Name: high-throughput antiviral assays to screen for inhibitors of zika virus replication
Uploaded: 2021-10-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication at JoVE.com

Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), CEPID hibesi 2013/07600-3 tarafından desteklendi. RSF'ye 2018/05130-3 ve ASG'ye 2016/19712-9 ve ASG'ye Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (hibe 88887.516153/2020-00) vermek. Sıtma Girişimleri için İlaç (MMV, www.mmv.org) ve İhmal Edilen Hastalıklar için İlaçlar girişimine (DNDi, www.dndi.org) destekleri, Pandemi Müdahale Kutusu'nun tasarımı ve bileşikleri tedarik ettikleri için minnettar bir şekilde teşekkür ederiz.

1. Luciferase aktivitesi tahlili
NOT: Hücre kültürünü içeren tüm prosedürlerin sertifikalı biyogüvenlik başlıklarında yürütüldüğünden emin olun (bkz. Malzeme Tablosu).
<ol><li>Dulbecco'nun %10 FBS ve 500 μg/mL G418 ile desteklenmiş Modifiye Kartal Ortası'nda (DMEM) oluşan büyüme ortamı hazırlayın.</li>
	<li>%100 DMSO'da test edilmiş bileşiklerin 10 mM stok çözeltisini hazırlayın ve ardından%100 DMSO'da 1 mM'ye seyreltin.</l...

<ol>
	<li>Zou, J., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Zika+drug+discovery.">Strategies for Zika drug discovery.</a> Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).</li><li>Cugola, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Brazilian+Zika+virus+strain+causes+birth+defects+in+experimental+models.">The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models.</a> Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).</li><li>de Ara&#250;jo, T. V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+microcephaly,+Zika+virus+infection,+and+other+risk+factors+in+Brazil:+Final+report+of+a+case-control+study.">Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).</li><li>Cao-Lormeau, V. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guillain-Barr&#233;+Syndrome+outbreak+associated+with+Zika+virus+infection+in+French+Polynesia:+a+case-control+study.">Guillain-Barr&#233; Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study.</a> The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).</li><li>Pielnaa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus-spread,+epidemiology,+genome,+transmission+cycle,+clinical+manifestation,+associated+challenges,+vaccine+and+antiviral+drug+development.">Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development.</a> Virology. 543, 34-42 (2020).</li><li>Bollati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functionality+in+flavivirus+NS-proteins:+Perspectives+for+drug+design+Flaviviral+NS3+protein+Flaviviral+NS5+protein+Protease+Helicase+Polymerase+Methyltransferase+Flavivirus+protein+structure+Antivirals+VIZIER+Consortium.">Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium.</a> Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).</li><li>Fernandes, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+replicons+for+antiviral+drug+discovery+against+positive+single-stranded+RNA+viruses.">Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses.</a> Viruses. 12 (6), (2020).</li><li>Fernandes, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+an+imidazonaphthyridine+and+a+riminophenazine+as+potent+anti-Zika+virus+agents+through+a+replicon-based+high-throughput+screening.">Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening.</a> Virus Research. 299, 198388 (2021).</li><li>Noske, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+and+polymorphism+analysis+of+the+NS2B-NS3+protease+from+the+2017+Brazilian+circulating+strain+of+Yellow+Fever+virus.">Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).</li><li>Godoy, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Zika+virus+NS5+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase.</a> Nature Communications. 8, 14764 (2017).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adenosine+nucleoside+inhibitor+of+dengue+virus.">An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Brecher, M., Zhang, J., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flavivirus+protease+as+a+target+for+drug+discovery.">The flavivirus protease as a target for drug discovery.