Name: zebrafish model of neuroblastoma metastasis
Uploaded: 2021-03-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01 CA240323 (S.Z. ) מהמכון הלאומי לסרטן; מענק W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) ממשרד ההגנה של ארצות הברית (DoD); פרס V Scholar מטעם קרן V לחקר הסרטן (S.Z.) ומענק פלטפורמה ממרכז מאיו לגילוי ביו-רפואי (S.Z.); ותומכים ממרכז מאיו קליניק לסרטן והמרכז לרפואה אישית (ש.ז.).

כל שיטות המחקר באמצעות דגי זברה וטיפול בבעלי חיים / תחזוקה בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות במרפאת מאיו.
1. הכנה ומיקרו-הפעלה של מבני טרנסג'ן לפיתוח קו דגי זברה מהונדסים LMO1 עם ביטוי יתר ב- PSNS
<ol><li>כדי לפתח את שיבוט הכניסה LMO1-pDONR221 , הגבר את אזור הקידוד של LMO1 האנושי מ- cD...

<ol>
	<li>Veldman, M., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research.">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).</li><li>Feitsma, H., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+cancer+model.">Zebrafish as a cancer model.</a> Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).</li><li>Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer.">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).</li><li>Benjamin, D. C., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastasis+in+adult+Zebrafish.">Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish.</a> BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).</li><li>Kim, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-derived+factors+driving+metastatic+plasticity+in+melanoma.">Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma.</a> Nature Communications. 8, 14343 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ALK+collaborates+with+MYCN+in+neuroblastoma+pathogenesis.">Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li><li>Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).</li><li>Park, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Children's+oncology+group's+2013+blueprint+for+research:+neuroblastoma.">Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma.</a> Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).</li><li>Hoehner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+model+of+neuroblastoma:+differentiating+stroma-poor+tumors'+progress+along+an+extra-adrenal+chromaffin+lineage.">A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).</li><li>Tsubota, S., Kadomatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+initiation+mechanisms+of+neuroblastoma.">Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).</li><li>Tolbert, V. P., Matthay, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma:+Clinical+and+biological+approach+to+risk+stratification+and+treatment.">Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).</li><li>Maris, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+neuroblastoma.">Recent advances in neuroblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMO1+Synergizes+with+MYCN+to+promote+neuroblastoma+initiation+and+metastasis.">LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis.</a> Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).</li><li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+zebrafish.">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Tao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28B+regulates+transcription+and+potentiates+MYCN-induced+neuroblastoma+through+binding+to+ZNF143+at+target+gene+promotors.">LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).</li><li>Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+zebrafish+transgenesis+for+functional+genomic+analysis+of+candidate+cooperative+genes+in+tumor+pathogenesis.">Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+GAB2+in+neuroblastoma+pathogenesis+through+the+promotion+of+SHP2/MYCN+cooperation.">Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation.</a> Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).</li><li>Zimmerman, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+drives+a+subset+of+high-risk+pediatric+neuroblastomas+and+is+activated+through+mechanisms+including+enhancer+hijacking+and+focal+enhancer+amplification.">MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification.</a> Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).</li><li>Koach, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+MYCN+oncogenic+signaling+through+the+MYCN-PA2G4+binding+interface.">Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface.</a> Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>DuBois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+sites+in+stage+IV+and+IVS+neuroblastoma+correlate+with+age,+tumor+biology,+and+survival.">Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival.</a> Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).</li><li>Wattrus, S. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+safe+harbor:+The+hematopoietic+stem+cell+niche+in+zebrafish.">Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish.</a> Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).</li><li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish.">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+Zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li><li>Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+staining+of+collagens+type+I,+II+and+III+by+Sirius+Red+and+polarization+microscopy.">Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy.</a> Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).</li><li>Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirius+red+F3BA+as+a+stain+for+connective+tissue.">Sirius red F3BA as a stain for connective tissue.</a> Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).</li><li>Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cancer+in+zebrafish.">In vivo imaging of cancer in zebrafish.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).</li><li>Howe, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy.">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).</li><li>Yoganantharjah, P., Gibert, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+the+zebrafish+model+to+aid+in+drug+discovery+and+target+validation.">The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).</li><li>Ignatius, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tumor-propagating+cells,+regional+tumor+heterogeneity,+and+dynamic+cell+movements+in+embryonal+rhabdomyosarcoma.">In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).</li><li>Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+the+dynamic+tumor+cell+vascular+interface+in+transparent+zebrafish.">High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).</li><li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+with+orbital+metastasis:+ophthalmic+presentation+and+role+of+ophthalmologists.">Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists.</a> Eye. 20 (4), 466-470 (2006).</li><li>Papaioannou, G., McHugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+in+childhood:+review+and+radiological+findings.">Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings.</a> Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Amores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+hox+clusters+and+vertebrate+genome+evolution.">Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution.</a> Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).</li><li>Postlethwait, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+genome+evolution+and+the+zebrafish+gene+map.">Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map.</a> Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).</li><li>Opazo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+duplication+and+the+functional+diversification+of+teleost+fish+hemoglobins.">Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).</li></ol>

