इस प्रक्रिया का लक्ष्य कोशिकाओं में प्रोटीन आर्जिनिन मिथाइलट्रांसफेरेज परिवार के व्यक्तिगत सदस्यों की एंजाइमेटिक गतिविधि को मापना है। गतिविधि मात्रात्मक फ्लोरोसेंट पश्चिमी दाग का उपयोग कर उनके arginine मिथाइलेशन स्तर और जैव मार्कर प्रोटीन के कुल स्तर का निर्धारण करके मापा जाता है । वर्णित विधि का लाभ सेल संस्कृति और फ्लोरोसेंट पश्चिमी दाग क्षमताओं के साथ किसी भी प्रयोगशाला में सीधा प्रदर्शन है।
लेख में जैव-मार्कर, एंटीबॉडी और अवरोधक दो यौगिकों के बारे में विस्तृत दिशा-निर्देश प्रदान किए गए हैं । और यहां हमने प्रायोगिक प्रक्रिया में शामिल महत्वपूर्ण कदमों का वर्णन किया । और प्रक्रिया 24 अच्छी तरह से प्रारूप के लिए दिखाया गया है।
सबसे पहले, लाइसिस बफर तैयार करें, उपयोग से पहले बेंजोनास और प्रोटीन अवरोधक कॉकटेल को ताजा जोड़ें। सभी मीडिया को कुओं से हटा दें। 100 माइक्रोलीटर पीबीएस के साथ धोएं, और अच्छी तरह से लाइसिस बफर के 60 माइक्रोलीटर जोड़ें।
कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए इनक्यूबेट, प्लेटों कमाल कोशिकाओं पर लाइसिस बफर वितरित करने के लिए । फिर 1% एकाग्रता खोजने के लिए 20% एसडीएस के तीन माइक्रोलीटर जोड़ें और कोमल मिलाते हुए मिश्रण करें। एपेंडोर्फ ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे बर्फ पर रखें।
बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग करके अपने नमूनों की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें, या किसी अन्य तरीकों का उपयोग करें जो समाधान में 1% एसडीएस को सहन करता है। लाइसिस बफर के साथ प्रोटीन एकाग्रता को समायोजित करने के बाद चार बार लोडिंग बफर के 20 माइक्रोलीटर पर नमूनों में बराबर होने के बाद सेल लाइसेट के ६० माइक्रोलीटर, और पांच मिनट के लिए ९५ डिग्री पर गर्मी । लाइसिस बफर के लिए बेंजोनेज का जोड़ तेजी से हाइड्रोलाइज न्यूक्लिक एसिड, जो कोशिका lysate चिपचिपाहट को कम करता है।
बेंजोनेज के साथ Lysates चिपचिपा नहीं हैं। बेंजोनाज़ के बिना Lysates में गूय डीएनए का एक बड़ा ग्लोब होता है जो घूमती होने पर गोली नहीं चलेगा। हिस्टोन प्रोटीन के लिए कुल सेल लिसेट के पांच से 20 माइक्रोग्राम तक लोड करें, और एक ढाल चार से 12 बीआईएस-ट्राइस प्रोटीन जेल में अन्य प्रोटीन के लिए 20 से 100 माइक्रोग्राम।
100 वोल्ट पर लगभग दो घंटे के लिए आसपास के बफर के रूप में mops में जेली के आसपास, या जब तक नीले लोडिंग डाई जेल के नीचे तक पहुंचता है। यदि आप गीला स्थानांतरण करते हैं, तो बर्फ की ठंडे ट्राइस-ग्लाइसिन ट्रांसफर बफर में ट्रांसफर सैंडविच को इकट्ठा करें। 30 सेकंड पूर्व विधानसभा के लिए स्थानांतरण बफर में मेथनॉल और समानाखिख जेल में भिगोकर पीवीडीएफ झिल्ली को सक्रिय करें।
निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्पंज फिल्टर पेपर, पीवीडीएफ झिल्ली और जेल रखें। बर्फ पर एक से डेढ़ घंटे के लिए 70 वोल्ट पर ट्राइस-ग्लाइसिन ट्रांसफर बफर में प्रोटीन ट्रांसफर करें। स्थानांतरण के बाद, बफर को अवरुद्ध करने में झिल्ली को 30 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
वॉश बफर के साथ कुल्ला, और चार डिग्री पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट। अगले दिन, वॉश बफर के साथ पांच मिनट के लिए झिल्ली को तीन बार धोएं, फ्लोरोसेंटली के साथ इनक्यूबेट करें कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी लेबल, और वॉश बफर के साथ पांच मिनट के लिए तीन बार धोएं। झिल्ली चेहरे को फ्लोरोसेंट वेस्टर्न ब्लॉट इमेजर की ग्लास प्लेट पर नीचे रखें।
रबर शीट के साथ कवर और किसी भी हवा बुलबुले को दूर। 700 और 800 नैनोमीटर पर सिग्नल पढ़ें। एक बार स्कैन हो जाने के बाद, बैंड को स्पष्ट रूप से देखने के लिए छवि पर जाएं और 700 और 800 चैनल सिग्नल को समायोजित करें।
यहां लाल रंग के रूप में दिखाए गए 700 चैनल सिग्नल कुल प्रोटीन के स्तर का प्रतिनिधित्व करता है, और हरे रंग के रूप में दिखाए गए 800 चैनल सिग्नल मिथाइलेटेड प्रोटीन के स्तर का प्रतिनिधित्व करता है। इसके बाद, विश्लेषण पर जाएं और औसत शीर्ष और नीचे पढ़ने का चयन करें। बैंड की तीव्रता को मापने के लिए, आकर्षित आयत उपकरण का चयन करें और बैंड आप मात्रा निर्धारित करना चाहते हैं चारों ओर आकार आकर्षित।
उन आकृतियों पर जाएं जहां आपको 700 और 800 चैनलों की तीव्रता मिलती है। सिग्नल नामक कॉलम पृष्ठभूमि घटाया के साथ तीव्रता का स्तर प्रदान करता है। परिणामों को सीधे एक्सेल फाइल में कॉपी किया जा सकता है।
यहां PRMT प्रकार एक अवरोधक MS023 के साथ अवरोध पर कोशिकाओं में PRMT1 गतिविधि के विश्लेषण दिखा उदाहरण है । PRMT1 गतिविधि हिस्टोन H4 arginine 3 असममित डाइमिथाइलेशन स्तर का निर्धारण करके मापा जाता है। यहां, मिथाइलेशन का स्तर, हरे रंग के बैंड एक खुराक निर्भर तरीके से नीचे जाते हैं, जबकि कुल हिस्टोन स्तर लाल बैंड अपरिवर्तित रहते हैं।
यौगिक IC50 निर्धारित करने के लिए, हिस्टोन एच 4 आर्जिनिन-3 असममित डिमिथाइलेशन स्तरों के खिलाफ अवरोधक एकाग्रता के लॉगरिथम को गैर-रैखिक फिट विश्लेषण के बाद कुल हिस्टोन स्तरों को सामान्यीकृत करने की साजिश करें। वर्णित विधि कोशिकाओं में प्रोटीन मिथाइलट्रांसफेरेज की गतिविधि का उत्तरदायी और प्रजनन योग्य डबल डिटेक्शन के लिए अनुमति देती है। विधि का लाभ यह है कि यह अच्छी तरह से ज्ञात पश्चिमी ब्लॉटिंग पद्धति का उपयोग करता है जो अकादमिक प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है और प्रयोगशाला उपकरणों के आधार पर आसानी से संशोधित किया जा सकता है।
प्रत्येक व्यक्ति पीआरएमटी परिवार के सदस्य के लिए जैव मार्कर प्रोटीन, एंटीबॉडी और रासायनिक दो यौगिकों सहित परख विवरण लेख में प्रदान की जाती हैं ।