XChem-anläggningen vid Diamond Light Source tillhandahåller rutinmässig, storskalig screening av kristallgrafiska fragment, som stöder hela kristall-till-deponeringsprocessen. Röntgenkristallografi är en viktig del av FBDD-verktygslådan. Den är tillräckligt känslig för att identifiera svaga bindemedel och ger direkt strukturell information om interaktionerna på molekylär nivå.
Fragmentbaserad läkemedelsupptäckt är en allmänt använd strategi för att upptäcka potentiella kunder. Företaget har levererat sex läkemedel för klinisk användning och mer än 50 molekyler har gått vidare till kliniska prövningar. Effekten av framsteg och effektivitet som tillhandahålls av XChem-plattformen jämfört med traditionella blötläggningsmetoder, datainsamlings- och analysmetoder demonstreras bäst visuellt.
Börja med att välja kristaller och föreningsplats. Öppna TextRank från en dator och välj kristallfacket, antingen från listan längst ner till höger eller genom att skriva streckkoden i rutan längst upp till vänster. Välj rätt bildformat och vyn med en enda brunn.
För att lägga till lösningsmedel eller föreningar till en droppe utan att träffa kristallen, högerklicka i droppen, men bort från kristallen när en lämplig kristall för ett experiment hittas när du rör dig genom droppbilderna. Öppna Echo-programvaran och välj ny för att dispensera lösningar med den akustiska dispensern. Välj rätt källbrunnsplatta och vätskeklass.
Se till att rätt plåttyp är vald som destinationsplatta. Markera sedan den anpassade rutan och fortsätt. Välj importera och välj relevant batchfil.
Slutför sedan importstegen som uppmanas av programvaran. Använd plattkartorna för att kontrollera lösningen som ska dispenseras och destinationsplatserna. Kör sedan protokollet genom att följa anvisningarna när de dyker upp.
Lösningarna från källplattan kommer att fördelas i de valda kristalldropparna. Förvara plattan i inkubatorn under önskad tid. För att skörda kristallerna med den halvautomatiska kristallskördsanordningen, tryck på startarbetsflödesknappen för att flytta till den första valda brunnspositionen.
Om kristallen har överlevt, montera den i öglan och doppa den i det flytande kvävet och placera den i position ett i den första pucken i listan. Välj lämplig beskrivning för kristallen från gränssnittet. Om droppen är en sammansatt blötläggning, anteckna beskrivningen av det sammansatta tillståndet.
Om kristallen har monterats framgångsrikt, välj monterad, annars väljer du misslyckas. När kristallerna har skördats, ta puckarna till streckkodsläsaren och placera dem i hållaren en i taget för att skanna pucken och nåla fast streckkoder. När skanningen är klar, placera locken på puckarna och förvara dem i en förvaringsanordning för flytande kväve.
Om du vill komma ihåg de felcentrerade proverna tittar du på provväxlarvyn i ISPyB och väljer rangordning efter AP-upplösning för att gradera proverna efter automatiskt bearbetad upplösning i en färggradering från grönt till rött. Klicka på proverna för att kontrollera om det finns några röda eller gula prover. Kontrollera sedan kristallögonblicksbilderna för att se om kristallen har centrerats.
För att hämta och analysera Diamonds automatiska bearbetningsresultat via XChem Explorer eller XCE, i en terminal, gå till undermappsbearbetningen och använd aliaset XCE för att öppna XChem Explorer. Välj knappen uppdatera tabeller från datakälla på översiktsfliken för att uppdatera sammanfattningen av experimentella data. Under fliken inställningar väljer du datainsamlingskatalogen och öppnar fliken datauppsättningar.
Välj målet från rullgardinsmenyn Välj mål, välj Hämta nya resultat från automatisk bearbetning från rullgardinsmenyn Datauppsättningar och klicka på Kör. Om du vill beräkna initiala kartor med Dimple öppnar du fliken kartor, väljer referensmodellen i listrutan och väljer önskade datauppsättningar följt av kör Dimple på valda MTZ-filer. För att generera ligandbegränsningar, välj önskade datauppsättningar följt av skapa SCF- eller PDB- eller PNG-fil med valda föreningar från listrutan kartor och begränsningar.
Om du vill identifiera träffar med Panda väljer du fliken Pandas, ser till att utdatakatalogen är korrekt definierad och kör panda. Analysera från rullgardinsmenyn Träffidentifiering. Om du vill analysera träffar som identifieras av Panda kör du panda.
Inspektera från rullgardinsmenyn Träffidentifiering. För att öppna Coot med Pandas kontrollpanel. Belastningsmedelvärde och 2mFo-DFc-kartor från Dimple för jämförelse med händelsekartan och modellen.
När en ligand har monterats klickar du på sammanfoga ligand med modell och spara modell innan du navigerar till en annan händelse för att undvika att förlora ändringar i den bundna tillståndsmodellen. Kommentera bindningshändelsen med hjälp av händelsekommentarfältet och kommentera bindningsplatserna med hjälp av postwebbplatsinformation. När alla livskraftiga ligander har modellerats, sammanslagits och sparats baserat på händelsekartan, stäng panda.inspect.
Exportera Pandas inspektionsmodeller tillbaka till projektkatalogen och starta en första omgång av förfining för de valda datauppsättningarna, så kommer förfiningen nu att synas på förfiningsfliken. XChems pipeline för fragmentscreening med röntgenkristallografi har effektiviserats i stor utsträckning, vilket har gjort det möjligt för det vetenskapliga samfundet att ta upp den. Det här diagrammet visar användningen och konsolideringen av användarprogrammet från 2015 till 2019 med skapandet av blockallokeringsgrupper 2019 och plattformens motståndskraft under covid-19-pandemin 2020.
Framgångsrika kampanjer ger en tredimensionell karta över potentiella interaktionsställen på målproteinet. Ett typiskt resultat är XChem-skärmen av huvudproteaset till SARS-CoV-2. De kända platserna av intresse, t.ex. enzymaktiva platser och subfickor, visas i gult.
De förmodade allosteriska platserna, såsom de som är involverade i protein-proteininteraktioner, visas i magenta och kristallpackningsgränssnitt, som vanligtvis anses vara falskt positiva, visas i grönt. Historiskt sett har det varit svårt att använda kristallografi som primär fragmentskärm. Denna studie dokumenterade XChems rörledningsprotokoll från provberedning till de slutliga strukturerna.
Kristallografisk fragmentscreening kompletterar andra biofysiska tekniker och är vanligtvis avgörande för att progression av fragmentträffar till ledande föreningar. Det kan tillämpas på alla målklasser för läkemedelsupptäckt.