O objetivo deste procedimento é medir a atividade enzimática de membros individuais da família Methyltransferase de Proteína Arginina em células. A atividade é medida pela determinação de seus níveis de metilação de arginina e níveis totais de proteína bio-marcador usando manchas ocidentais fluorescentes quantitativas. A vantagem do método descrito é o desempenho simples em qualquer laboratório com cultura celular e capacidades fluorescentes de manchas ocidentais.
As diretrizes detalhadas relativas aos biomarcadores, anticorpos e inibidores de dois compostos estão previstas no artigo. E aqui descrevemos etapas cruciais envolvidas no procedimento experimental. E o procedimento é mostrado para 24 bem formato.
Primeiro, prepare o tampão de lise, adicione benzonase e coquetel inibidor de proteínas fresco antes do uso. Remova todas as mídias dos poços. Lave com 100 PBS de microliter e adicione 60 microliters de tampão de lise ao poço.
Incubar por um minuto em temperatura ambiente, balançando as placas para distribuir o tampão de lise sobre as células. Em seguida, adicione três microliters de 20% SDS para encontrar uma concentração de 1% e misturar por agitação suave. Transfira lysate para tubos Eppendorf e mantenha-o no gelo.
Determine a concentração proteica de suas amostras usando o kit de ensaio de proteína BCA, ou use quaisquer outros métodos que tolerem 1%SDS na solução. Depois de ajustar a concentração proteica com tampão de lise para ser igual entre as amostras em 20 microliters de quatro vezes tampão de carregamento para 60 microliters de lise celular, e calor a 95 graus por cinco minutos. A adição de benzonase ao tampão de lise hidrólise rapidamente hidriza ácidos nucleicos, que reduzem a viscosidade lisácia celular.
Os lysates com benzonase não são viscosos. Lysates sem benzonase têm uma grande glob de DNA pegajoso que não vai pelotas quando girado. Carga de cinco a 20 microgramas de liseto celular total para proteínas de histona, e 20 a 100 microgramas para outras proteínas em um gradiente de quatro a 12 bis-tris gel de proteína.
Ao redor da geleia em esfregões como o tampão circundante por cerca de duas horas a 100 volts, ou até que o corante azul de carga atinja a parte inferior do gel. Se você realizar uma transferência molhada, monte o sanduíche de transferência no tampão de transferência de tris-glicina gelada. Ative a membrana PVDF de molho em metanol e gel equilibrado no buffer de transferência por 30 segundos antes do conjunto.
Coloque papel filtro de esponjas, membrana PVDF e gel de acordo com as instruções do fabricante. Transfira proteínas em tampão de transferência de tris-glicina a 70 volts por uma a uma hora e meia no gelo. Após a transferência, incubar a membrana por 30 minutos no bloqueio do buffer.
Enxágüe com tampão de lavagem e incubar com anticorpos primários durante a noite a quatro graus. No dia seguinte, lave a membrana três vezes por cinco minutos com tampão de lavagem, incuba com anticorpos secundários fluorescentes rotulados por 30 minutos em temperatura ambiente e lave três vezes por cinco minutos com tampão de lavagem. Coloque a membrana de frente para baixo na placa de vidro do imager fluorescente da mancha ocidental.
Cubra com a folha de borracha e remova quaisquer bolhas de ar. Leia o sinal em 700 e 800 nanômetros. Uma vez feito o scan, vá para a imagem e ajuste o sinal de 700 e 800 canais para ver as bandas claramente.
Aqui o sinal de 700 canais mostrado como vermelho representa níveis totais de proteína, e 800 sinal de canal mostrado como verde representa os níveis de proteína metilada. Em seguida, vá para análise e selecione a leitura média superior e inferior. Para medir a intensidade das bandas, selecione desenhar a ferramenta retângulo e desenhe a forma ao redor das bandas que deseja quantificar.
Vá para formas onde você encontra intensidades de 700 e 800 canais. A coluna chamada sinal fornece níveis de intensidade com fundo subtraído. Os resultados podem ser copiados diretamente para o arquivo Excel.
Aqui está o exemplo mostrando a análise da atividade PRMT1 nas células após a inibição com o inibidor tipo 1 PRMT MS023. A atividade PRMT1 é medida pela determinação dos níveis de dimetilação assimétrica de histone H4 3. Aqui, os níveis de metilação, as bandas verdes descem de forma dependente de dose, enquanto as faixas vermelhas totais de histona permanecem inalteradas.
Para determinar os níveis compostos ic50, plote o logaritmo da concentração inibidora contra os níveis de dimetilação assimétrica histônio H4-3 normalizados para níveis totais de histona seguidos pela análise de ajuste não linear. O método descrito permite uma detecção dupla responsável e reprodutível da atividade da proteína metiltransferase nas células. A vantagem do método é que ele utiliza uma metodologia de manchas ocidentais bem conhecida que é acessível para laboratórios acadêmicos e pode ser facilmente modificada dependendo do equipamento de laboratório.
Os detalhes do ensaio, incluindo proteínas biomarcadores, anticorpos e dois compostos químicos para cada membro da família PRMT individual são fornecidos no artigo.
