Name: confocal laser scanning microscopy-based quantitative analysis of aspergillus fumigatus conidia distribution in whole-mount optically cleared mouse lung
Uploaded: 2021-09-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung at Jo

Författarna tackar professor Sven Krappmann (Universitetssjukhuset Erlangen och FUA Erlangen-Nürnberg, Tyskland) för att de förser Aspergillus fumigatus conidia-stammen AfS150. Författarna tackar MIPT Press Office. V.B. erkänner Ryska federationens ministerium för vetenskap och högre utbildning (#075-00337-20-03, projekt FSMG-2020-0003). Arbetet med A. fumigatus conidia imaging och quantification stöddes av RSF nr 19-75-00082. Arbetet med luftvägsavbildning stöddes av RFBR nr 20-04-60311.

Alla metoder för försöksdjur som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences (protokollnummer 226/2017).
1. A. fumigatus conidia ansökan
<ol><li>För att erhålla fluorescerande märkt A. fumigatus conidia, fixera 5 × 108 conidia genom att tillsätta 1 ml 3% paraformaldehyd till konidialkulleten. Inkubera i ett 50 ml provrör i ...

<ol>
	<li>O'Gorman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airborne+Aspergillus+fumigatus+conidia:+A+risk+factor+for+aspergillosis.">Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis.</a> Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).</li><li>Hyde, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asthma:+A+comparison+of+animal+models+using+stereological+methods.">Asthma: A comparison of animal models using stereological methods.</a> European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).</li><li>Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+nested+developmental+waves+demarcate+a+compartment+boundary+in+the+mouse+lung.">Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+drug-aerosol+delivery+in+the+human+respiratory+system.">Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).</li><li>Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia+and+mucociliary+clearance.">Cilia and mucociliary clearance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, E., Salar-Behzadi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+assessment+of+inhaled+nanoparticles:+Role+of+in+vivo,+ex+vivo,+in+vitro,+and+in+Silico+Studies.">Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).</li><li>Patel, V. I., Metcalf, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+macrophage+and+dendritic+cell+subsets+in+the+resting+human+lung.">Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung.</a> Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).</li><li>Bogorodskiy, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+intraepithelial+dendritic+cells+interact+with+phagocytic+cells+during+Aspergillus+fumigatus-Induced+Inflammation.">Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 11, (2020).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus-what+makes+the+species+a+ubiquitous+fuman+fungal+pathogen.">Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen.</a> PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).</li><li>Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenetics+of+chronic+and+allergic+aspergillosis.">Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis.</a> Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).</li><li>Thiesse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+structure+phenotype+variation+in+inbred+mouse+strains+revealed+through+in+vivo+micro-CT+imaging.">Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging.</a> Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).</li><li>Tochigi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+implications+of+Aspergillus+infection+in+lung.">Histopathological implications of Aspergillus infection in lung.</a> Mediators of Inflammation. 2013, (2013).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+traps+against+aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+rodA.">Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).</li><li>Shevchenko, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+infection-induced+neutrophil+recruitment+and+location+in+the+conducting+airway+of+immunocompetent,+neutropenic,+and+immunosuppressed+mice.">Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice.</a> Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).</li><li>Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+optical+clearing,+three-dimensional+imaging,+and+computer+morphometry+in+whole+mouse+lungs+and+human+airways.">Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).</li><li>Amich, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+light+sheet+fluorescence+microscopy+of+lungs+to+dissect+local+host+immune-aspergillus+fumigatus+interactions.">Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions.</a> mBio. 11 (1), (2020).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+cell-level+analysis+of+tissues+with+Ce3D+multiplex+volume+imaging.">High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging.</a> Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).</li><li>Ert&#252;rk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cleared+intact+biological+systems+at+a+cellular+level+by+3DISCO.">Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO.</a> J Vis Exp. (89), e51382 (2014).</li><li>Kuhn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+stores+in+rodent+lungs:+Localization+to+Clara+and+type+II+alveolar+cells.">Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells.</a> Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).</li></ol>

Helorgan 3D-avbildning tillåter erhållande av data utan dissekering av provet, vilket är av stor betydelse för att undersöka de rumsliga aspekterna av patogenens anatomiska fördelning i organismen. Det finns flera tekniker och modifieringar av vävnad optisk clearing som hjälper till att övervinna laserljusspridning och tillåta helorgansavbildning15,16,18,19. En av de anpassade vävnad...

