Name: high-throughput antiviral assays to screen for inhibitors of zika virus replication
Uploaded: 2021-10-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), CEPID Grant 2013/07600-3 an GO, Grant 2018/05130-3 an RSF und 2016/19712-9 an ASG und Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Grant 88887.516153/2020-00) an ASG. Wir danken der Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) und der Drugs for Neglected Diseases Initiative (DNDi, www.dndi.org) für ihre Unterstützung, das Design der Pandemic Response Box und die Lieferung der Wirkstoffe.

1. Luciferase-Aktivitätstest
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Verfahren mit Zellkultur in zertifizierten Biosicherheitshauben durchgeführt werden (siehe Materialtabelle).
<ol><li>Bereiten Sie Wachstumsmedien vor, die aus Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) bestehen, ergänzt mit 10% FBS und 500 μg/ml G418.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung aus getesteten Verbindungen in 100% DMSO vor und verdünnen Sie sie dann auf 1 mM in 100% DMS...

<ol>
	<li>Zou, J., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Zika+drug+discovery.">Strategies for Zika drug discovery.</a> Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).</li><li>Cugola, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Brazilian+Zika+virus+strain+causes+birth+defects+in+experimental+models.">The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models.</a> Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).</li><li>de Ara&#250;jo, T. V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+microcephaly,+Zika+virus+infection,+and+other+risk+factors+in+Brazil:+Final+report+of+a+case-control+study.">Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).</li><li>Cao-Lormeau, V. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guillain-Barr&#233;+Syndrome+outbreak+associated+with+Zika+virus+infection+in+French+Polynesia:+a+case-control+study.">Guillain-Barr&#233; Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study.</a> The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).</li><li>Pielnaa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus-spread,+epidemiology,+genome,+transmission+cycle,+clinical+manifestation,+associated+challenges,+vaccine+and+antiviral+drug+development.">Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development.</a> Virology. 543, 34-42 (2020).</li><li>Bollati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functionality+in+flavivirus+NS-proteins:+Perspectives+for+drug+design+Flaviviral+NS3+protein+Flaviviral+NS5+protein+Protease+Helicase+Polymerase+Methyltransferase+Flavivirus+protein+structure+Antivirals+VIZIER+Consortium.">Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium.</a> Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).</li><li>Fernandes, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+replicons+for+antiviral+drug+discovery+against+positive+single-stranded+RNA+viruses.">Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses.</a> Viruses. 12 (6), (2020).</li><li>Fernandes, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+an+imidazonaphthyridine+and+a+riminophenazine+as+potent+anti-Zika+virus+agents+through+a+replicon-based+high-throughput+screening.">Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening.</a> Virus Research. 299, 198388 (2021).</li><li>Noske, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+and+polymorphism+analysis+of+the+NS2B-NS3+protease+from+the+2017+Brazilian+circulating+strain+of+Yellow+Fever+virus.">Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).</li><li>Godoy, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Zika+virus+NS5+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase.</a> Nature Communications. 8, 14764 (2017).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adenosine+nucleoside+inhibitor+of+dengue+virus.">An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Brecher, M., Zhang, J., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flavivirus+protease+as+a+target+for+drug+discovery.">The flavivirus protease as a target for drug discovery.</a> Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).</li><li>Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-bound+structures+of+the+dengue+virus+protease+reveal+the+active+conformation.">Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation.</a> Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+activation+and+inhibition+of+Zika+virus+NS2B-NS3+protease.">Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease.</a> Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).</li><li>Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., R&#367;&#382;ek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoside+analogs+as+a+rich+source+of+antiviral+agents+active+against+arthropod-borne+flaviviruses.">Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses.</a> Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).</li><li>Xie, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Replicons+for+Drug+Discovery.">Zika Virus Replicons for Drug Discovery.</a> EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).</li><li>Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+NS3/4A+protease-based+reporter+assay+suitable+for+efficiently+assessing+hepatitis+C+virus+infection.">Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).</li><li>Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Determination+of+Dengue+Virus+Type+2+NS2B-NS3+Protease+Activity+with+Fluorescent+Peptide+Substrates.">In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).</li><li>Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+utility+of+an+in+vitro,+fluorescence-based+assay+for+the+discovery+of+novel+compounds+against+dengue+2+viral+protease.">Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease.</a> Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).</li><li>Ong, I. L. H., Yang, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+protease+activity+assays+and+sensors.">Recent developments in protease activity assays and sensors.</a> Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).</li><li>Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+high-throughput+screen+to+identify+small+compound+inhibitors+of+the+genotype+3a+hepatitis+c+virus+RNA+polymerase.">A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).</li><li>Eydoux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+high+throughput-screening+assay+for+the+SARS-CoV+RNA+synthesis+complex.">A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex.</a> Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).</li><li>Shimizu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+small+molecule+inhibitor+targeting+dengue+virus+NS5+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).</li><li>S&#225;ez-&#193;lvarez, Y., Arias, A., del &#193;guila, C., Agudo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fluorescence-based+method+for+the+rapid+determination+of+Zika+virus+polymerase+activity+and+the+screening+of+antiviral+drugs.">Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+RdRp+assay+with+self-priming+RNA.">Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA.</a> Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).</li><li>Niyomrattanakit, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+alkaline+phosphatase-coupled+polymerase+assay+for+identification+of+inhibitors+of+dengue+virus+RNA-Dependent+RNA+polymerase.">A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).</li><li>Simeonov, A., Davis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).</li><li>Genick, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+biophysics+in+high-+Throughput+screening+hit+validation.">Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).</li><li>Smith, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+initiation+and+elongation+inhibitors+of+dengue+virus+RNA+polymerase+in+a+high-throughput+lead-finding+campaign.">Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).</li><li>Porecha, R., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+radiolabeling.">RNA radiolabeling.</a> Methods in enzymology. 530, 255-279 (2013).</li></ol>

