Name: tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating cd8+ t cells in mice
Uploaded: 2021-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice at JoVE.com

Diese Studie wurde durch Zuschüsse des National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (Nr. 31825011 an LY) und der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31900643 an QH, Nr. 31900656 an ZW) unterstützt.

Alle Mausversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care and Use Committees der Third Military Medical University durchgeführt. Verwenden Sie 6-8 Wochen alte C57BL/6-Mäuse und naive transgene OT-I-Mäuse mit einem Gewicht von 18-22 g. Verwenden Sie sowohl männlich als auch weiblich ohne Randomisierung oder "Verblindung".
1. Herstellung von Medium und Reagenzien
<ol><li>Bereiten Sie das Zellkulturmedium D10 wie zuvor beschrieben29</su...

<ol>
	<li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+'T+cell+exhaustion.">Defining 'T cell exhaustion.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).</li><li>Leko, V., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+targeting+human+tumor+antigens+for+T+cell-based+immunotherapy+of+solid+tumors.">Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors.</a> Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).</li><li>McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection+and+cancer.">CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer.</a> Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).</li><li>Davis, M. M., Brodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebooting+human+immunology.">Rebooting human immunology.</a> Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Releasing+the+brakes+on+cancer+immunotherapy.">Releasing the brakes on cancer immunotherapy.</a> Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).</li><li>Verma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+in+subprimed+CD8+cells+induces+dysfunctional+PD-1(+)CD38(hi)+cells+and+anti-PD-1+resistance.">PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance.</a> Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+exhaustion+in+chronic+infection+and+cancer:+opportunities+for+interventions.">CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions.</a> Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).</li><li>Dammeijer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PD-1/PD-L1-checkpoint+restrains+T+cell+immunity+in+tumor-draining+lymph+nodes.">The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes.</a> Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).</li><li>Buchwald, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+node+is+important+for+a+robust+abscopal+effect+stimulated+by+radiotherapy.">Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).</li><li>Philip, M., Schietinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+fate+choice:+T+cell+exhaustion+in+cancer+and+chronic+infections.">Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections.</a> Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).</li><li>Miller, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets+of+exhausted+CD8(+)+T+cells+differentially+mediate+tumor+control+and+respond+to+checkpoint+blockade.">Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade.</a> Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).</li><li>Wu, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+T+cell+expansion+predicts+tumour+infiltration+and+clinical+response.">Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response.</a> Nature. 579, 274-278 (2020).</li><li>Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1++stemlike+CD8+T+cells+are+resident+in+lymphoid+tissues+during+persistent+LCMV+infection.">PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).</li><li>Beltra, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+relationships+of+four+exhausted+CD8(+)+T+cell+subsets+reveals+underlying+transcriptional+and+epigenetic+landscape+control+mechanisms.">Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms.</a> Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).</li><li>Myers, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+subset+of+CD8(+)+T+cells+during+chronic+exhaustion+is+defined+by+SIRPalpha+expression.">A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression.</a> Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).</li><li>Jansen, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intra-tumoral+niche+maintains+and+differentiates+stem-like+CD8+T+cells.">An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells.</a> Nature. 576, 465-470 (2019).</li><li>Jadhav, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signature+of+PD-1++TCF1++CD8+T+cells+that+act+as+resource+cells+during+chronic+viral+infection+and+respond+to+PD-1+blockade.">Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+CD8+T+cells+form+a+proliferative,+dynamically+regulated+compartment+within+human+melanoma.">Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma.</a> Cell. 176 (4), 775-789 (2018).</li><li>Kurtulus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoint+blockade+immunotherapy+induces+dynamic+changes+in+PD-1(-)CD8(+)+tumor-infiltrating+T+cells.">Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells.</a> Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).</li><li>Fransen, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+nodes+are+pivotal+in+PD-1/PD-L1+checkpoint+therapy.">Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy.</a> JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).</li><li>E, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)CXCR5(+)+T+cells+in+tumor-draining+lymph+nodes+are+highly+activated+and+predict+better+prognosis+in+colorectal+cancer.">CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer.</a> Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).</li><li>Snell, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cell+priming+in+established+chronic+viral+infection+preferentially+directs+differentiation+of+memory-like+cells+for+sustained+immunity.">CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity.</a> Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).</li><li>Siddiqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+)+T+cells+with+stem-like+properties+promote+tumor+control+in+response+to+vaccination+and+checkpoint+blockade+immunotherapy.">Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy.</a> Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+TCF1+preserves+the+effector+function+of+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection.">The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+CD8+T+cells+mediate+response+of+adoptive+cell+immunotherapy+against+human+cancer.">Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer.</a> Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).</li><li>Yost, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+replacement+of+tumor-specific+T+cells+following+PD-1+blockade.">Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade.</a> Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).</li><li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+in+oncoimmunology.">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl6+preserves+the+suppressive+function+of+regulatory+T+cells+during+tumorigenesis.">Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis.</a> Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).</li><li>Yu, D., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portrait+of+CXCR5(+)+follicular+cytotoxic+CD8(+)+T+cells.">A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells.</a> Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).</li><li>Bracci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+enhances+the+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+immune+cells+through+the+induction+of+cytokine+expression,+B-cell+and+T-cell+homeostatic+proliferation,+and+specific+tumor+infiltration.">Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration.</a> Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).</li><li>Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+eradicates+murine+immunogenic+tumor+coding+for+a+non-self-antigen+and+induces+antitumor+immunity.">Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity.</a> International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).</li><li>Thorsson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+landscape+of+cancer.">The Immune landscape of cancer.</a> Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).</li></ol>