</a> Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).</li><li>Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-bound+structures+of+the+dengue+virus+protease+reveal+the+active+conformation.">Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation.</a> Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+activation+and+inhibition+of+Zika+virus+NS2B-NS3+protease.">Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease.</a> Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).</li><li>Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., R&#367;&#382;ek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoside+analogs+as+a+rich+source+of+antiviral+agents+active+against+arthropod-borne+flaviviruses.">Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses.</a> Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).</li><li>Xie, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Replicons+for+Drug+Discovery.">Zika Virus Replicons for Drug Discovery.</a> EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).</li><li>Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+NS3/4A+protease-based+reporter+assay+suitable+for+efficiently+assessing+hepatitis+C+virus+infection.">Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).</li><li>Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Determination+of+Dengue+Virus+Type+2+NS2B-NS3+Protease+Activity+with+Fluorescent+Peptide+Substrates.">In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).</li><li>Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+utility+of+an+in+vitro,+fluorescence-based+assay+for+the+discovery+of+novel+compounds+against+dengue+2+viral+protease.">Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease.</a> Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).</li><li>Ong, I. L. H., Yang, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+protease+activity+assays+and+sensors.">Recent developments in protease activity assays and sensors.</a> Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).</li><li>Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+high-throughput+screen+to+identify+small+compound+inhibitors+of+the+genotype+3a+hepatitis+c+virus+RNA+polymerase.">A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).</li><li>Eydoux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+high+throughput-screening+assay+for+the+SARS-CoV+RNA+synthesis+complex.">A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex.</a> Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).</li><li>Shimizu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+small+molecule+inhibitor+targeting+dengue+virus+NS5+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).</li><li>S&#225;ez-&#193;lvarez, Y., Arias, A., del &#193;guila, C., Agudo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fluorescence-based+method+for+the+rapid+determination+of+Zika+virus+polymerase+activity+and+the+screening+of+antiviral+drugs.">Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+RdRp+assay+with+self-priming+RNA.">Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA.</a> Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).</li><li>Niyomrattanakit, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+alkaline+phosphatase-coupled+polymerase+assay+for+identification+of+inhibitors+of+dengue+virus+RNA-Dependent+RNA+polymerase.">A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).</li><li>Simeonov, A., Davis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).</li><li>Genick, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+biophysics+in+high-+Throughput+screening+hit+validation.">Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).</li><li>Smith, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+initiation+and+elongation+inhibitors+of+dengue+virus+RNA+polymerase+in+a+high-throughput+lead-finding+campaign.">Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).</li><li>Porecha, R., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+radiolabeling.">RNA radiolabeling.</a> Methods in enzymology. 530, 255-279 (2013).</li></ol>