Die hier beschriebenen Protokolle könnten leicht für Screenings in einem 384- oder 1536-Well-Format angepasst werden. Für biochemische und/oder zellbasierte Screenings, die im HTS-Format durchgeführt werden, wird der Z'-Faktorwert, ein statistischer Parameter, für jede Platte berechnet, um die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Genauigkeit dieser Assays sicherzustellen12. Für replicon-basierte Screenings wird ein Z'-Faktorwert von 0,5 oder mehr erwartet, während für die NS3- und NS5-A...

Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein neu auftretendes arthropodenübertragenes Virus, das zur Gattung Flavivirusgehört, zu der das eng verwandte Dengue-Virus (DENV), das Japanische Enzephalitis-Virus (JEV) und das Gelbfiebervirus (YFV) gehören, die eine ständige Bedrohung für die öffentliche Gesundheit darstellen1. Der ZIKV-Ausbruch 2015-16 in Amerika erhielt weltweite Aufmerksamkeit nach seinem Auftreten in Brasilien aufgrund der Assoziation mit schweren neurologischen Störungen, wie angeborener ZIKV-assoziierter Mikrozephalie bei Neugeborenen2,3 und Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen4. Obwohl die Zahl der Infektionsfälle in den nächsten zwei Jahren zurückging, wurden autochthone durch Mücken übertragene Übertragungen von ZIKV im Jahr 2019 in 87 Ländern und Gebieten nachgewiesen, was das Potenzial des Virus belegt, als Epidemie wieder aufzutauchen5. Bis heute gibt es keine zugelassenen Impfstoffe oder wirksamen Medikamente gegen ZIKV-Infektionen.
Die Entdeckung antiviraler Medikamente erfordert die Entwicklung zuverlässiger zellulärer und biochemischer Assays, die in Hochdurchsatz-Screening-Formaten (HTS) durchgeführt werden können. Replicon-basierte Screenings und virale enzymbasierte Assays sind zwei wertvolle Strategien, um niedermolekulare Verbindungen auf Inhibitoren von ZIKV1zu testen. Es wird angenommen, dass sich die nichtstrukturellen Flavivirusproteine (NS) kotranslational auf den endoplasmatischen Retikulummembranen (ER) zusammensetzen und den Replikationskomplex (RC)bilden 6. Die NS3 und NS5 sind die am besten untersuchten Enzyme der RC und stellen aufgrund ihrer entscheidenden Rolle bei der Replikation des viralen Genoms die Hauptziele für die Arzneimittelentwicklung dar. Die NS3-Proteasedomäne, die NS2B als Cofaktor benötigt, ist für die Spaltung des unreifen viralen Polyproteins in die reifen NS-Proteine verantwortlich, während die NS5 RdRp-Domäne für die RNA-Replikation verantwortlich ist6.
Replicons sind selbstreplizierende subgenomische Systeme, die in Säugetierzellen exprimiert werden, in denen die viralen Strukturgene durch ein Reportergen ersetzt werden. Die hemmenden Wirkungen von Verbindungen auf die virale RNA-Replikation können leicht bewertet werden, indem die Verringerung der Reporterproteinaktivität gemessen wird7. Hierin beschreiben wir die Protokolle, die für screening-Inhibitoren der ZIKV-Replikation in einem 96-Well-Plattenformat verwendet werden. Die Replicon-basierten Assays wurden mit einer BHK-21 ZIKV Rluc Replicon Zelllinie durchgeführt, die wir kürzlich entwickelt haben8. Um die spezifischen Targets der identifizierten Verbindungen zu charakterisieren, haben wir in vitro fluoreszenzbasierte Assays für rekombinant exprimierte NS3-Protease unter Verwendung des fluorogenen Peptidsubstrats Bz-nKRR-AMC etabliert, während wir für NS5 RdRp die Dehnung der synthetischen biotinylierten selbstansaugenden Schablone 3′UTR-U30 (5'-Biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') mit dem interkalierenden Farbstoff SYBR Green I gemessen haben.