T-Zell-vermittelte Immunität spielt eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort gegen Tumore, wobei CTLs die führende Rolle bei der Ausrottung von Krebszellen spielen. Die Ursprünge von tumorantigenspezifischen CTLs innerhalb von TME wurden jedoch nicht aufgeklärt30. Die Verwendung dieses Tumortransplantationsprotokolls hat einen wichtigen Hinweis darauf geliefert, dass intratumorale antigenspezifische CD8+ T-Zellen trotz der Existenz stammartiger TCF1+ Vorläufer-CD8+ ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.

Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

CD8+ T-Zell-vermittelte Immunantwort spielt eine zentrale Rolle bei der Kontrolle des Tumorwachstums. Während der Tumorentstehung werden naive CD8+ T-Zellen bei Antigenerkennung in einer MHC-Klasse I-eingeschränkten Weise aktiviert und differenzieren anschließend in Effektorzellen und infiltrieren in Tumormasse 1,2. Innerhalb der Tumormikroumgebung (TME) treiben jedoch eine längere Antigenexposition sowie immunsuppressive Faktoren infiltrierte tumorspezifische CD8+ T-Zellen in einen hyporesponsiven Zustand, der als "Erschöpfung" bezeichnet wird3. Erschöpfte T-Zellen (Tex) unterscheiden sich von Effektor- oder Gedächtnis-T-Zellen, die bei akuten Virusinfektionen sowohl transkriptionell als auch epigenetisch erzeugt werden. Diese Tex-Zellen zeichnen sich hauptsächlich durch die anhaltende und erhöhte Expression einer Reihe von hemmenden Rezeptoren sowie den hierarchischen Verlust von Effektorfunktionen aus. Darüber hinaus führt die beeinträchtigte proliferative Kapazität erschöpfter CD8+ T-Zellen zu einer abnehmenden Anzahl tumorspezifischer T-Zellen, so dass die verbleibenden CD8+ T-Zellen innerhalb der TME kaum eine ausreichende schützende Immunität gegen Tumorprogressionbieten können 3. Daher ist die Aufrechterhaltung oder Verstärkung von intratumoralen antigenspezifischen CD8+ T-Zellen für die Tumorrepression unverzichtbar.
Darüber hinaus wird angenommen, dass die Therapie der Immun-Checkpoint-Blockade (ICB) Tex in Tumoren wiederbelebt, indem sie die T-Zell-Infiltration und damit die T-Zell-Anzahl erhöht und die T-Zell-Funktionen verjüngt, um die Tumorrepression zu verstärken. Die weit verbreitete Anwendung der ICB-Behandlung hat die Krebstherapielandschaft verändert, wobei eine beträchtliche Untergruppe von Patienten ein dauerhaftes Ansprechen aufweist 4,5,6. Dennoch spricht die Mehrheit der Patienten und Krebsarten nicht oder nur vorübergehend auf ICB an. Eine unzureichende T-Zell-Infiltration in der TME wurde als einer der zugrunde liegenden Mechanismen postuliert, die für den ICB-Widerstand verantwortlich sind 7,8.
Mehrere Studien haben die Heterogenität von tumorinfiltrierenden CD8+ T-Zellen (TILs) sowohl bei Patienten als auch bei Mausmodellen 9,10,11,12 gezeigt. Es wurde bestätigt, dass eine Untergruppe von CD8+ T-Zellen, die T-Zell-1 (TCF1) in einer Tumormasse exprimieren, stammzellähnliche Eigenschaften aufweist, die weiter zu terminalen erschöpften T-Zellen führen könnten und für den Proliferationsausbruch nach ICB-Therapie 12,13,14,15,16,17,18,19,20 verantwortlich sind. 21,22 Es wurde jedoch nachgewiesen, dass nur ein kleiner Teil der antigenspezifischen TCF1 + CD8 + T-Zellen in der TME existiert und einen erweiterten Pool differenzierter Nachkommen als Reaktion auf ICB23,24,25,26 erzeugt. Ob die begrenzte Größe dieser Population ausreicht, um die Persistenz zytotoxischer T-Lymphozyten (CTLs) zur Kontrolle der Tumorprogression sicherzustellen, bleibt unbekannt, und ob es zu einer Auffüllung aus peripheren Geweben kommt, bedarf weiterer Untersuchungen. Darüber hinaus deuten neuere Forschungen auf die unzureichende Wiederbelebungskapazität vorbestehender tumorspezifischer T-Zellen und das Auftreten neuartiger, zuvor nicht existierender Klonotypen nach einer anti-programmierten Zelltodprotein-1-Behandlung hin. Dies deutet darauf hin, dass die Reaktion der T-Zellen auf die Checkpoint-Blockade auf den neuen Zustrom eines ausgeprägten Repertoires von T-Zell-Klonenzurückzuführen sein könnte 27. Zusammen mit dem Vorhandensein von nicht tumorreaktiver zytotoxischer T-Zellfraktion in der TME führten diese Ergebnisse zur Etablierung eines Tumorallotransplantatmodells, um die Rolle von peripherieabgeleiteten CD8 + T-Zellen zu untersuchen11.