דגי זברה משמשים בדרך כלל במחקר בעשורים האחרונים, במיוחד בחקר הסרטן, מסיבות ברורות, כגון קלות התחזוקה שלו, רבייה חזקה, ויתרונות ברורים להדמיית vivo1,28. מודל דגי הזברה יכול להיות מניפולציה בקלות עוברית בשל ההפריה החיצונית שלהם והתפתחות, אשר משלים היטב אורגנ...

דגי זברה כבר בשימוש נרחב ויושם על מספר תחומי מחקר, במיוחד בסרטן. מודל זה מספק יתרונות רבים - כגון הרבייה החזקה שלו, תחזוקה חסכונית, והדמיה רב-תכליתית של גידול גידול וגרורות - כל אלה הופכים את דגי הזברה לכלי רב עוצמה לחקור ולחקור את הבסיסים התאיים והמולקולריים של גידולים וגרורות. טכניקות חדשות למיפוי גנום בקנה מידה גדול, טרנסגנזה, ביטוי יתר של גנים או נוקאאוט, השתלת תאים ומסכים כימיים הגדילו מאוד את כוחו של דג הזברה מודל1. במהלך השנים האחרונות, קווי דגי זברה רבים פותחו כדי לחקור גידולים וגרורות של מגוון סוגי סרטן אנושיים, כולל אך לא מוגבל ללוקמיה, מלנומה, rhabdomyosarcoma, קרצינומה hepatocellular2,3,4,5. בנוסף, מודל דג הזברה הראשון של נוירובלסטומה (NB) נוצר על ידי ביטוי יתר MYCN, אונקוגן, במערכת העצבים הסימפתטית ההיקפית (PSNS) תחת שליטה של מקדם דופמין-בטא-הידרוקסילאז (dβh). עם מודל זה, הוכח עוד כי ALK מופעל יכול להתמזג עם MYCN כדי להאיץ את הופעת הגידול ולהגדיל את החדירות הגידול ב vivo6.
NB נגזר מן השושלת הסימפתודואדרנלית של תאי הסמל העצבי, והוא סרטן גרורתי מאוד אצל ילדים7. הוא אחראי ל -10% ממקרי המוות הקשורים לסרטן ילדים8. גרורות נרחבות באבחון, NB יכול להיות מוצג קלינית כגידולים שמקורם בעיקר לאורך השרשרת של הגרעינים האוהדים ואת המדולה יותרת הכליה של PSNS9,10. הגברה MYCN קשורה בדרך כלל עם תוצאות גרועות בחולי NB11,12. יתר על כן, LMO1 זוהה כגן רגישות NB קריטי במקרים בסיכון גבוה13,14. מחקרים מצאו כי דו-אופן הפעולה מהונדס של MYCN ו- LMO1 ב- PSNS של מודל דגי הזברה לא רק מקדם התחלה מוקדמת יותר של NB, אלא גם גורם גרורות נרחבות לרקמות ולאיברים הדומים לאתרים הנפוצים בחולים עם NB13 בסיכון גבוה. לאחרונה, פנוטיפ גרורתי נוסף של NB נצפתה גם במודל חדש יותר של דגי זברה של NB, שבו הן MYCN ו- Lin28B, קידוד חלבון מחייב RNA, מתבטאים יתר על המידה תחת שליטה של מקדם dβh16.
הגישה הטרנסגנית היציבה בדגי זברה משמשת לעתים קרובות כדי לחקור אם ביטוי יתר של גן עניין יכול לתרום להתפתחות נורמלית ומחלות pathogenesis14,15. טכניקה זו שימשה בהצלחה כדי להדגים את החשיבות של גנים מרובים ומסלולים לגידול NB6,16,17,18,19,20. מאמר זה יציג כיצד קו הדגים הטרנסגני שמבטא יתר על המידה הן את MYCN והן את LMO1 ב- PSNS נוצר וכיצד הוכח כי שיתוף הפעולה של שני האונקוגנים האלה מאיץ את הופעת הגידול של NB וגרורות13. ראשית, הקו הטרנסגני המבטא יתר על המידה EGFP-MYCN תחת שליטה של מקדם dβh (קו MYCN ייעודי) פותח על ידי הזרקת dβh-EGFP-MYCN לבנות לשלב תא אחד של עוברי AB מסוג בר (WT), כפי שתואר בעבר 6,17. קו מהונדסי נפרד המבטא יתר על המידה את LMO1 ב- PSNS (קו LMO1 ייעודי) פותח על ידי חפיפה בין שני מבני DNA, dβh-LMO1 ו- dβh-mCherry, לעוברי WT בשלב תא אחד13. בעבר הוכח כי ניתן לחפוף למבני דנ"א כפולים חופפים לגנום הדגים; לכן, LMO1 ו mCherry הם coexpressed בתאי PSNS של בעלי חיים מהונדסים. ברגע שהעוברים המוזרקים F0 הגיעו לבגרות מינית, הם אז היו מחוץ לחצות עם דגי WT לזיהוי של דגים חיוביים עם שילוב של טרנסג'נים. בקצרה, צאצאי F1 נבדקו לראשונה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לביטוי mCherry בתאי PSNS. שילוב נבטים של LMO1 בדגים mCherry-חיובי אושרה עוד יותר על ידי PCR גנומי ורצף. לאחר זיהוי מוצלח של כל קו מהונדס, הצאצאים של דג הטרוזיגוס MYCN ו- LMO1 מהונדסים היו שזורים כדי ליצור קו דגים מורכב המבטא הן את MYCN והן את LMO1 (המכונה MYCN; קו LMO1). MYCN נושא גידול; דגי LMO1 היו במעקב על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית דו-שבועית לראיות לגידולים גרורתיים באזורים המרוחקים לאתר הראשי, אזור בלוטת יותרת הכליה הבין-יותרת הכליה (IRG, שווה ערך לדגי זברה של בלוטת יותרת הכליה האנושית)13. כדי לאשר את גרורות של