Die ZIKV-Protease (45-96 Rückstände des NS2B-Cofaktors, die mit den Rückständen 1-177 der NS3-Proteasedomäne durch einen glycinreichen Linker[G4SG4])verbunden sind, wurde wie für YFV9beschrieben erhalten, während die Polymerase (276-898 Rückstände der RdRp-Domäne) geklont und exprimiert wurde, wie in10beschrieben. Beide Enzymsequenzen wurden von GenBank ALU33341.1 abgeleitet. Als primäre antivirale Screenings werden Verbindungen bei 10 μM getestet und diejenigen, die Aktivitäten ≥ 80% zeigen, werden dann dosisabhängig bewertet, was zu den Effektiv-/Hemmungs- (EC50 oder IC50)und den zytotoxischen (CC50)Konzentrationen führt. Im Rahmen repräsentativer Ergebnisse werden die EC50- und CC50-Werte von NITD008, einem bekannten Flavivirusinhibitor11,aus replicon-basierten Screenings gezeigt. Für die enzymatischen Assays werden die IC50-Werte von zwei Verbindungen aus der MMV/DNDi Pandemic Response Box, einer Bibliothek aus 400 Molekülen mit antibakteriellen, antimykotischen und antiviralen Aktivitäten, gezeigt. Die in dieser Arbeit beschriebenen Protokolle könnten modifiziert werden, um nach Inhibitoren anderer verwandter Flaviviren zu suchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3&#39;</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>-</td>
			<td>100 ng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K12-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Microplate</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K4-9610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMC (7-amine-4-methylcoumarine)</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>257370</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>A1153</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>JenaBioscience</td>
			<td>NU-1010-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bz-nKRR-AMC</td>
			<td>International Peptides</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biohazard Safety Cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3760091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td>Disulfate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 tetrahydrate</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>203734</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M6494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NITD008 &#8805;98% (HPLC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML2409</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR system Mx3000P</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renilla luciferase Assay System</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7563</td>
			<td>500 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution 1X</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>59417-C</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput antiviral assays to screen for inhibitors of zika virus replication

