Detta protokoll hjälper till att förstå den rumsliga och tidsmässiga rekryteringen av DNA-skadereparationsproteiner, med hänsyn till cellcykelfasen. För cellcykeldiskriminering använder vi fluorescerande proteinmärkt PCNA som en markör för S-fas, som kringgår artefakter som introducerats av andra cellcykelsynkroniseringsmetoder. Detta i kombination med laserbaserad mikrostrålning ger oöverträffad spatiotemporal upplösning på DNA-skador reparera proteinkinetik.
Att lyckas med rutinmässigt utnyttjande av vårt protokoll bygger på grundläggande kunskaper om konfokal avbildning. 24 timmar före mikrostrålningen, plätera totalt åtta gånger tio till de fjärde cellerna i 500 mikroliter till en milliliter media på ett fyra-brunns kammarlockglas. En timme före mikrostrålningen, byt ut det vanliga tillväxtmediet mot bildmedium som innehåller antingen olaparib eller en fordonskontroll som DMSO.
Minst fyra timmar före avbildning, slå på miljökammaren och mikroskopkomponenterna. Slå på värme- och koldioxidtillförseln och fuktighetsregulatorn. Initiera ljuskällor tillsammans med laserlinjerna minst en timme innan cellerna överförs till mikroskopet.
Olja mikroskopet objektivt och placera ett kammarlocksglas under mikroskopet. Om du vill välja S-fasceller i en asynkron population tittar du genom okulären efter det unika lokaliseringsmönstret för mPlum-taggade PCNA i S-fasen och väljer ett synfält som har tillräckligt med S-fasceller för mikrostrålning. Ange den region som är av intresse för mikrostrålning med hjälp av tillhörande programvara för att infoga binära linjer.
Om du vill ange önskat antal rader och avstånd klickar du på binär, väljer sedan infoga linje, cirkel och ellips för att rita önskat antal rader, konverterar sedan dessa binära linjer till stimulerings-ROM Genom att klicka på ROI, flytta binär till ROI och högerklicka sedan på någon av ROIs och välj använd som stimulering ROI S1. Placera dessa linjer i synfältet så att de passerar genom cellernas kärna. Innan mikrostrålning, för att identifiera PCNA-högborgar för senare analys, ta en bild med högre upplösning av synfältet genom att ställa in de nödvändiga parametrarna i A1 LFOV kompakt GUI och A1 LFOV-skanningsområdets fönster följt av att trycka på fångstknappen. Om du vill ställa in mikrobestrålningen öppnar du fliken ND-stimulering och öppnar sedan tidsschemafönstret för att hämta en serie förstimuleringsbilder och sedan en serie bilder efter stimulering med Hjälp av Galvano-skannrarna.
Ställ in tre faser i tidsschemafönstret. I kolumnen förvärv och stimulans väljer du förvärv, stimulans och förvärv för de tre faserna. För stimuleringsfasen ställer du in S1 som ROI.
I Galvano XY-fönstret ställer du in 100% lasereffekt för laserlinjen på 405 nanometer och ställer in uppehållstiden för mikrostrålning. Om du vill ställa in timelapse-avbildning för önskat tidsfönster och intervall använder du tidsschemat A1 LFOV compact GUI och A1 LFOV-skanningsområdets fönster. Optimera lasereffektprocenten, förstärknings- och förskjutningsinställningarna för att minska fotoblekningen under avbildningen i det kompakta GUI-fönstret A1 LFOV.
Beroende på proteinets kinetik förlänger eller förkortar du intervallet mellan bilder eller varaktigheten för den totala tidslapsen genom att ställa in önskat intervall och varaktighet för anskaffningsraden för tredje fasen i tidsschemafönstret. Tryck på kör nu för att köra mikrostrålningen och den efterföljande timelapse-avbildningen. I slutet av timelapse-avbildningen sparar du stimulerings-ROIs som separata bilder, vilket kommer att vara användbart för att identifiera koordinaterna för mikrostrålning i alla nedströmsprogram som används för analys.
PCNA har en helt homogen fördelning i kärnan i G1- och G2-faser. I S-fas lokaliserar PCNA till platser för DNA-replikering, som kan visualiseras som ljusa fläckar i kärnan. I tidiga S-fasceller är fläckarna relativt små och jämnt fördelade över cellens kärna.
Medan de utvecklas in i mitten av S-fasen blir fläckarna suddiga och lokaliserar mer mot kärnans och kärnans omkrets. I sen S-fas minskar fläckarna i antal, men blir allt större när PCNA koncentrerar sig på sena replikeringsplatser. Låga doser av energi, såsom 1 000 mikroseklar av uppehållstid, inducerar inte rekrytering av EGFP-FBXL10, en dubbelsträngad brytsvarare, men är tillräckliga för att inducera rekrytering av NTHL1-mCherry, en bas excision reparationsväg protein som rekryteras till platser med oxidativ DNA-skada.
Vid 3 000 mikroseseconds bor tid, både EGFP-FBXL10 och NTHL1-mCherry rekryteras, vilket visar en laserutgång som genererar både oxidativa skador och dubbelsträngade pauser. EXO1b når en maximal nivå av ackumulering och mikro-bestrålning platser runt en minut, och sedan långsamt börjar koppla från DNA-skador. I närvaro av olaparib är ackumuleringen av EXO1b vid laserremsan på en minut betydligt mindre jämfört med fordonskontrollen.
Det är viktigt att mikroskopet får gott om tid att värma upp och att kultur och förhållanden är optimala för varje experiment för att säkerställa konsekventa resultat. Dessutom är det viktigt att optimera dina laserinställningar med olika DNA-skadereportrar för att testa för specifika DNA-skador. Efter mikro bestrålning, överväga att validera resultat med klassiska biokemiska metoder, såsom fraktionering, immunoprecipitation eller ChIP.
Dessa metoder provar en större cellpopulation, vilket ger statistisk styrka.