen, öffnen Sie die Registerkarte Karten, wählen Sie das Referenzmodell aus dem Dropdown-Menü aus und wählen Sie die gewünschten Datensätze aus, gefolgt von der Ausführung von Dimple für ausgewählte MTZ-Dateien. Um Ligandenbeschränkungen zu generieren, wählen Sie die gewünschten Datensätze aus und erstellen Sie dann eine SCF-, PDB- oder PNG-Datei ausgewählter Verbindungen aus der Dropdown-Liste Karten und Beschränkungen.
Um Treffer mit Panda zu identifizieren, wählen Sie die Registerkarte Pandas, stellen Sie sicher, dass das Ausgabeverzeichnis korrekt definiert ist, und führen Sie panda aus. Analysieren Sie aus dem Dropdown-Menü zur Trefferidentifikation. Um die von Panda identifizierten Treffer zu analysieren, führen Sie panda aus.
Inspizieren aus dem Dropdown-Menü Trefferidentifikation. So öffnen Sie Blässhuhn mit dem Panda-Bedienfeld. Lastdurchschnitt und 2mFo-DFc-Karten von Dimple zum Vergleich mit der Ereigniskarte und dem Modell.
Sobald ein Ligand angepasst wurde, klicken Sie auf Ligand mit Modell zusammenführen und Modell speichern, bevor Sie zu einem anderen Ereignis navigieren, um zu vermeiden, dass Änderungen am gebundenen Zustandsmodell verloren gehen. Kommentieren Sie das Bindungsereignis mithilfe des Ereigniskommentarfelds, und kommentieren Sie die Bindungswebsites mithilfe von Datensatzwebsiteinformationen. Nachdem alle lebensfähigen Liganden modelliert, zusammengeführt und basierend auf der Ereigniskarte gespeichert wurden, schließen Sie panda.inspect.
Exportieren Sie die Panda-Inspektionsmodelle zurück in das Projektverzeichnis und starten Sie eine erste Runde der Verfeinerung für die ausgewählten Datensätze, und die Verfeinerung wird jetzt auf der Registerkarte Verfeinerung angezeigt. Die XChem-Pipeline für das Fragment-Screening durch Röntgenkristallographie wurde umfassend gestrafft, so dass sie von der wissenschaftlichen Gemeinschaft übernommen werden kann. Dieses Diagramm zeigt die Akzeptanz und Konsolidierung des Benutzerprogramms von 2015 bis 2019 mit der Schaffung von Blockzuweisungsgruppen im Jahr 2019 und die Widerstandsfähigkeit der Plattform während der COVID-19-Pandemie im Jahr 2020.
Erfolgreiche Kampagnen liefern eine dreidimensionale Karte potenzieller Interaktionsstellen auf dem Zielprotein. Ein typisches Ergebnis ist das XChem-Screening der Hauptprotease von SARS-CoV-2. Die bekannten Sites of Interest, wie z.B. Enzymaktivstellen und Subtaschen, sind gelb dargestellt.
Die mutmaßlichen allosterischen Stellen, wie sie an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind, sind in Magenta dargestellt, und Kristallpackungsgrenzflächen, die im Allgemeinen als falsch positiv angesehen werden, sind grün dargestellt. In der Vergangenheit war es schwierig, die Kristallographie als primäres Fragmentsieb zu verwenden. Diese Studie dokumentierte die XChem-Pipeline-Protokolle von der Probenvorbereitung bis zu den endgültigen Strukturen.
Das kristallographische Fragment-Screening ergänzt andere biophysikalische Techniken und ist in der Regel unerlässlich, um Fragmenttreffer zu Bleiverbindungen zu entwickeln. Es kann auf jede Zielklasse in der Wirkstoffforschung angewendet werden.