Burada açıklanan protokoller, 384 veya 1536 kuyu formatlarındaki gösterimler için kolayca uyarlanabilir. HTS formatında gerçekleştirilen biyokimyasal ve/veya hücre bazlı taramalar için, istatistiksel bir parametre olan Z faktörü değeri, bu tahlillerin hassasiyetini, tekrarlanabilirliğini ve doğruluğunu sağlamak için her plaka için hesaplanır12. Replikon tabanlı taramalar için 0,5 ve üzeri bir Z' faktör değeri beklenirken, NS3 ve NS5 etkinlik tahlilleri için 0,7 ve üzeri...

Zika virüsü (ZIKV), halk sağlığı için sürekli tehditler oluşturan, yakından ilişkili Dang virüsü (DENV), Japon ensefalit virüsü (JEV) ve Sarı Humma virüsünü (YFV) içeren Flaviviruscinsinin gelişmekte olan eklembacaklı kaynaklı bir virüs üyesidir1. Amerika'daki 2015-16 ZIKV salgını, Brezilya'da yenidoğanlarda2,3 ve yetişkinlerde Guillain-Barré sendromu gibi konjenital ZIKV ilişkili mikrosefali gibi ağır nörolojik bozukluklarla ilişkisi nedeniyle ortaya çıkmasının ardından küresel ilgi gördü4. Enfeksiyon vakalarının sayısı önümüzdeki iki yıl boyunca azalsa da, ZIKV'nin otokton sivrisinek kaynaklı bulaşları 2019'da 87 ülke ve bölgede doğrulandı, bu nedenle virüsün bir salgın olarak yeniden ortaya çıkma potansiyeli tahliye edildi5. Bugüne kadar ZIKV enfeksiyonuna karşı onaylanmış aşı veya etkili ilaç bulunmamaktadır.
Antiviral ilaç keşfi, yüksek verimli tarama (HTS) formatlarında gerçekleştirilebilen güvenilir hücresel ve biyokimyasal tahlillerin geliştirilmesini gerektirir. Replikon bazlı taramalar ve viral enzim bazlı tahliller, ZIKV1inhibitörleri için küçük moleküllü bileşikleri test etmek için iki değerli stratejidir. Flavivirüs yapısal olmayan (NS) proteinlerin endoplazmik reticulum (ER) membranları üzerinde birlikte bir araya getirerek replikasyon kompleksini (RC) oluşturduğu düşünülmektedir6. NS3 ve NS5, RC'nin en çok çalışılan enzimleridir ve viral genom replikasyonunda önemli rolleri nedeniyle ilaç gelişimi için ana hedefleri oluşturmaktadır. Kofaktör olarak NS2B gerektiren NS3 proteaz etki alanı, olgunlaşmamış viral poliproteinin olgun NS proteinlerine bölünmesinden sorumludur, NS5 RdRp etki alanı ise RNA replikasyon6.
Replikonlar, viral yapısal genlerin bir muhabir geni ile değiştirildiği memeli hücrelerinde ifade edilen kendi kendini çoğaltan subgenomik sistemlerdir. Bileşiklerin viral RNA replikasyon üzerindeki inhibitör etkileri, muhabir protein aktivitesindeki azalma ölçülerek kolayca değerlendirilebilir7. Burada, ZIKV replikasyonunun inhibitörlerinin taranırlığında kullanılan protokolleri 96 kuyu plaka biçiminde açıklıyoruz. Replicon tabanlı tahliller bhk-21 ZIKV Rluc replicon hücre hattı kullanılarakgerçekleştirildiyakın zamanda geliştirdiğimiz 8 . Tanımlanan bileşiklerin spesifik hedeflerini karakterize etmek için, florojenik peptit substratını kullanarak rekombinant olarak ifade edilen NS3 proteaz için in vitro floresan bazlı tahliller kurduk, Bz-nKRR-AMC, NS5 RdRp için sentetik biyotinillenmiş kendinden emişli şablonun uzamasını ölçtük 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3'), intercalating boya SYBR Green I kullanarak.
Glisin zengini bir bağlayıcı [G 4 SG 4 ]) tarafından NS3 proteaz etki alanının 1-177 kalıntılarına bağlı ZIKV proteaz(45-96NS2B kofaktör kalıntısı) elde edildi, YFV9için açıklandığı gibi, polimeraz (RdRp etki alanının 276-898 kalıntısı) klonlandı ve10'da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ifade edildi. Her iki enzim dizisi de GenBank ALU33341.1'den türetilmiştir. Primer antiviral taramalar olarak bileşikler 10 μM'de test edilir ve aktiviteleri %80'≥ gösterenler doza bağımlı bir şekilde değerlendirilir ve bu da etkili/inhibisyon (EC50 veyaIC 50)ve sitotoksik (CC50)konsantrasyonları ile sonuçlanır. Temsili sonuçlar bağlamında, NITD008'in EC50 ve CC50 değerleri, bilinen bir flavivirüs inhibitörü11, replikon bazlı taramalardan gösterilmiştir. Enzmatik tahliller için, antibakteriyel, antifungal ve antiviral aktiviteli 400 molekülden oluşan bir kütüphane olan MMV/DNDi Pandemi Müdahale Kutusu'ndan iki bileşiğin IC50 değerleri gösterilmiştir. Bu çalışmada açıklanan protokoller, diğer ilgili flavivirüslerin inhibitörlerini taramak için değiştirilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3&#39;</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>-</td>
			<td>100 ng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K12-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Microplate</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K4-9610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMC (7-amine-4-methylcoumarine)</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>257370</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>A1153</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>JenaBioscience</td>
			<td>NU-1010-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bz-nKRR-AMC</td>
			<td>International Peptides</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biohazard Safety Cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3760091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td>Disulfate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 tetrahydrate</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>203734</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M6494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NITD008 &#8805;98% (HPLC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML2409</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR system Mx3000P</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renilla luciferase Assay System</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7563</td>
			<td>500 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution 1X</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>59417-C</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput antiviral assays to screen for inhibitors of zika virus replication

