Name: tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model
Uploaded: 2021-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

S.E.D cuenta con el apoyo de fondos iniciales proporcionados por el Departamento de Medicina Molecular de la Universidad del Sur de Florida, así como una subvención de investigación CFF (DARCH19G0), el N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) y el Instituto de Microbiomas de la USF. Agradecemos al laboratorio de Whiteley por la colaboración continua que involucra conjuntos de datos relacionados con este manuscrito. Agradecemos al Dr. Charles Szekeres por facilitar la clasificación de FACS. Las figuras fueron creadas por A.D.G y S.E.D utilizando Biorender.com.

1. Preparar un medio sintético de fibrosis quística (SCFM2)
NOTA: La preparación de SCFM2 comprende tres etapas principales que se describen a continuación(Figura 2). Para más detalles y referencias, véase9,10,12.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig02.jpg"> <strong cl...

<ol>
	<li>Ramsay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+prevalence+of+pulmonary+infection+in+with+fibrosis:+A+longitudinal+analysis.">The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).</li><li>Bessonova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from+the+US+and+UK+cystic+fibrosis+registries+support+disease+modification+by+CFTR+modulation+with+ivacaftor.">Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor.</a> Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).</li><li>Breuer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+prevalence+of+lower+airway+infections+in+young+children+with+cystic+fibrosis.">Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).</li><li>O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+the+treatment+of+patients+with+serious+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+infections.">Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections.</a> Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+determinants+of+quorum+signaling+in+a+Pseudomonas+aeruginosa+infection+model.">Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).</li><li>Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibiotic+tolerance+arising+from+antibiotic-triggered+accumulation+of+pyocyanin+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+to+antimicrobial+agents-how+P.+aeruginosa+can+escape+antibiotics.">Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).</li><li>Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genome+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis+sputum.">Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+inhibit+pathogen+dissemination+by+targeting+bacterial+migrants+in+a+chronic+infection+model.">Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model.</a> MBio. 8 (2), 00240 (2017).</li><li>Jorth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+isolation+drives+bacterial+diversification+within+cystic+fibrosis+lungs.">Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs.</a> Cell Host &amp; Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Davies, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+cell-to-cell+signals+in+the+development+of+a+bacterial+biofilm.">The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm.</a> Science. 280 (5361), 295-298 (1998).</li><li>Hartmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+microbial+communities+with+BiofilmQ.">Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ.</a> Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).</li><li>Stacy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+fight-and-flight+responses+enhance+virulence+in+a+polymicrobial+infection.">Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).</li></ol>

Este trabajo ha introducido metodologías que se pueden combinar para estudiar poblaciones agregadas bacterianas en presencia y ausencia de tratamiento antibiótico. El CLSM de alta resolución permite la visualización de los cambios en la biomasa agregada y la orientación estructural de los agregados en tiempo real cuando se exponen a antibióticos. Además, se pueden cuantificar las características físicas y estructurales de la biomasa que quedan después del tratamiento con antibióticos, con el objetivo de correl...