גידולים MYCN; דגי LMO1, ניתוחים היסטולוגיים ואימונוהיסטוכימיים יושמו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#8217;-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific / Acros Organic</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose GP2</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>009012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P40101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Intense R Detection</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DS9263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND primary antibody diluent</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND-MAX IHC instrument</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fully automated IHC staining system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH211-270H11 BAC clone</td>
			<td>BACPAC resources center (BRFC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope equipped with DP71 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8312-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801601</td>
			<td>ready-to-use (no preparation needed)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>86-1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand Long Template PCR System</td>
			<td>Roche Applied Science, IN</td>
			<td>11681834001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11789-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11791-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>E0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Harris Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>HHS-32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Avidin D</td>
			<td>Vector</td>
			<td>A-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Aqua Solutions</td>
			<td>4360-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>R0694L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Teknova, Inc.</td>
			<td>K2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>554-13-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome for sectioning</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Chemically Competent&#160;E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p3E-polyA</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift 
			(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin wax</td>
			<td>Surgipath Paraplast</td>
			<td>39603002</td>
			<td>Parrafin to parafin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)</td>
			<td>Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONR 221 gateway donor vector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12536-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONRP4-P1R donor vector</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red, 0.5%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirrius red stain kit</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24901-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pME-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26028</td>
			<td>(DBH construct)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>21712520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDO Rapid Decalcifier</td>
			<td>Apex Enginerring</td>
			<td>RDO04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP&#174;&#160;6 AI Vacuum Infiltration Processor</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model #: VIP-6-A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical Incorporated</td>
			<td>20513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish model of neuroblastoma metastasis