Antiviral ilaç keşfi, yüksek verimli tarama (HTS) formatlarında gerçekleştirilebilen güvenilir biyokimyasal ve hücresel tahlillerin geliştirilmesini gerektirir. Flavivirüs yapısal olmayan (NS) proteinlerin endoplazmik retikül (ER) membranlar üzerinde birlikte bir araya getirilerek replikasyon kompleksini (RC) oluşturduğu düşünülmektedir. NS3 ve NS5, RC'nin en çok çalışılan enzimleridir ve viral genom replikasyonunda önemli rolleri nedeniyle ilaç gelişimi için ana hedefleri oluşturmaktadır. Kofaktör olarak NS2B gerektiren NS3 proteaz etki alanı, olgunlaşmamış viral poliproteinin olgun NS proteinlerine bölünmesinden sorumludur, NS5 RdRp etki alanı ise RNA replikasyondan sorumludur. Burada, Zika virüsü (ZIKV) replikasyonunun inhibitörleri için büyük bileşik kütüphaneleri test etmek için replikon tabanlı taramalarda ve enzymatic tahlillerde kullanılan protokolleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Replikonlar, viral yapısal genlerin bir muhabir geni ile değiştirildiği memeli hücrelerinde ifade edilen kendi kendini çoğaltan subgenomik sistemlerdir. Bileşiklerin viral RNA replikasyon üzerindeki inhibitör etkileri, muhabir protein aktivitesindeki azalma ölçülerek kolayca değerlendirilebilir. Replikon bazlı taramalar, Renilla luciferaz'ı muhabir geni olarak ifade eden bhk-21 ZIKV replikon hücre hattı kullanılarak gerçekleştirildi. Tanımlanan bileşiklerin spesifik hedeflerini karakterize etmek için, rekombinant olarak ifade edilen NS3 proteaz ve NS5 RdRp için in-vitro floresan bazlı tahliller kurduk. Viral proteazın proteolitik aktivitesi, florojenik peptit substratı Bz-nKRR-AMC kullanılarak ölçüldü, NS5 RdRp uzama aktivitesi, sentetik biyotinillenmiş kendinden emişli şablon 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') kullanılarak, RNA uzaması sırasında SYBR Green I'in floresan sinyalinin artmasıyla doğrudan tespit edildi.

Burada açıklanan tüm protokoller 96 kuyu plakalarında bıçaklanmıştır ve plakaların ilk ve son sütununa yerleştirilen negatif ve pozitif kontroller de dahil olmak üzere tek bir konsantrasyonun birincil taramasında plaka başına 80 bileşiğin değerlendirilmesine izin verir. Replikon tabanlı taramalar, BHK-21-RepZIKV_IRES-Neohücre hattını elde etmek için geliştirilen RNA yapısı ( Şekil1A), tahlil şematik gösterimi ( Şekil<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication at JoVE.com

High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication

Bu çalışmada, Zika virüsü replikasyonunun inhibitörlerini yüksek verimli bir tarama formatında taramak için replikon bazlı ve viral enzim bazlı tahlillerde kullanılan protokolleri açıklıyoruz.

Zika Virüs Replikasyonunun inhibitörlerini taramak için yüksek verimli Antiviral Tahliller

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) ...