Pseudomonas aeruginosa (Pa) es un patógeno oportunista que establece infecciones crónicas en individuos inmunocomprometidos. Para aquellos con la enfermedad genética fibrosis quística (FQ), estas infecciones pueden abarcar el curso de toda la vida. La FQ causa la acumulación de un esputo viscoso y rico en nutrientes en las vías respiratorias, que se coloniza por una variedad de patógenos microbianos con el tiempo. Pa es uno de los patógenos de la FQ más prevalentes, colonizando las vías respiratorias en la primera infancia y estableciendo infecciones difíciles de tratar1. La PA sigue siendo un problema clínico significativo y se considera una de las principales causas de mortalidad en las personas con FQ, a pesar de la mejora de los regímenes terapéuticos en los últimos años2,3. Este fenotipo de persistencia y el aumento de la tolerancia a los antibióticos le han valido a Pa un lugar en un grupo de patógenos identificados tanto por los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) como por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como prioridades de investigación para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas: los patógenos ESKAPE4.
Al igual que otros patógenos ESKAPE, la resistencia a los antibióticos adquirida es común en Pa,pero también hay muchas propiedades intrínsecas que contribuyen a la tolerancia antimicrobiana de Pa. Entre estos se encuentra la capacidad de Pa para formar agregados, grupos altamente densos de ~ 10-1,000 células, que se pueden observar en múltiples infecciones, incluido el esputo del paciente con FQ5,6. Al igual que el Pa estudiado en otros sistemas de biopelículas, los agregados de Pa muestran fenotipos clínicamente relevantes, como el aumento de la resistencia a los antibióticos y la activación de la comunicación célula-célula (detección de quórum (QS)). Por ejemplo, se ha demostrado que los agregados de Pa utilizan comportamientos regulados por QS para combatir otros microbios, así como tolerar tratamientos antimicrobianos como la producción de piocianina7. La capacidad de estudiar tales comportamientos ofrece una visión emocionante de los ecosistemas bacterianos en un entorno similar a aquel en el que existen en el cuerpo humano.
Uno de los mayores desafíos para estudiar cómo los agregados de Pa responden al entorno cambiante del esputo es la falta de sistemas nutricionalmente relevantes y robustos que promuevan la formación de agregados. Gran parte de lo que se sabe sobre Pa se ha descubierto utilizando sistemas in vitro en los que las células crecen planctonicamente o en una arquitectura característica de "hongo" unida a la superficie que no se ha observado in vivo8. Si bien los modelos clásicos de crecimiento de biopelículas, como las células de flujo o el agar sólido, han producido un conocimiento extenso y valioso sobre los comportamientos bacterianos y los mecanismos de tolerancia a los antibióticos, estos hallazgos no siempre se traducen in vivo. Muchos modelos in vitro tienen una capacidad limitada para imitar el entorno de crecimiento del sitio de infección humana, lo que requiere costosos estudios in vivo. A su vez, muchos modelos in vivo carecen de la flexibilidad y resolución que ofrecen las técnicas in vitro. 
El esputo sintético de fibrosis quística (SCFM2) está diseñado para proporcionar un entorno para el crecimiento de Pa similar al experimentado durante la infección crónica en el pulmón de la FQ. SCFM2 incluye fuentes nutricionales identificadas en la sputa de FQ expectorada, además de mucina, lípidos y ADN. El crecimiento de Pa en SCFM2 requiere un conjunto de genes casi idéntico al requerido para el crecimiento en esputo real y apoya la formación natural de agregados de Pa 9,10. Después de la inoculación, las células planctónicas forman agregados que aumentan de tamaño a través de la expansión. Las células individuales (denominadas migrantes) se liberan de los agregados, migran a áreas no coloreadas y forman nuevos agregados10. Esta historia de vida se puede observar utilizando CLSM y análisis de imágenes a la resolución de una sola célula. Los agregados de Pa formados en SCFM2 son de tamaños similares a los observados en la FQ pulmonar10. Este modelo permite la observación de múltiples agregados de tamaño variable en tiempo real y en tres dimensiones a escala de micras. La microscopía de lapso de tiempo permite el seguimiento de miles (~ 50,000) de agregados en un experimento. El uso de software de análisis de imágenes permite la cuantificación de fenotipos agregados a partir de micrografías, incluido el volumen agregado, el área de superficie y la posición en tres dimensiones hasta los 0,1 μm más cercanos, tanto a nivel de agregado individual como de población. Tener la capacidad de agrupar agregados por fenotipo y posición permite la diferenciación de agregados en diferentes etapas de desarrollo con precisión, así como su respuesta a un microambiente cambiante6,11.
La aplicación de SCFM2 para estudiar agregados de Pa en ensayos de bajo volumen y alto rendimiento lo convierten en un modelo flexible y rentable. Como medio definido, SCFM2 ofrece uniformidad y reproducibilidad a través de múltiples plataformas, proporcionando un método nutricional y físicamente relevante para estudiar agregados de Pa in vitro9. Las aplicaciones incluyen su uso en combinación con CLSM para observar la organización espacial y la tolerancia a los antibióticos a alta resolución (como se describe en este documento de métodos). La capacidad de realizar experimentos que proporcionan datos en tiempo real a escala de micras permite el estudio de las interacciones intra-especie e inter-especie a medida que pueden ocurrir in vivo. Por ejemplo, SCFM2 se ha utilizado previamente para estudiar la dinámica espacial de la comunicación célula-célula en poblaciones agregadas a través de una red de sistemas utilizados por Pa para regular múltiples genes que contribuyen a la