Bisher waren verschiedene Arten der Tumorimplantation sowie des adoptiven Transfers von Immunzellen im Bereich der Tumorimmunologieweit verbreitet 28. TILs, mononukleäre Zellen im peripheren Blut und tumorreaktive Immunzellen, die aus anderen Geweben stammen, können mit diesen Methoden gut charakterisiert werden. Bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen systemischer und lokaler Antitumorimmunität scheinen diese Modelle jedoch unzureichend zu sein, um die Interaktionen zwischen Immunzellen, die aus der Peripherie stammen, und der TME zu untersuchen. Hier wurde Tumorgewebe von Spendern in tumorangepasste Empfängermäuse transplantiert, um den Zustrom von Empfänger-abgeleiteten Immunzellen genau zu verfolgen und die von Spendern abgeleiteten Zellen in der TME gleichzeitig zu beobachten.
In dieser Studie wurde ein murines syngenes Modell des Melanoms mit der B16F10-OVA-Melanomzelllinie etabliert, die das Surrogat Neoantigen Ovalbumin stabil exprimiert. TCR-transgene OT-I-Mäuse, bei denen über 90% der CD8+ T-Zellen spezifisch das von OVA abgeleitete Peptid OVA257-264 (SIINFEKL) erkennen, das an das MHC-Molekül H2-Kb der Klasse I gebunden ist, ermöglichen die Untersuchung antigenspezifischer T-Zell-Antworten, die im B16F10-OVA-Tumormodell entwickelt wurden. Durch die Kombination dieses Modells mit der Tumortransplantation wurden die Immunantworten von tumorinhärenten und peripheriebasierten antigenspezifischen CD8+ T-Zellen verglichen, um einen dynamischen Übergang zwischen diesen beiden Populationen zu zeigen. Insgesamt hat dieses experimentelle Design einen weiteren Ansatz zur präzisen Untersuchung der Immunantworten von CD8 + T-Zellen in der TME geliefert, was ein neues Licht auf die Dynamik tumorspezifischer T-Zell-Immunantworten in der TME wirft.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe</td>
			<td>KDL</td>
			<td>BB000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 U insulin syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>320310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>BEAVER</td>
			<td>43008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>240486-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45.1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>110714</td>
			<td>Clone:A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10-OVA cell line</td>
			<td>bluefbio</td>
			<td>BFN607200447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-V (bovine serum albumin)</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0292P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562895</td>
			<td>Clone:104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BEAVER</td>
			<td>43701/43702/43703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R-A462/5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0768-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>EDS-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>PorLab Scientific</td>
			<td>HM330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>RWD life science</td>
			<td>R510-22-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501195-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle carrier</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F31034-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501569-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0099-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse TCR V&#945;2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127808</td>
			<td>Clone:B20.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100734</td>
			<td>Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F12005-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12003-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture thread</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F34004-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating cd8+ t cells in mice