Dagligen andas människor in luftburna patogener, inklusive sporer av opportunistiska svampar Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) som kan tränga in i andningsorganen1. Luftvägarna hos däggdjur är ett system av luftvägar i olika generationer som kännetecknas av de olika strukturerna i luftvägarna väggar2,3,4. Tracheobronchial väggar består av flera celltyper bland vilka är ciliated celler som ger mucociliary clearance5. I alveolerna finns inga cilierade celler och de genomträngande alveolära rymdpatogenerna kan inte elimineras genom mucociliary clearance6. Dessutom är varje luftvägsgenerering en nisch för flera immuncellpopulationer och delmängder av dessa populationer är unika för vissa luftvägsfack. Således finns alveolära makrofager i de alveolära facken, medan både luftstrupen och ledande luftvägar är fodrade med de intraepitheliala dendritiskacellerna 7,8.
Den ungefärliga storleken på A. fumigatus conidia är 2-3,5 μm9. Eftersom diametern på små luftvägar hos människor och även hos möss överstiger 3,5 μm, föreslogs det att konidia kan tränga in i det alveolära utrymmet2,10,11. I själva verket visade histologisk undersökning svamp tillväxt i alveol av de patienter som lider av aspergillos12. Conidia upptäcktes också i alveol av infekterade möss med levande avbildning av de tjocka lungskivorna13. Samtidigt upptäcktes conidia i den luminala sidan av bronkial epitel av möss14.
Tredimensionell (3D) avbildning av de optiskt rensade helmonterade mus lungorna tillåter morfometrisk analys av luftvägarna15. Särskilt den kvantitativa analysen av visceral pleura nerv distribution utfördes med hjälp av optiskt rensade mus lung exemplar15. Nyligen undersökte Amich et al.16 svamptillväxten efter intranasal applicering av conidia på immunkomprometterade möss med hjälp av en ljus-ark fluorescensmikroskopi av optiskt rensade mus lungprover. Den exakta platsen för vila conidia i luftvägarna vid olika tidpunkter efter infektionen är viktigt för att identifiera cellpopulationerna som kan ge tillräckligt svampdödande försvar i vissa faser av inflammation. Men på grund av den relativt lilla storleken är spatio-temporala aspekter av A. fumigatus conidia distribution i luftvägarna dåligt karakteriserade.
Här presenterar vi en experimentell inställning för kvantitativ analys av A. fumigatus conidia distribution i luftvägarna hos infekterade möss. Med hjälp av fluorescerande konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) av optiskt rensade lungor av möss som fick en oropharyngeal tillämpning av fluorescerande märktA A. fumigatus conidia, får vi 3D-bilder och utför bildbehandlingen. Med hjälp av 3D-avbildning av hela berget lunglob har vi tidigare visat fördelningen av A. fumigatus conidia i den ledande luftvägarna hos möss 72 timmar efter conidiaansökan 8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 NHS Ester</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspergillus fumigatus conidia</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>46645</td>
			<td>The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141081.1611</td>
			<td>98.0-100 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC10586-0010</td>
			<td>99+%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6 mice</td>
			<td>Pushchino Animal Breeding Centre (Russia)</td>
			<td></td>
			<td>Male. 12 - 30 week old.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catheter</td>
			<td>Venisystems</td>
			<td>G715-A01</td>
			<td>18G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell imaging coverglass-bottom chamber</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742028</td>
			<td>4 or 8 well chamber with coverglass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Any centrifuge provided 1000 g can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td>&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI image processing package</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>Free software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>B. Braun Aesculap</td>
			<td>BD557R</td>
			<td>Toothed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>B. Braun Aesculap</td>
			<td>BD321R</td>
			<td>Fine-tipped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>1727</td>
			<td>Smooth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle</td>
			<td>DURAN</td>
			<td>242101304</td>
			<td>With groung-in lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphic Editor Photoshop</td>
			<td>Adobe Inc</td>
			<td></td>
			<td>Adobe Photoshop CS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Prism 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Microscopy Imaging Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Free trial is avalable https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Karizoo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>420640-9800-000</td>
			<td>&#160;Plan-Apochromat, 10 &#215; (NA = 0.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Paneco</td>
			<td>P060&#928;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>ProLine</td>
			<td>722020</td>
			<td>5 to 50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powdered milk</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample mixer</td>
			<td>Dynal</td>
			<td>MXIC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>BC257R</td>
			<td>Blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Apexlab</td>
			<td>GS-20</td>
			<td>50-300 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skalpel</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>12646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk thread</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>3 USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>50050</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl aminomethane)</td>
			<td>Helicon</td>
			<td>H-1702-0.5</td>
			<td>&#160;Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>Am-O694-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN microscope software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEN2012 SP5</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy-based quantitative analysis of aspergillus fumigatus conidia distribution in whole-mount optically cleared mouse lung