virulencia y patogénesis6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig01.jpg"> Figura 1: Representación gráfica de los principales pasos experimentales. (A) SCFM2 se inocula con células Pa y se le permite formar agregados en un plato de cultivo con fondo de vidrio. (B) Los agregados se transfieren al microscopio confocal y se agrega antibiótico. Se representan tres réplicas técnicas (cámaras 1-3) y un pozo de control (4) de SCFM2 inoculado sin tratamiento antibiótico. Los agregados se visualizan utilizando CLSM en el transcurso de 18 h. (C) Después de la imagen inicial de 18 h, los agregados se tratan con yoduro de propidio para visualizar las células muertas y se visualizan utilizando CLSM (D) Los agregados con el fenotipo deseado se separan de SCFM2 utilizando FACS. Abreviaturas: SCFM2 = medio de esputo sintético de fibrosis quística; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = microscopía de barrido láser confocal; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Aquí, se demuestra la utilidad de SCFM2 para estudiar el impacto del tratamiento antibiótico en los agregados de Pa en tiempo real, seguido por el uso de un enfoque de clasificación celular para aislar poblaciones de agregados con fenotipos distintos para el análisis posterior(Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-41-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine HCl</td>
			<td>MP</td>
			<td>1119-34-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Prepared in 0.5 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cystine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid HCl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>138-15-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine HCl H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-32-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ornithine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-91-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-22-3</td>
			<td>Prepared in 0.2 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11141</td>
			<td>Prepared in 1.0 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J6194903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day-of Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Fisher (Avanti Polar Lipids)</td>
			<td>4235-95-4</td>
			<td>shake 15-20 min at 37 &#176;C to evaporate chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 * 7H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7782-63-0</td>
			<td>this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13242</td>
			<td>pH stock to 7 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 * 6H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylglucosamine</td>
			<td>&#160;TCI</td>
			<td>A0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepared solids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1778-100G</td>
			<td>UV-sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66764MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64189</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7757-79-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23100-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23120-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes w/air flow cap</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm four chamber glass-bottom dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>NC0600518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) broth</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>11-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p200)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-150RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p1000)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (25 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>18-194</td>
			<td>Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10&#160; mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>794412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (50 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm PES syringe filter</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS cuvette semi-mico</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>91-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare the figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsDiva6.1.3</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>version 9.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsAriallu</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) es uno de los patógenos oportunistas más comunes asociados con la fibrosis quística (FQ). Una vez que se establece la colonización por Pa, una gran proporción de las bacterias infectantes forman biopelículas dentro del esputo de las vías respiratorias. Se ha demostrado que las biopelículas de Pa aisladas del esputo de FQ crecen en agregados pequeños y densos de ~ 10-1,000 células que están organizadas espacialmente y exhiben fenotipos clínicamente relevantes, como la tolerancia a los antimicrobianos. Uno de los mayores desafíos para estudiar cómo los agregados de Pa responden al entorno cambiante del esputo es la falta de sistemas nutricionalmente relevantes y robustos que promuevan la formación de agregados. Utilizando un medio sintético de esputo CF (SCFM2), se puede observar la historia de vida de los agregados de Pa utilizando microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) y análisis de imágenes a la resolución de una sola célula. Este sistema in vitro permite la observación de miles de agregados de tamaño variable en tiempo real, tres dimensiones y a escala de micras. A nivel individual y poblacional, tener la capacidad de agrupar agregados por fenotipo y posición facilita la observación de agregados en diferentes etapas de desarrollo y su respuesta a cambios en el microambiente, como el tratamiento antibiótico, para diferenciarlos con precisión.

