Ce protocole aide à comprendre le recrutement spatial et temporel des protéines de réparation des dommages à l’ADN, en tenant compte de la phase du cycle cellulaire. Pour la discrimination du cycle cellulaire, nous utilisons le PCNA marqué par une protéine fluorescente comme marqueur de la phase S, ce qui contourne les artefacts introduits par d’autres méthodes de synchronisation du cycle cellulaire. Ceci, combiné à la micro-irradiation au laser, donne une résolution spatio-temporelle inégalée à la cinétique des protéines de réparation des dommages à l’ADN.
Le succès de l’utilisation routinière de notre protocole s’appuie sur des connaissances de base en imagerie confocale. 24 heures avant la micro-irradiation, plaquer un total de huit par 10 à la quatrième cellule dans 500 microlitres à un millilitre de média sur un verre de couverture chambré à quatre puits. Une heure avant la micro-irradiation, échangez le milieu de croissance régulier avec un milieu imageur contenant soit de l’olaparib, soit un témoin de véhicule tel que le DMSO.
Au moins quatre heures avant l’imagerie, allumez la chambre environnementale et les composants du microscope. Allumez le chauffage, l’alimentation en dioxyde de carbone et le régulateur d’humidité. Initialisez les sources lumineuses avec les lignes laser au moins une heure avant de transférer les cellules au microscope.
Huilez l’objectif du microscope et placez un verre de couverture chambré sous le microscope. Pour sélectionner des cellules de phase S dans une population asynchrone, recherchez à travers l’oculaire le modèle de localisation unique du PCNA marqué mPlum en phase S et sélectionnez un champ de vision qui a suffisamment de cellules de phase S pour la micro-irradiation. Définissez la région d’intérêt pour la micro-irradiation en utilisant le logiciel associé pour insérer des lignes binaires.
Pour définir le nombre de lignes et l’espacement souhaités, cliquez sur binaire, puis sélectionnez Insérer une ligne, un cercle et des ellipses pour dessiner le nombre de lignes souhaité, puis convertissez ces lignes binaires en ROI de stimulation en cliquant sur ROI, déplacez binaire vers ROI, puis cliquez avec le bouton droit sur l’un des ROI et sélectionnez Utiliser comme ROI de stimulation S1. Placez ces lignes dans le champ de vision afin qu’elles traversent le noyau des cellules. Avant la micro-irradiation, pour identifier les foyers PCNA pour une analyse ultérieure, prenez une image plus haute résolution du champ de vision en définissant les paramètres nécessaires dans l’interface graphique compacte A1 LFOV et les fenêtres de zone de balayage A1 LFOV, puis appuyez sur le bouton de capture. Pour configurer la micro-irradiation, ouvrez l’onglet Stimulation ND, puis accédez à la fenêtre de calendrier pour acquérir une série d’images de pré-stimulation, puis une série d’images de post-stimulation à l’aide des scanners Galvano.
Configurez trois phases dans la fenêtre de planification. Dans la colonne acquisition et stimulation, sélectionnez acquisition, stimulation et acquisition pour les trois phases respectivement. Pour la phase de stimulation, définissez S1 comme ROI.
Dans la fenêtre Galvano XY, réglez la puissance de sortie laser à 100% pour la ligne laser de 405 nanomètres et réglez le temps de séjour pour la micro-irradiation. Pour configurer l’imagerie timelapse pour la fenêtre de temps et les intervalles souhaités, utilisez l’interface graphique compacte A1 LFOV et les fenêtres de zone de numérisation A1 LFOV. Optimisez les paramètres de pourcentage, de gain et de décalage de puissance laser pour réduire le blanchiment des photos pendant l’imagerie dans la fenêtre A1 LFOV compact GUI.
En fonction de la cinétique de la protéine, prolongez ou raccourcissez l’intervalle entre les images ou la durée du timelapse total en définissant l’intervalle et la durée souhaités pour la troisième ligne d’acquisition de phase dans la fenêtre de calendrier. Appuyez maintenant sur exécuter la micro-irradiation et l’imagerie timelapse ultérieure. À la fin de l’imagerie timelapse, enregistrez les ROI de stimulation sous forme d’images séparées, ce qui sera utile pour identifier les coordonnées de la micro-irradiation dans tout logiciel en aval utilisé pour l’analyse.
Le PCNA a une distribution complètement homogène dans le noyau dans les phases G1 et G2. En phase S, le PCNA se localise sur les sites de réplication de l’ADN, qui peuvent être visualisés comme des points lumineux dans le noyau. Dans les cellules de la phase S précoce, les taches sont relativement petites et également réparties dans tout le noyau de la cellule.
Tout en progressant dans la phase S moyenne, les taches deviennent floues et se localisent davantage vers le périmètre du noyau et des nucléoles. À la fin de la phase S, les taches diminuent en nombre, mais deviennent de plus en plus grandes à mesure que le PCNA se concentre sur les sites de réplication tardive. De faibles doses d’énergie, telles que 1 000 microsecondes de temps d’indécision, n’induisent pas le recrutement d’EGFP-FBXL10, un répondeur de rupture double brin, mais sont suffisantes pour induire le recrutement de NTHL1-mCherry, une protéine de la voie de réparation de l’excision de base qui est recrutée sur les sites de dommages oxydatifs à l’ADN.
À 3 000 microsecondes de temps d’indéfaction, EGFP-FBXL10 et NTHL1-mCherry sont recrutés, démontrant une sortie laser qui génère à la fois des lésions oxydatives et des cassures double brin. EXO1b atteint un niveau maximal de sites d’accumulation et de micro-irradiation autour d’une minute, puis commence lentement à se désengager des lésions de l’ADN. En présence d’olaparib, l’accumulation d’EXO1b au niveau de la bande laser à une minute est nettement inférieure à celle de la commande du véhicule.
Il est crucial que le microscope dispose de suffisamment de temps pour chauffer et que la culture et les conditions soient optimales pour chaque expérience afin d’assurer des résultats cohérents. De plus, il est important d’optimiser vos paramètres laser avec différents rapporteurs de dommages à l’ADN pour tester des lésions d’ADN spécifiques. Après la micro-irradiation, envisagez de valider les résultats avec des méthodes biochimiques classiques, telles que le fractionnement, l’immunoprécipitation ou le ChIP.
Ces approches échantillonnent une plus grande population cellulaire, fournissant ainsi une force statistique.