Die Entdeckung antiviraler Medikamente erfordert die Entwicklung zuverlässiger biochemischer und zellulärer Assays, die in Hochdurchsatz-Screening-Formaten (HTS) durchgeführt werden können. Es wird angenommen, dass sich die nichtstrukturellen Flavivirusproteine (NS) kotranslational auf den endoplasmatischen Retikulummembranen (ER) zusammensetzen und den Replikationskomplex (RC) bilden. Die NS3 und NS5 sind die am besten untersuchten Enzyme der RC und stellen aufgrund ihrer entscheidenden Rolle bei der Replikation des viralen Genoms die Hauptziele für die Arzneimittelentwicklung dar. Die NS3-Proteasedomäne, die NS2B als Cofaktor benötigt, ist für die Spaltung des unreifen viralen Polyproteins in die reifen NS-Proteine verantwortlich, während die NS5 RdRp-Domäne für die RNA-Replikation verantwortlich ist. Hierin beschreiben wir detailliert die Protokolle, die in replicon-basierten Screenings und enzymatischen Assays verwendet werden, um große Verbindungsbibliotheken auf Inhibitoren der Zika-Virus-Replikation (ZIKV) zu testen. Replicons sind selbstreplizierende subgenomische Systeme, die in Säugetierzellen exprimiert werden, in denen die viralen Strukturgene durch ein Reportergen ersetzt werden. Die hemmenden Wirkungen von Verbindungen auf die virale RNA-Replikation können leicht bewertet werden, indem die Verringerung der Reporterproteinaktivität gemessen wird. Die replicon-basierten Screenings wurden mit einer BHK-21 ZIKV Replicon Zelllinie durchgeführt, die Renilla Luciferase als Reportergen exprimierte. Um die spezifischen Ziele der identifizierten Verbindungen zu charakterisieren, haben wir in-vitro-fluoreszenzbasierte Assays für rekombinant exprimierte NS3-Protease und NS5 RdRp etabliert. Die proteolytische Aktivität der viralen Protease wurde unter Verwendung des fluorogenen Peptidsubstrats Bz-nKRR-AMC gemessen, während die NS5 RdRp-Dehnungsaktivität direkt durch die Erhöhung des fluoreszierenden Signals von SYBR Green I während der RNA-Elongation unter Verwendung der synthetischen biotinylierten selbstansaugenden Vorlage 3′UTR-U30 (5'-Biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') nachgewiesen wurde.

Alle hierin beschriebenen Protokolle wurden in 96-Well-Platten festgelegt und ermöglichen die Bewertung von 80 Verbindungen pro Platte in einem primären Screening einer einzigen Konzentration, einschließlich der Negativ- und Positivkontrollen an der ersten bzw. letzten Spalte der Platte. Die replicon-basierten Screenings sind in Abbildung 1dargestellt, die das RNA-Konstrukt enthält, das zur Gewinnung der BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo-Zelllinie entwickelt wurde (Abbildung 1...

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High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication

In dieser Arbeit beschreiben wir die Protokolle, die in replikonbasierten und viralen enzymbasierten Assays verwendet werden, um in einem Hochdurchsatz-Screening-Format nach Inhibitoren der Zika-Virusreplikation zu suchen.

Antivirale Hochdurchsatz-Assays zum Screening auf Inhibitoren der Zika-Virusreplikation