Este trabajo detalla métodos para observar agregados de Pa a alta resolución y en un ambiente similar al de la infección crónica de la FQ pulmonar9,10,12. SCFM2 proporciona un sistema in vitro que promueve la agregación natural de células Pa en tamaños similares a los observados durante la infección real10. La adaptabilidad de SCFM2 como medio definido se puede aprovecha...

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Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

El medio de esputo sintético para fibrosis quística (SCFM2) se puede utilizar en combinación con microscopía de barrido láser confocal y clasificación celular activada por fluorescencia para observar agregados bacterianos a alta resolución. Este documento detalla los métodos para evaluar las poblaciones agregadas durante el tratamiento antimicrobiano como plataforma para futuros estudios.

Herramientas para la evaluación en tiempo real de un modelo de infección por Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

Nuestro protocolo proporciona una forma de estudiar las bacterias resistentes a los antibióticos en un entorno nutricional y físico similar a cómo probablemente existan in vivo. Una de las mayores ventajas de esta técnica es la capacidad de capturar imágenes de alta resolución y datos fenotípicos de bacterias en tamaños de población relevantes para la infección. Eso es agregados de aproximadamente 10 a 1, 000 celdas.Demostrando el procedimiento estará Alexa Gannon, una asistente de investigación graduada de mi laboratorio. Para comenzar, esterilice el medio que contiene mucina bajo luz ultravioleta durante cuatro horas. Transfiera la mucina tratada con UV a tubos estériles de 1,7 mililitros en condiciones estériles y almacene los tubos a menos 20 grados centígrados.Después de preparar la base tamponada, agregue la solución de mucina en la base tamponada que contiene ADN como se describe en el manuscrito de texto. La noche anterior al experimento, inocular cinco mililitros de caldo LB con varias colonias de Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 a partir de un antibiótico que contiene una placa de agar LB y cultivar la bacteria durante la noche a 37 grados centígrados con agitación a 250 revoluciones por minuto. A la mañana siguiente, al menos dos horas antes de comenzar el experimento, encienda el microscopio de barrido láser confocal y abra el módulo de incubación en el software de imágenes asociado.Diluir 500 microlitros del cultivo en cinco mililitros de caldo LB fresco e incubar la suspensión bacteriana a 37 grados centígrados y 250 revoluciones por minuto durante 60 a 90 minutos. Cuando las bacterias hayan entrado en la fase de registro, peletizar las células bacterianas por centrifugación y lavar las células tres veces con pbs esterilizados por filtro. Después del último lavado, vuelva a gastar el pellet en un mililitro de PBS.Mida la absorbancia de la suspensión celular bacteriana a 600 nanómetros para determinar el volumen de cultivo requerido para una densidad óptica de 0,05 en cinco mililitros de esputo sintético de fibrosis quística medio dos. Inocular el volumen calculado de suspensión celular bacteriana en el medio y el vórtice suavemente antes de agregar un mililitro de células a cada cámara de un plato de cultivo óptico de cuatro cámaras, luego incubar las bacterias durante cuatro horas en condiciones estáticas a 37 grados centígrados. Para obtener imágenes de los agregados de Pseudomonas aeruginosa mediante microscopio de barrido láser confocal, al final de la incubación, designe tres pomos de la placa de cultivo como réplicas del tratamiento antibiótico y uno bien como el control sin tratamiento y coloque la placa en la etapa calentada en el microscopio.Seleccione un objetivo de inmersión de aceite 63X y abra la pestaña de localización para identificar los agregados bacterianos en el campo brillante. Defina un área para obtener imágenes dentro de cada pozo y use el módulo de posiciones para almacenar la posición del área. Establezca la longitud de onda de excitación en 488 nanómetros y la longitud de onda de emisión en 509 nanómetros.En el módulo de adquisición, seleccione la opción Z-stack para adquirir las imágenes y utilice el módulo de promedio de línea para reducir la fluorescencia de fondo en el canal GFP dentro del volumen total de las imágenes Z-stack. Establezca la opción de serie temporal para capturar 60 rebanadas en cada pozo a intervalos de 15 minutos durante 18 horas y use la estrategia de enfoque definida para almacenar un plano focal para cada posición que se volverá a imaginar en cada punto de tiempo a lo largo del experimento. 