Aspergillus fumigatus conidia är luftburna patogener som kan tränga in i mänskliga luftvägar. Immunkompetenta personer utan allergier uppvisar resistens och immunologisk tolerans, medan konidia hos immunkomprometterade patienter kan kolonisera luftvägarna och orsaka allvarliga invasiva andningsstörningar. Olika celler i olika luftvägsfack är involverade i immunsvaret som förhindrar svampinvasion; Spatio-temporala aspekter av patogen eliminering är dock fortfarande inte helt förstådda. Tredimensionell (3D) avbildning av optiskt rensade helmonterade organ, särskilt lungorna hos experimentella möss, tillåter påvisande av fluorescerande märkta patogener i luftvägarna vid olika tidpunkter efter infektion. I den aktuella studien beskriver vi en experimentell installation för att utföra en kvantitativ analys av A. fumigatus conidia distribution i luftvägarna. Med hjälp av fluorescerande konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM), spårade vi platsen för fluorescerande märkt konidia i bronkial grenar och alveolar fack 6 timmar efter oropharyngeal ansökan till möss. Metoden som beskrivs här användes tidigare för att upptäcka den exakta patogen plats och identifiering av patogen-interagerande celler i olika faser av immunsvaret. Den experimentella inställningen kan användas för att uppskatta kinetiken för patogeneliminering under olika patologiska förhållanden.

Enligt protokollet ovan erhölls 3D-bilden som visar luftvägarna och A. fumigatus conidia i en muss lunglob (figur 1A). Streptavidin (som användes för luftvägsvisualisering) märkt bronkial och bronkioler15. Dessutom visualiseras de stora fartygen, som lätt kan särskiljas från luftvägarna genom sin morfologi, och lungsäcken i luftvägskanalen (figur 1A-C). Skapandet av luftvägsytan och masken tillät av...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung at Jo

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

Vi beskriver metoden för kvantitativ analys av fördelningen av Aspergillus fumigatus conidia (3 μm i storlek) i luftvägarna hos möss. Metoden kan också användas för analys av mikropartiklar och nanopartikel agglomeratfördelning i luftvägarna i olika patologiska tillståndsmodeller.

Konfokal laserskanning mikroskopibaserad kvantitativ analys av Aspergillus fumigatus Conidia-distribution i helfästet optiskt rensad muslunga

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and ...