Bu prosedürlerin genel amacı, Zika virüsü replikasyonunun inhibitörlerini, replikon bazlı ve/veya viral enzim bazlı bir tahlil kullanarak yüksek verimli bir tarama formatında taramaktır. Antiviral ilaç keşfi, yüksek verimli tarama formatlarında gerçekleştirilebilecek güvenilir hücresel ve biyokimyasal tahlillerin geliştirilmesini gerektirir. Replikon bazlı taramalar ve viral enzim bazlı tahliller, küçük molekül bileşiklerini Zika virüsünün inhibitörleri olarak test etmek için iki değerli stratejidir.Replikonlar, viral yapısal genlerin bir muhabir geni ile değiştirildiği memeli hücrelerinde ifade edilen kendi kendini çoğaltan subgenomik sistemlerdir. Laboratuvarımızda, bebek hamster BHK-21 hücre hatlarında saplanarak ifade edilen Renilla luciferaz da dahil olmak üzere bir Zika virüsü replikon sistemi geliştirdik. Bileşiklerin viral RNA replikasyon üzerindeki inhibitör etkileri, luciferaz aktivitesindeki azalma ölçülerek kolayca değerlendirilebilir.Tanımlanan bileşiklerin spesifik hedeflerini karakterize etmek için, rekombinant olarak ifade edilen NS3 proteaz ve NS5 RNA bağımlı RNA polimeraz için in vitro floresan bazlı tahliller kurduk, RdRp. Zika viral replikon hücrelerini yüzde 70 ila 90 izdihama ulaşana kadar kült ederek başlayın. Steril bir laminar akışta, ortamı şişeden çıkarın ve atın.Şişeye beş mil trypsin-EDTA ekleyin. Tripsin çözeltisini hücrelerin üzerine yayın ve hücrelerin ayrılması için şişeyi beş ila 10 dakika bekletin. Yeniden dirilen hücreleri hasat edin ve steril 50 mil tüpe yerleştirin ve beş dakika boyunca 125G santrifüjleyin.Üstnatantı attıktan sonra, hücreleri sayım için beş mil DMEM%10 FBS'de yeniden biriktirin. Hücreleri kuyu başına iki kez 10 ila dört olarak ayarlayın ve 96 kuyu plakasına tohumlayın. Daha sonra plakayı 37 santigrat derecede 16 saat boyunca co2 nemlendirici inkübatörde kuluçkaya yatırın.Daha sonra ortamı atın ve kuyu başına 100 mikrolitre DMEM 2%FBS ekleyin. Test ortamında 10 mikromoler ve% 1 DMSO'luk son konsantrasyonla sonuç vermek için kuyu başına bir mikroliter ekleyin. İlk ve son sütunda, pozitif ve negatif kontrolü hazırlayın.Plakayı 37 santigrat derecede 48 saat boyunca co2 nemlendirici inkübatörde kuluçkaya yatırın. Renilla luciferaz lizis tamponu üretim talimatlarına göre reaktifte hazırlayın. Süpernatantı hücrelerden attıktan sonra kuyu başına 25 mikrolitre Renilla luciferase lyse tamponu ekleyin.Beyaz opak 96 kuyu plakasına kuyu başına 100 mikrolitre Renilla luciferase test reaktifi ekleyin. Hücre lilatının 20 mikrolitresini beyaz plakaya aktarın ve ardından luminometredeki lüminesans sinyallerini okuyun. MTT tahlil için, prosedür daha önce göstermiştir ve bileşik inkübasyondan sonra hücrelere MTT çözeltisinin kuyusu başına 10 mikrolitre ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede bir CO2 nemlendiricide 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.Süpernatantı atın ve her kuyuya 100 mikrolitre DMSO ekleyin ve ardından yukarı ve aşağı pipetleme yaparak formazan kristallerini çözün. Emicileri spektrofotometrede 570 nanometrede okuyun. Malzemeleri buz üzerinde çözdükten sonra, kuyu başına dört nanomolar nihai konsantrasyona ulaşmak için uygun miktarda protein seyreltme hazırlayın.96 kuyulu beyaz bir plakada, her kuyuya 84 mikrolitre test tamponu dağıtın. Bir kontrol reaksiyonunu hazırlamak için plakanın ilk sütununa bir mikroliter DMSO ekleyin. Plakaya 10 mikromolar nihai konsantrasyona ulaşmak için test edilen bileşiklerden bir mikroliter ekleyin.Kontroller hariç olmak üzere proteaz çözeltisinin kuyusu başına beş mikrolitre dağıtın ve