דגי זברה התפתחו כמודל חשוב לבעלי חיים לחקר מחלות אנושיות, במיוחד סרטן. יחד עם טכנולוגיות עריכת הטרנסגניות והגנום החזקות המיושמות במודלים של דגי זברה, קלות התחזוקה, הפרודוקטיביות בתפוקה גבוהה והדמיה חיה רבת עוצמה הופכים את דג הזברה למערכת מודל בעלת ערך לחקר גרורות ובסיסים תאיים ומולקולריים העומדים בבסיס תהליך זה ב- vivo. הדגם הראשון של דגי זברה נוירובלסטומה (NB) של גרורות פותח על ידי ביטוי יתר של שני אונקוגנים, MYCN ו - LMO1, תחת שליטה של מקדם הדופמין-בטא-הידרוקסילאז (dβh). MYCN ו- LMO1 המחושבים יתר על המידה הובילו להשהיה מופחתת ולחדירה מוגברת של נוירובלסטומגנסיס, כמו גם גרורות רחוקות מואצות של תאים סרטניים. מודל חדש זה חוזר על תכונות מרכזיות רבות של NB גרורתי אנושי, כולל מעורבות של שינויים גנטיים רלוונטיים מבחינה קלינית וגרורות; התפתחות טבעית וספונטנית של גרורות ב vivo; ואתרים שמורים של גרורות. לכן, למודל דגי הזברה יש יתרונות ייחודיים לנתח את התהליך המורכב של גרורות הגידול ב- vivo.

כדי לקבוע אם LMO1 מתמזג עם MYCN כדי להשפיע על פתוגנזה NB, מבנים מהונדסים המניעים ביטוי של LMO1 (dβh:LMO1 ו dβh:mCherry) או MYCN (dβh:EGFP-MYCN) בתאי PSNS בשליטה של מקדם dβh הוזרקו לעוברים של דגי זברה13. כפי שמודגם באיור 1A, לאחר פיתוח קווים מהונדסים יצי?...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis at JoVE.com

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

מאמר זה מציג את השיטה של פיתוח, אפיון ומעקב בזמן אמת של גרורות הגידול במודל דגי הזברה של נוירובלסטומה, במיוחד בקו דגי הזברה הטרנסגניים עם ביטוי יתר של MYCN ו- LMO1, המפתח גרורות באופן ספונטני.