T-Zell-vermittelte Immunität spielt eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort gegen Tumore, wobei zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) die führende Rolle bei der Ausrottung von Krebszellen spielen. Die Entstehung und der Nachschub von Tumorantigen-spezifischen CD8+ T-Zellen innerhalb der Tumormikroumgebung (TME) bleiben jedoch unklar. Dieses Protokoll verwendet die B16F10-OVA-Melanomzelllinie, die stabil das Surrogat-Neoantigen, das Ovalbumin (OVA) und die transgenen OT-I-Mäuse der TCR exprimiert, in der über 90% der CD8+ T-Zellen spezifisch das von der OVA abgeleitete Peptid OVA257-264 (SIINFEKL) erkennen, das an das MHC-Molekül (Major Histocompatibility Complex) der Klasse I H2-Kb gebunden ist. Diese Merkmale ermöglichen die Untersuchung von Antigen-spezifischen T-Zell-Reaktionen während der Tumorgenese.
Durch die Kombination dieses Modells mit der Tumortransplantationschirurgie wurden Tumorgewebe von Spendern in tumorangepasste syngene Empfängermäuse transplantiert, um den Zustrom von vom Empfänger abgeleiteten Immunzellen in transplantiertes Spendergewebe genau zu verfolgen, was die Analyse der Immunantworten von tumorinhärenten und peripheriebedingten antigenspezifischen CD8+ ermöglicht. T-Zellen. Es wurde ein dynamischer Übergang zwischen diesen beiden Populationen festgestellt. Insgesamt hat dieses experimentelle Design einen weiteren Ansatz zur präzisen Untersuchung der Immunantworten von CD8+ T-Zellen in TME geliefert, was ein neues Licht auf die Tumorimmunologie werfen wird.

Der Schaltplan dieses Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Acht Tage nach der Tumorimpfung wurden CD45.1+ und CD45.1+CD45.2+ OT-I-Zellen in B16F10-OVA-tumortragende C57BL/6-Mäuse injiziert. Der Tumor wurde am Tag 8 nach dem Transfer chirurgisch aus CD45.1+ OT-I-zellimplantierten Mäusen (Spender) seziert und in tumorangepasste CD45.1+CD45.2+ OT-I-zellimplantierte Mäuse (Empfänger) in der dorsalen Flanke auf der gleichen Seite wi...

Watch this Scientific Journal Video about Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice at JoVE.com

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Hier stellen wir ein Tumortransplantationsprotokoll zur Charakterisierung von tumorinhärenten und peripherieabgeleiteten tumorinfiltrierten Lymphozyten in einem Maustumormodell vor. Die spezifische Verfolgung des Zustroms von Empfänger-abgeleiteten Immunzellen mit Durchflusszytometrie zeigt die Dynamik der phänotypischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen während der Antitumor-Immunantwort.

Tumortransplantation zur Beurteilung der Dynamik tumorinfiltrierender CD8+ T-Zellen in Mäusen