Vårt tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att utföra den kvantitativa analysen av en Aspergillus fumigatus Conidia-fördelning i helmonterad optiskt rensad muslunga. Aspergillus fumigatus Conidia kan penetrera luftvägarna och orsaka livshotande sjukdomar hos immunkomprometterade patienter. Däggdjurens andningsorgan är ett system av luftvägar av olika generationer.Varje generation kännetecknas av de olika strukturerna i luftvägsväggar och immuncellpopulationer. I bronkial grenar, aspergillus fumigatus Conidia elimineras genom mucociliary clearance. Men i tillgängligt utrymme fungerar inte mucociliary clearance och Conidia måste rensas av immuncellerna, såsom alveolära makrofager och neutrofiler.Liksom de rumsliga temporala aspekterna av Conidia-distributionen i luftvägarna är viktiga. Emellertid inte ordentligt undersökt fråga i förståelsen av sjukdomsmekanismerna. Här presenterar vi en experimentell inställning för kvantitativ analys av Aspergillus fumigatus Conidia distribution i luftvägarna hos infekterade möss.Jag applicerar 50 mikroliter märkta Aspergillus fumigatus Conidia på musen. Sex timmar senare, skörda lungan. Fixa över natten i 2%formaldehyd och fläck med märkt Streptavidin konjugat.Låt sedan provet utsättas för optisk röjning. Placera provet i glasflaskan fylld med 50% metanolvattenlösning och placera det på provblandaren vid rumstemperatur i en timme. Ersätt 50% metanol med 100% metanol och lägg den under provblandaren i två timmar.Förbered en blandning bestående av en del bensylalkohol och två delar bensylbensoat. Överför provet till den 24 brunnsplatta och täck den med bensylbensoatblandningen i minst 30 minuter. Provet är klart för avbildning.Lägg provet på provhållaren. Och placera hållaren i mikroskopet. När du har tytt på och öppnat programvaran slår du på överföringslampan och väljer ett X-mål.Lokalisera provet visuellt i överföringslampan och fortsätt till förvärvsfliken. Välj confocal lasermikroskopi Lambda-läge. Slå på lämpliga lasrar.Ställ in detektorns spektralområde och välj den tärande spegeln. Justera detektorns förstärkning och begränsa stifthålet till en områdesenhet. Ställ in pixelupplösningen på 512 med 512.Slå på zed-stack-läget och starta live-avbildning. Hitta fokalplanet där båda tärningarna är synliga. Expandera zed-stack-panelen.Använd fokuseringshjulet och hitta och välj de lägsta och högsta planen i provet. Placera brännplanet bredvid provets botten. Stäng av zed-stack-läget och slå på skanningsläget.Justera vid behov X- och Y-läge och antal brickor. Aktivera zed-stack- och uppringningslägen. Ställ in zed-sektioneringssteget på fem mikron.Ställ in skanningshastigheten. Starta experimentet. Avbildning tar vanligtvis flera timmar beroende på landstorlek och skanningshastighet.Den erhållna bilden blandas sedan spektroellt. För spektral unmixing, använd linjär blandningsalternativ. Välj de regioner som motsvarar de landområden som är märkta med streptavidin och Conidia.Börja blanda. När du har avblandat spara den omixade filen. Öppna bilden om du vill stich-plattor från den erhållna bilden.Välj metoder, geometrisk sömmar. Markera bilden i inmatningsfönstret. I sömningsalternativ väljer du nytt utgångs- och säkringsplattor.Använd referensläge med vald kanal som motsvarar luftvägarna fluorescens. Öppna bilden i en överskotts-3D-vy. Ändra vid behov färger som används för presentationen.Här visar vi luftvägarna kanal i grå nyanser och Conidia kanal i lila. Om du vill skapa en luftvägsmask använder du lägg till ett nytt ytverktyg. Välj luftvägskanal och välj utjämningsparametern på 10 mikron.Olika filter kan användas för att utesluta luftvägssignal. Inspektera först ytan visuellt och ställ in intensitetströskeln. Ytterligare filter, som yta kan också appliceras på uteslutande utvalda luftvägar, men inte lungsäck eller blodkärl.Ta sedan bort det markerade ytfragmentet manuellt som inte tillhör luftvägarna. Nu kan du observera den skapade ytan och undersöka de saknade delarna för att korrigera dem senare. Skapa en mask för luftvägarna med hjälp av alternativ redigera och maskera alla.Välj luftvägskanalen och ställ in arbetsceller utanför ytan på 0,001. Här visade vi den resulterande masken i orange. Spara Conidia-kanalen och luftvägsmasken i två separata mappar, som T of F-serien.