4-1/2 horas después de configurar el experimento de imágenes, imagine cada posición para determinar la biomasa agregada dentro de cada uno de los cuatro pozos antes de la adición del antibiótico.Después de seis horas, agregue suavemente el antibiótico dos veces por debajo de la concentración inhibitoria mínima al medio de cada pozo, simplemente sople la interfaz del líquido de aire y haga clic en iniciar el experimento para comenzar la imagen del tratamiento posterior al antibiótico. Para aislar las células vivas, al final del período de imágenes de 18 horas, etiquete las bacterias en cada pozo con el volumen apropiado de yoduro de propidio de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Al final de la incubación, use un recipiente aislado para transferir la placa al citómetro de flujo y configure el citómetro para detectar GFP y yoduro de propidio utilizando una boquilla de 70 micras, luego ejecute alícuotas de un mililitro de cada sobrenadante de cultivo a la tasa de flujo más baja para clasificar los agregados viables de Pseudomonas aeruginosa con yoduro de propidio positivos y no viables.Para cuantificar la dinámica agregada, cargue las imágenes en un programa de software de análisis de imágenes apropiado y cree histogramas de los recuentos producidos para los cultivos de control no tratados y tratados con antibióticos en el canal GFP para permitir la cuantificación de la fluorescencia de fondo. Para garantizar que los vóxeles GFP detectados se correlacionen con la biomasa bacteriana, defina un vóxel GFP positivo como mayor o igual a 1,5 veces el valor del recuento de fondo GFP. Produzca las superficies ISO para todos los vóxeles restantes y para detectar agregados individuales, habilite la opción dividir objetos y defina los agregados como objetos.Utilice el módulo vantage para calcular el volumen XYZ y la suma de los vóxeles GFP para cada objeto individual. Exporte estos datos a una plataforma estadística externa. Filtre los datos exportados por tamaño para definir objetos con volúmenes mayores o iguales a cinco micrómetros cúbicos.Elimine cualquier objeto de menos de 0,5 micrómetros cúbicos y utilice el módulo de vista para calcular la distancia de cada objeto en relación con otros objetos dentro de cada imagen. Alternativamente, la distancia se puede calcular utilizando la fórmula, luego use la suma y los cálculos promedio para determinar la biomasa total en el volumen agregado promedio. Aunque quedan múltiples agregados bacterianos viables después de cuatro horas de aplicación de antibióticos, la biomasa total de las poblaciones agregadas dentro de los cultivos tratados con antibióticos se reduce significativamente en comparación con la de los cultivos no tratados.La microscopía de series temporales se puede utilizar para determinar los patrones espaciales entre los agregados sensibles positivos para yoduro de propidio y los agregados tolerantes positivos para GFP después del tratamiento con antibióticos. Al calcular cómo los agregados de diferentes tamaños contribuyen a la población general, se pueden identificar patrones de cómo los agregados responden al tratamiento con antibióticos en relación con su tamaño, forma y posición. Después del tratamiento con antibióticos, los agregados viables y no viables se pueden separar con éxito de acuerdo con su expresión de señal fluorescente.Esperamos que este protocolo inspire a otros investigadores a estudiar su organismo de elección a una resolución similar. Nuestro objetivo es encontrar hilos biológicos comunes en estas comunidades complejas, independientemente del sitio de infección.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Investigación

Inmunología e Infección

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa y Biofilm Saccharomyces cerevisiae en las celdas de flujo

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Llegado al lado de la luz: Vivo en monitoreo de Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecciones en las heridas crónicas en un diabético sin pelo modelo murino

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus en tiempo real RT-PCR para diagnóstico de rabia

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...