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen in der Tumorimmunologie zu beantworten, einschließlich der Frage, ob es einen Nachschub an tumorspezifischen Immunzellen aus peripheren Geweben gibt, die Übergänge zwischen neu infiltrierten und bereits vorhandenen Immunzellen innerhalb der Tumormikroumgebung und ihre Reaktionen auf die Immuntherapie. Dies ist eine bequeme und leicht zu befolgende Technik, um die von der Peripherie abgeleiteten Zellen von tumorinfiltrierten Immunzellen zu unterscheiden und die dynamischen, phänotypischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen in Längsschnittassays zu verfolgen. Beginnen Sie damit, 100 Mikroliter der vorbereiteten B16F10-OVA-Zellsuspension in eine 1-ml-Tuberkulinspritze zu entnehmen.Klopfen Sie auf den Lauf, um Blasen nach oben zu bewegen, und drücken Sie den Kolben vorsichtig, um Luftblasen zu entfernen. Halten Sie die Maus zurück, um ihren Bauch freizulegen. Drücken Sie das linke Hinterbein mit dem kleinen Finger, um die Haut der linken Leistengegend zu straffen.Entfernen Sie die Haare der Maus mit einem elektrischen Rasierer vom linken Unterbauch. Verwenden Sie Baumwolle, die mit 75% Ethanol getränkt ist, um den hinteren Quadranten des linken Bauches zu reinigen. Halten Sie die Spritze in einem flachen Winkel zwischen 0 und 15 Grad und führen Sie sie mit der abgeschrägten Nadel nach oben an der Seite des linken Oberschenkels ein.Führen Sie die Nadel 0,5 bis 1 Zentimeter durch das Unterhautgewebe in die Leistengegend. Ziehen Sie den Kolben vor der Injektion zurück. Wenn es einen Unterdruck gibt, drücken Sie den Kolben vollständig und beobachten Sie die Bildung einer kleinen Flüssigkeitstasche oder eines Bolus in der Unterhaut.Entfernen Sie die Nadel, nachdem die Injektion durchgeführt wurde. Lassen Sie die Maus los und setzen Sie sie wieder in den Käfig. Messen Sie am sechsten bis achten Tag nach der B16F10-OVA-Implantation die Tumorgröße mit einer Vernierskala.Wählen Sie die Mäuse mit einem Durchmesser von etwa drei Millimetern oder einen tumor in Mungobohnengröße aus und teilen Sie sie gleichmäßig und zufällig in zwei Gruppen ein. Ziehen Sie 200 Mikroliter OT-1-Zellsuspension in eine 29-Gauge-Insulinspritze mit 100 Einheiten und entfernen Sie Blasen. Legen Sie die Maus separat in einen Käfig, mit einer Infrarotlampe über dem Käfig für 5 bis 10 Minuten, um die Schwanzvene zu erweitern.Immobilisieren Sie die Maus mit einer Haltevorrichtung der entsprechenden Größe. Halten Sie den Schwanz, um ihn zu begradigen, und sprühen Sie 75% Ethanol, um die Vene sichtbar zu machen. Halten Sie die Spritze parallel zur Vene und führen Sie sie in einem Winkel von 0 bis 15 Grad in die Vene ein.Ziehen Sie den Kolben leicht zurück, und wenn Blut in das Fass gelangt, injizieren Sie die Suspension langsam und stetig mit einer Rate von nicht mehr als einem Milliliter pro Minute. Entfernen Sie nach Abschluss der Injektion die Spritze und drücken Sie den Injektionsbereich drei bis fünf Sekunden lang vorsichtig, um die Blutung zu stoppen. Bringen Sie die Maus zurück in den Käfig und beobachten Sie sie einige Minuten lang genau auf Nebenwirkungen.Wenn es normale Beweglichkeit und Nasenausfluss hat, legen Sie es wieder in die Gesellschaft der anderen Mäuse. Wählen Sie 8 bis 10 Tage nach dem Adoptionstransfer Spendermäuse mit vergleichbarer Tumormasse von etwa fünf Millimetern Durchmesser für eine Transplantationsoperation aus. Legen Sie eine 100 Millimeter mal 20 Milliliter große Schale in eine Biosicherheitskabine und fügen Sie 10 Milliliter steriles, eiskaltes PBS hinzu.Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, tauchen Sie sie drei bis fünf Minuten lang in 75% Ethanol. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine mit sauberem, saugfähigem Papier bedeckte Dissektionsplatte in der Biosicherheitskabine. Halten Sie die Mäusegliedmassen mit Dissektionsnadeln zurück.Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie von oberhalb der Harnröhrenöffnung bis zum Xiphoid mit einer Schere. Dehnen Sie die Haut mit einer Pinzette auf die linke Seite des Mauskörpers und halten Sie die Haut mit Dissektionsnadeln zurück. Entfernen Sie den Tumor und halten Sie seine Kapsel so intakt wie möglich.Entfernen Sie vorsichtig und vorsichtig das Bindegewebe in der Nähe des Tumors mit einer chirurgischen Schere, dann legen Sie das Tumorgewebe in die Schale mit sterilem, eiskaltem PBS für die anschließende Transplantation. Verwenden Sie tierärztliche Salbe auf den Augen, um zu verhindern, dass sie austrocknen. Rasieren Sie die linke Flanke der Maus mit einem Elektrorasierer und tragen Sie dann eine Enthaarungscreme auf, um die restlichen Haare zu entfernen.Platzieren Sie die Maus in der Biosicherheitskabine in Bauchlage auf einer mit sauberem, saugfähigem Papier bedeckten Dissektionsplatte, wobei die vertikale Achse der Maus parallel dazu und ihr Kopf zur rechten Seite des Experimentators verläuft. Reiben Sie die Haut des rasierten Bereichs mit Baumwolle, die in Povidon-Jod getränkt ist. Heben Sie die Haut in der Mitte zwischen den Hüftgelenken der Maus mit einer chirurgischen Pinzette an.Verwenden Sie die Schere, um eine fünf Millimeter lange vertikale Exzision vorzunehmen und den Schnitt rostral entlang der dorsalen Mittellinie auf etwa 10 bis 15 Millimeter zu verlängern. Führen Sie eine scharfe Dissektion durch, indem Sie die geschlossenen Spitzen der Schere in den Schnitt einführen und dann öffnen, um das Peritoneum der linken Flanke von der Haut und dem Weichgewebe zu trennen. Führen Sie mehrmals eine scharfe Dissektion durch, um eine Hauttasche an der linken Flanke zu erzeugen.Legen Sie die eingekapselte, intakte, von Spendern abgeleitete Tumormasse in die Tasche. Schließen Sie den Schnitt durch eine unterbrochene Naht und verwenden Sie zwei oder drei Stiche für jeden Einschnitt. Desinfizieren Sie die Haut um den Schnitt mit Baumwolle, die in Povidon-Jod getränkt ist.Stellen Sie die Maus in die seitliche Position in einen sauberen und warmen Käfig. Überwachen Sie es kontinuierlich, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liegefähigkeit aufrechtzuerhalten. Verabreichen Sie Buprenorphin subkutan in einer Dosis von 0,1 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht alle acht Stunden, für insgesamt drei Dosen.Geben Sie den Transplantatempfänger erst dann an die Gesellschaft anderer Tiere zurück, wenn er sich vollständig erholt hat. Mittels Durchflusszytometrie konnten zwei Populationen von CD44-negativen und CD8-positiven Tumorantigen-spezifischen T-Zellen in der Tumormikroumgebung leicht identifiziert werden, einschließlich CD45.1-positiver Spender-abgeleiteter und CD45.1-negativer und CD45.2-positiver Empfänger-abgeleiteter tumorinfiltrierender CD8-positiver T-Zellen. Am zweiten Tag nach der Transplantation befanden sich etwa 83% der von Spendern abgeleiteten antigenspezifischen CD8-positiven T-Zellen im transplantierten Tumor, häufiger als ihre vom Empfänger abgeleiteten Gegenstücke.Der Anteil der vom Empfänger abgeleiteten OT-1-Zellen war im späten Stadium der Tumorgenese erhöht und übertraf die tumorinhärenten OT-1-Zellen, die vom Spender stammten. Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, ist, dass Sie während der subkutanen Tumortransplantation eine sanfte Dissektion durchführen, um Verletzungen des umgebenden Gewebes, insbesondere im körnigen Lymphknoten, zu vermeiden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Forschung

Krebsforschung

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Gemultiplext Immunfluoreszenz Analyse und Quantifizierung der intratumorale PD-1+ Tim-3+ CD8+ T-Zellen

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Intraperitoneale Transplantation zur Erzeugung akuter myeloischer Leukämie bei Mäusen

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Isolierung von Zellkernen für die Multiom-Sequenzierung in soliden Tumorproben

Optimized Nuclei Isolation from Fresh and Frozen Solid Tumor Specimens for Multiome Sequencing

Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Kernisolierung für die Multiom-Sequenzierung in schwierigen Tumormikroumgebungen

Optimierte Zellkernisolierung aus frischen und gefrorenen soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) ...