מודל דגי זברה של גרורות נוירובלסטומה

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

שיטות אלה שימשו לפיתוח מודל דג הזברה הראשון של גרורות נוירובלסטומה. וכדי להוכיח כי מודל זה יכול לשחזר בנאמנות תכונות רבות של גרורות לראות בחולים עם סיכון גבוה של נוירובלסטומה. היתרון העיקרי של מודל דגי זברה גרורתי זה הוא הדמיית vivo בזמן אמת של הפצת הגידול כדי להבין טוב יותר מתי, ואולי איך גרורות מתרחשות.טכניקה זו אינה ספציפית לנוירובלסטומה. זה יכול להיות מיושם על מודלים של דגי זברה של סוגים שונים של סרטן כל עוד התאים הגידוליים ניתן לזהות ולעקוב אחר המוביל למגוון של אפשרויות. בתור התחלה, לפתח קו דגים מהונדס הטרוזיגוסי שמבטא יתר על המידה הן את MYCN והן את LMO1 על ידי הכלאת קווים מהונדסים MYCN ו- LMO1.ביום אחד לאחר ההפריה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופי כדי למיין את הצאצא של outcross עבור ביטוי EGFP, אשר מציג כנקודות חיוביות EGFP. לאחר המיון, בודדו עוברים מוקרנים לתוך מנות פטרי נפרדות ותייגו מנות כחיוביות MYCN או MYCN שליליות. דמיין ומיין עוברים של שתי הקבוצות עבור ביטוי LMO1 שלושה עד ארבעה ימים לאחר ההפריה.חפש כתמי פלואורסצנטיות אדומים הן בגנגליון צוואר הרחם העליון והן בתאים העצביים הדופאמין שאינם PSNS במיוחד במדולה אובלונגטה של המוח האחורי. בצע את ההקרנה לפני העוברים להגיע חמישה ימים לאחר ההפריה. לאחר מכן בודדו דגים ממוינים לארבע קבוצות של גנוטיפים שונים ותייגו כ-MYCN בלבד, LMO1 בלבד, MYCN ו-LMO1 הן וסוג הבר.לגדל אותם בתנאים זהים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. דמיינו גידולים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופי על ידי היפוך עדין של דגים עם מרית מתכת משני הצדדים לרוחב כדי להציג את הגידול. לאחר זיהוי הדגים הנושאים גידול אפשרי, בודדו אותם למיכל נפרד עם תוויות מתאימות הכוללות את תאריך הלידה, תאריך הקרנת הגידול וגנוטיפ.שישה שבועות לאחר ההפריה, חזור על שלבים קודמים כדי לסנן דגים נושאי גידולים ודגים שאינם נושאי גידולים כדי לאשר את נוכחותם של גידולים עבור דגים שעברו סינון בעבר או לזהות דגים חדשים הנושאים גידולים אפשריים. חפשו את הגודל המתמשך או המוגדל של המסה החיובית הפלואורסצנטית והדגים הנושאים גידולים מאושרים. לאחר זיהוי דגים נושאי גידול, לעקוב אחריהם דו-שבועי לראיות של נדידת תאים סרטניים, אשר מציג כמו EGFP זעיר או mCherry גושי גידול חיוביים רחוק מהאתר העיקרי של תחילת הגידול.לבודד את הדגים האלה לתוך טנקים נפרדים לפי הצורך ולתייג כראוי כדי להצביע על גרורות אפשריות. לאחר פרשנות MYCN ההטרוזיגוס בדגי LMO1, ותוך כדי מיון הצאצאים שלהם, ביטוי MYCN EGFP היה בולט בתאים העצביים הדופאמין שאינם PSNS ביום אחד לאחר ההפריה. לעומת זאת, הביטוי LMO1 היה בולט הן בתאי PSNS והן בתאים עצביים דופאמין שאינם PSNS.גושי גידול חיוביים פלואורסצנטיים התגלו ברקמות באיברים, הרחק מאתר הגידול העיקרי בדגים מהונדסים מורכבים עם ביטוי יתר של MYCN ו- LMO1, אך לא בדגים מהונדסים עם הביטוי של MYCN בלבד. כתמי H&E של החלקים הכירורגיים מראים כי הגידול העיקרי נבע מאזור בלוטת יותרת הכליה הבין-יותרת הכליה, המקבילה של דגי הזברה של בלוטת יותרת הכליה האנושית שהיא האתר הנפוץ ביותר של המחלה העיקרית בחולה נוירובלסטומה. גושי גידולים רחוקים מבלוטת יותרת הכליה התגלו באזורים רבים, כולל החלק הדיסטלי של הכליה, המסלול, הזימים, הטחול והקיר הפנימי של תא הפרוזדורים של הלב.שושלת נוירובלסט PSNS של תאים סרטניים בגידול העיקרי וכל האתרים גרורתיים אושרה. כמויות מוגברות באופן משמעותי ועובי מוגבר של סיבי קולגן מוכתמים PSR נמצאו גידולים MYCN LMO1 בהשוואה לגידולים המבטאים MYCN לבד. לאחר שימוש בהליך זה, ניתן ליישם סינון תרופות ובדיקת טיפולים חדשניים בסרטן, אשר עלול להוביל להתפתחות של סוכנים חלופיים כדי למנוע ולטפל בסרטן גרורתי.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine ניסיוני דגם של התפתחות גידולים מקורית גרור הצפק<em&gt; דרך</em&gt; Orthotopic הרכבה עם קרצינומה של תאי השחלות

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In vivo מודל השפעת בדיקה של היפוקסיה על גרורות של גידולים

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל Murlin פרה קלינית של<em&gt; דה נובו</em&gt; גרורות סרטן החלב

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

שימוש בניתוח תמונה מבוסס מחשב כדי לשפר את כימות גרורות הריאות במודל סרטן השד 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

מודל עכברוש אוסטאוסרקומה סנגנית אורתוטופית עם קטיעה כדי לשלוט בקצב גרורות

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...