Öppna filen med luftvägsmaskbilden. Gör bilden binär. Följ process binär, gör binär.För att likna masktjockleken, applicera flera dilaterade 3D-funktioner. Följ plugins, bearbeta, vidga 3D. Du kan också använda makrofunktioner för att göra detta.Använd funktionen fyllningshål efter flera cykler av dilateringsprocess. Följ process, binär, fyll hål. För att fylla de återstående hålen i masken manuellt, öppna intressehanterarens region.följ analys, verktyg, ROI-chef. Använd polygonmarkeringsverktyget och välj ett område som ska fyllas med en viss projektion. Gör detta flera gånger för få projektioner i zed-stack så att du kan interpolera former av de regioner som är av intresse.Om du vill interpolera de markerade formerna markerar du dem alla och trycker på mer, interpolerar ROI:er. Fyll sedan alla ROM-skivor med vitt. Använd fyllningshålsproceduren igen.För att återmontera masktjockleken tillbaka efter att ha fyllt hålen, applicera erode 3D-funktionen. Följ plugins, bearbeta, erodera 3D. Du kan också använda mikroer för detta.Antalet iterationer i eroderad 3D och LA 3D bör vara lika. Starta Conidia count-programmet. Tryck på knappen Lägg till filer och välj mapparna med DIFF-filer med den förberedda luftvägsmasken och Conidia fluorescensbilderna.Ange ett anpassat tröskelvärde mellan noll och ett. Tryck på OK och se resultatet. Med hjälp av detta tillvägagångssätt utför vi den kvantitativa analysen av Conidia inuti och utanför bronkialträdet hos möss sex timmar efter Conidia-applikationen.Uppgifterna tyder på att majoriteten av Conidia vid vår ursprungliga tillämpning tränger in i alveolautrymmet och tilldelas där i början av det inflammatoriska immunsvaret. Tredimensionell avbildning av mus lungorna med confocal laser scanning mikroskopi gör det möjligt att identifiera Aspergillus fumigatus Conidia i luftvägarna. Bearbetning av tredimensionella bilder med detta protokoll tillåter att utföra kvantitativ analys av Conidia-distributionen inom och utanför bronkialgrenarna.Vårt tillvägagångssätt kan också användas för att uppskatta kinetiken i Conidia eliminering från bort från möss och för att jämföra anatomisk Conidia fördelning i immunkompetenta och immunkomprometterade möss. Dessutom, med hjälp av denna metod, kan man analysera fördelningen av mikropartiklar eller nanopartiklar agglomerates i luftvägarna.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering av Dendritiska Mouse lungceller

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av mjälte: Kvantitativ analys av Parasit Rörlighet och blodflöde

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila yttre membranvesiklar: Isolering och analys av deras pro-inflammatoriska Potential på makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

Human Lung dendritiska celler: Spatial distribution och fenotypisk identifiering i bronkerna Biopsier Använda Immunohistokemi och flödescytometri

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live avbildning antimykotiskt av humana primära neutrofiler och monocyter som svar på<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optiska Screening av nya bakterier-specifika sonder på Ex Vivo mänsklig lungvävnad av Confocal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisera makrofag extracellulära fällor med konfokalmikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Bedömning av den cytotoxiska och immunmodulerande effekter av ämnen i Human Precision-cut Lung skivor

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Induktion av mus lung skada genom endotrakeal injektion av bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Mätning av fagocytos av Aspergillus fumigatus conidia av humana leukocyter med flödescytometri

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...