plakayı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Reaksiyonu başlatmak için kuyulara 10 mikrolitre florojenik substrat stok çözeltisi dağıtın. Uygun parametrelerde ayarlanmış bir florometre kullanarak reaksiyonlarını takip edin.Bu seans için tüm reaktifler DEPC arıtmalı su ile hazırlanmalıdır. Poliuridin RNA'yı bir termal çevrimde beş dakika boyunca 55 Santigrat derece inkübe ederek tavlayın. Malzemeleri buz üzerinde çözün ve proteini seyrelterek test tamponunda 250 nanomolar'lık son konsantrasyona ulaşın.SYBR Green I çözelti tahlil tamponunu hazırlayın ve ardından SıRASıYLA bir milimolar ve 300 nanomolar son konsantrasyona ATP ve anealed RNA ekleyin. Bir PCR plakasında, seyreltilmiş proteinin 24,5 mikrolitresini sütunlara bir ila 11 ekleyin. Kalan kuyulara aynı miktarda test arabelleği ekleyin.10 mikromolar nihai konsantrasyona ulaşmak için kuyu başına 0,5 mikrolitre bileşik ve kontrol ekleyin. 15 dakika kuluçkadan sonra, substrat çözeltisinin 25 mikrolitresini ekleyerek reaksiyona başlayın ve plakayı kapatın. Fam filtresi kullanarak 30 santigrat derecede inkübe edilmiş gerçek zamanlı bir PCR sistemindeki reaksiyonun ardından.Şekil 1A'da, Zika viral replikon hücre hatlarını elde etmek için geliştirilen RNA yapının şematik bir temsilini görüyoruz, bu da Rluc geninin yapısal dizilerin ve 3'end'e yerleştirilen IRES yeni kasetinin yerini aldığını gösteriyor. Ayrıca in vitro transkripsiyon için hepatit delta virüs ribozim dizisinde ve sırasıyla otantik 3'end ve RNA transkriptinin üretimi için bir T7 promotörü içerir. Şekil 1B'de, replikon tabanlı hücre testinin şematik bir gösterimini görüyoruz.Şekil 1C'de, Rluc replicon sistemi kullanılarak elde edilen belirli bir bileşiğin doz-tepki eğrilerini ve sitotoksiklik eğrilerini görüyoruz. Şekil 2A'da, NS2B-NS3 proteazının aktivitesini belirlemek için kullanılan testin şematik bir gösterimini görüyoruz. Şekil 2B'de, NS2B-NS3 proteazını hedefleyen belirli bir inhibitörün doz-yanıt eğrisini görüyoruz.Şekil 2C'de, NS5 RdRp etkinliğini belirlemek için kullanılan uzama testinin şematik bir gösterimini görüyoruz. Şekil 2D'de, Zika virüsü RdRp aktivitesini hedefleyen belirli bir inhibitörün doz-yanıt grubunu görüyoruz. Gösterilen prosedürler, 384 veya 1, 536 kuyu formatlarındaki taramalar için kolayca uyarlanabilir.Replikon bazlı yüksek verimli taramalar için, 5'uçta bir Renilla luciferaz dizisi içeren çoğaltıcı bir Zika virüsü replikononu ve ayrıca 3'lü uçta bir iç ribozomal giriş bölgesi tarafından yönlendirilen bir neomisin fosfotransferaz geni içeren kararlı bir hücre hattı geliştirdik. Yapısal genlerin eksikliği nedeniyle, replikonlar soy virionları üretmez. Böylece, laboratuvar edinilmiş viral enfeksiyon riskini ortadan kaldırır.Ayrıca rekombinant NS3 proteaz ve NS5 RdRp için viral enzim bazlı tahlillerde kullanılan prosedürleri de gösterdik. Viral proteazın proteolitik aktivitesi, Floresan stok aminometilcoumarin ile birleştiğinde Zika virüsü proteaz tanıma ve bölünme dizilerini içeren florojenik peptit substrat kullanılarak ölçüldü. NS5 RNA'ya bağımlı RNA polimeraz ile ilgili olarak, uzama aktivitesi SYBR Green I.'ın floresan sinyalinin artmasıyla doğrudan tespit edilir.Bu uygulama, doğrudan ölçüm ve uygun fiyatlılık, kullanıcının floresan tabanlı yöntemlerinin yüksek verimli tarama platformları olarak önemli noktalarıdır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Fenotipinin yüksek verim Deneyi<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika virüs belirli tanılama Epitope bulma

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...