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, in einem Hochdurchsatz-Screening-Format mit einem replikonbasierten und/oder einem viralen Enzym-basierten Assay nach Inhibitoren der Zika-Virusreplikation zu suchen. Die Entdeckung antiviraler Medikamente erfordert die Entwicklung zuverlässiger zellulärer und biochemischer Assays, die in Hochdurchsatz-Screening-Formaten durchgeführt werden können. Replicon-basierte Screenings und virale Enzym-basierte Assays sind zwei wertvolle Strategien, um niedermolekulare Verbindungen als Inhibitoren des Zika-Virus zu testen.Replicons sind selbstreplizierende subgenomische Systeme, die in Säugetierzellen exprimiert werden, in denen die viralen Strukturgene durch ein Reportergen ersetzt werden. In unserem Labor haben wir ein Zika-Virus-Replicon-System entwickelt, einschließlich der Renilla-Luciferase, die stabil in Babyhamster-BHK-21-Zelllinien exprimiert wird. Die hemmenden Wirkungen von Verbindungen auf die virale RNA-Replikation können leicht bewertet werden, indem die Verringerung der Luciferase-Aktivität gemessen wird.Um die spezifischen Ziele der identifizierten Verbindungen zu charakterisieren, haben wir in vitro fluoreszenzbasierte Assays für rekombinant exprimierte NS3-Protease und NS5-RNA-abhängige RNA-Polymerase, die RdRp, etabliert. In einem sterilen laminaren Fluss das Medium aus dem Kolben entfernen und entsorgen.Fügen Sie fünf Mil Trypsin-EDTA in den Kolben hinzu. Verteilen Sie die Trypsinlösung über die Zellen und lassen Sie den Kolben fünf bis 10 Minuten stehen, damit sich die Zellen lösen können. Ernten Sie die resuspendierten Zellen und legen Sie sie in das sterile 50-mil-Röhrchen und zentrifugieren Sie es für 125G während fünf Minuten.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen in fünf Mil DMEM 10% FBS zum Zählen. Stellen Sie die Zellen auf zwei Mal 10 bis vier pro Vertiefung ein und säen Sie sie in einer 96-Well-Platte. Anschließend wird die Platte 16 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Luftbefeuchter-Inkubator inkubiert.Als nächstes verwerfen Sie das Medium und fügen Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung von DMEM 2% FBS hinzu. Fügen Sie einen Mikroliter der Verbindung pro Vertiefung hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren und 1% DMSO im Assay-Medium zu erhalten. Bereiten Sie in der ersten und in der letzten Spalte die Positiv- und Negativkontrolle vor.Inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Luftbefeuchter-Inkubator. Bereiten Sie Renilla Luciferase Lysepuffer in Reagenz gemäß der Herstellungsanweisung vor. Nach dem Verwerfen des Überstands aus den Zellen fügen Sie 25 Mikroliter Renilla luciferase lyse Puffer pro Vertiefung hinzu.100 Mikroliter Renilla Luciferase Assay-Reagenz pro Vertiefung zu einer weißen, undurchsichtigen 96-Well-Platte hinzufügen. Übertragen Sie 20 Mikroliter des Zelllysats auf die weiße Platte und lesen Sie dann die Lumineszenzsignale im Luminometer. Für den MTT-Assay wurde zuvor gezeigt, dass nach der Inkubation der Verbindung 10 Mikroliter pro Vertiefung MTT-Lösung zu den Zellen hinzugefügt und die Platte bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Luftbefeuchter für 24 Stunden inkubiert wird.Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 100 Mikroliter DMSO zu jeder Vertiefung hinzu und lösen Sie dann die Formazankristalle durch Pipettieren nach oben und unten. Lesen Sie die Absorptionsmittel bei 570 Nanometern in einem Spektralphotometer ab. Bereiten Sie nach dem Auftauen von Materialien auf Eis eine geeignete Menge an Proteinverdünnung vor, um eine Endkonzentration von vier Nanomolaren pro Vertiefung zu erreichen.Geben Sie in einer weißen Platte mit 96 Wellen 84 Mikroliter des Assay-Puffers in jede Vertiefung. Um eine Kontrollreaktion vorzubereiten, fügen Sie ein Mikroliter DMSO in die erste Säule der Platte hinzu. Fügen Sie einen Mikroliter der getesteten Verbindungen hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren auf der Platte zu erreichen.Geben Sie fünf Mikroliter pro Vertiefung pro Proteaselösung, ohne Kontrollen, und inkubieren Sie die Platte bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Um die Reaktion zu starten, dosieren Sie 10 Mikroliter fluorogene Substrat-Stammlösung in die Vertiefungen. Verfolgen Sie ihre Reaktion mit einem Fluorometer, das in geeigneten Parametern eingestellt ist.Für diese Sitzung müssen alle Reagenzien mit DEPC-behandeltem Wasser vorbereitet werden. Glühen Sie die Polyuridin-RNA, indem Sie sie bei 55 Grad Celsius für fünf Minuten in einem Thermocycler inkubieren. Auftauen Sie Materialien auf Eis und verdünnen Sie das Protein, um eine Endkonzentration von 250 Nanomolaren im Assay-Puffer zu erreichen.Bereiten Sie den SYBR Green I Lösungsassaypuffer vor und fügen Sie dann ATP und die anealierte RNA zu einer Endkonzentration von einem Millimolar bzw. 300 Nanomolar hinzu. In einer PCR-Platte werden 24,5 Mikroliter des verdünnten Proteins in den Spalten eins bis 11 hinzugefügt. Fügen Sie das gleiche Volumen des Assay-Puffers in den verbleibenden Bohrungen hinzu.Fügen Sie 0,5 Mikroliter pro Vertiefung von Verbindungen und Kontrollen hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren zu erreichen. Nach 15 Minuten Inkubation beginnen Sie die Reaktion, indem Sie 25 Mikroliter der Substratlösung hinzufügen und die Platte versiegeln. Verfolgen Sie die Reaktion in einem Echtzeit-PCR-System, das bei 30 Grad Celsius mit einem FAM-Filter inkubiert wird.In Abbildung 1A sehen wir eine schematische Darstellung des RNA-Konstrukts, das entwickelt wurde, um Zika-Viral-Replicon-Zelllinien zu erhalten, und zeigen, dass das Rluc-Gen die strukturellen Sequenzen ersetzt und die neue IRES-Kassette am 3'-Ende eingefügt wird. Es enthält auch einen T7-Promotor in der Hepatitis-Delta-Virus-Ribozym-Sequenz für die In-vitro-Transkription und für die Generierung des authentischen 3'-Endes bzw. des RNA-Transkripts. In Abbildung 1B sehen wir eine schematische Darstellung des replicon-basierten Zellassays.In Abbildung 1C sehen wir die Dosis-Wirkungs-Kurven und die Zytotoxizitätskurven einer bestimmten Verbindung, die mit dem Rluc-Replicon-System erhalten wurden. In Abbildung 2A sehen wir eine schematische Darstellung des Assays, der zur Bestimmung der Aktivität der NS2B-NS3-Protease verwendet wird. In Abbildung 2B sehen wir die Dosis-Wirkungs-Kurve eines bestimmten Inhibitors, der auf die NS2B-NS3-Protease abzielt.In Abbildung 2C sehen wir eine schematische Darstellung des Dehnungstests, der zur Bestimmung der NS5 RdRp-Aktivität verwendet wird. In Abbildung 2D sehen wir die Dosis-Wirkungs-Gruppe eines bestimmten Inhibitors, der auf die RdRp-Aktivität des Zika-Virus abzielt. Die demonstrierten Verfahren konnten leicht für Screenings in einem 384- oder 1.536-Well-Format angepasst werden.Für die replikonbasierten Hochdurchsatz-Screenings entwickelten wir eine stabile Zelllinie, die ein replikatives Zika-Virusreplikon beherbergt, das eine Renilla-Luciferase-Sequenz am 5'-Ende enthält, sowie ein Neomycin-Phosphotransferase-Gen, das von einer internen ribosomalen Eintrittsstelle am 3'-Ende angetrieben wird. Aufgrund des Mangels an strukturellen Genen produzieren Replikone keine Nachkommenvirionen. Somit wird das Risiko einer im Labor erworbenen Virusinfektion eliminiert.Darüber hinaus demonstrierten wir auch die Verfahren, die in viralen enzymbasierten Assays für die rekombinante NS3-Protease und NS5 RdRp verwendet werden. Die proteolytische Aktivität der viralen Protease wurde mit einem fluorogenen Peptidsubstrat gemessen, das die Zika-Virus-Protease-Erkennungs- und Spaltsequenzen in Verbindung mit dem Fluoreszenzstock-Aminomethylcumarin enthält. In Bezug auf die NS5-RNA-abhängige RNA-Polymerase wird ihre Dehnungsaktivität direkt durch die Erhöhung des fluoreszierenden Signals von SYBR Green I nachgewiesen.Diese Implementierung, direkte Messung und Erschwinglichkeit sind Schlüsselpunkte für die floreszenzbasierten Methoden des Benutzers als Hochdurchsatz-Screening-Plattformen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Forschung

Immunologie und Infektion

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika-Virus spezifische diagnostische Epitop Entdeckung

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...