Name: detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

ونحن نقدر ونشكر المساعدة التقنية التي يقدمها شياوهونغ هي، وريكاردو ماريوس، وجوليا بيتريك، وبرادلي أوستن، وكريستيانو تانيزي دي سوزا. نشكر أيضا مينا قريماني على التصميم الجرافيكي. كما نود أن نشكر جميع الأفراد الذين شاركوا وتبرعوا بعينات دمهم لهذه الدراسة. ويدعم DWC جزئيا من قبل كلية uOttawa وقسم الطب.

ملاحظة: البروتوكول الموضح أدناه يلتزم بكافة إرشادات الأخلاقيات وفقا لمدونة البروتوكول 20200371-01H.
1. إنتاج وتقييم HiBiT-RBD التقرير البيولوجي
<ol><li>إنتاج كمية كافية من HiBiT-RBD المبلغ الحيوي<ol>
<li>الاستعداد لثقافة الخلايا<ol>
<li>إعداد كامل دولبيكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) التي تحتوي على 10...

<ol>
	<li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+coronavirus+2019+(COVID-19)+pandemic+outbreak:+A+comprehensive+review+of+the+current+literature.">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li><li>Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: <a target="_blank" href="https://www.worldometers.info/coronavirus/">https://www.worldometers.info/coronavirus/</a> (2021)</li><li>Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+wave+COVID-19+pandemics+in+Europe:+a+temporal+playbook.">Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).</li><li>COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines">https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines</a> (2021)</li><li>Hueston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+response+to+SARS-CoV-2+infection.">The antibody response to SARS-CoV-2 infection.</a> Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).</li><li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor.">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology.">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li><li>Premkumar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor-binding+domain+of+the+viral+spike+protein+is+an+immunodominant+and+highly+specific+target+of+antibodies+in+SARS-CoV-2+patients.">The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients.</a> Science Immunology. 5 (48), (2020).</li><li>Walls, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elicitation+of+potent+neutralizing+antibody+responses+by+designed+protein+nanoparticle+vaccines+for+SARS-CoV-2.">Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2.</a> Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).</li><li>Azad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+reveals+the+importance+of+N-+linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Mol Ther. , 0074-0075 (2021).</li><li>Bastos, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19:+systematic+review+and+meta-analysis.">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516 (2020).</li><li>Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa">https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa</a> (2021)</li><li>Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+bioluminescent+systems.">A brief review of bioluminescent systems.</a> Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion.">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening.">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP/TAZ-TEAD+biosensors.">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596 (2019).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis.">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li><li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide.">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion.">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).</li></ol>

ويتطلب العدد المتزايد من المصابين بالسارس-فيروس الكواد-2 والجهود الجارية للتطعيم العالمي إجراء اختبارات مصلية حساسة وسريعة يمكن استخدامها في عمليات مسح المصل على نطاق واسع. وتبين البحوث الحديثة أنه يمكن استخدام التقارير البيولوجية القائمة على النانولوسيفراز لتطوير مثل هذه المقايسات. ق?...

وقد تسبب ظهور فيروس كورونا الجديد، سارس-CoV21، في وفاة أكثر من 2,800,000 شخص و128 مليون إصابة حتى 30 مارس 2022. ونظرا لعدم وجود إجراءات علاج موثوقة وراسخة للعلاجات السريرية للسارس-CoV-2، بذلت العديد من الجهود لتقييد المزيد من انتقال الفيروس، والأهم من ذلك، تطوير علاج فعال وقوي أو لقاح3. حتى الآن، هناك أكثر من 50 مرشحا للقاح COVID-19 في التجارب التي أبلغت عنها منظمة الصحة العالمية4. يعد اكتشاف الأجسام المضادة ضد السارس - فيروس نقص الفيروس - 2 ذا أهمية قصوى لتحديد الاستقرار طويل الأجل للاستجابة الفكاهية عند إعطاء اللقاح وكذلك في المرضى الذين تم انتشالهم من COVID-195. وقد اثبتت بعض الدراسات ان هناك امكانية ان يفقد المرضى الذين تم انتشالهم من السارس - كو فى - 2 معظم الاجسام المضادة الملزمة للسارب بعد عام واحد ، وهو 6،7، 8،9 . ويلزم إجراء مزيد من التحقيقات من أجل فهم أفضل للمناعة الدائمة، ويمكن لمنصات الكشف عن الأجسام المضادة الأكثر حساسية أن تساعد في زيادة هذا العمل. كما أن التقارير عن استمرار مناعة العدوى الخفيفة بالسارس-CoV-2، والتي تشير إلى استجابات طويلة الأجل للأجسام المضادة، هي أيضا مجال مثير للاهتمام وجدير بالاهتمام للدراسة. طريقة سريعة ودقيقة للكشف أمر ضروري لرصد الأجسام المضادة في سيرا الأفراد لتوفير المزيد من المعلومات حول الحصانة في السكان.
مثل الفيروسات التاجية الأخرى، يستخدم السارس-CoV-2 بروتين الجليكوبروتين البارز لربط الإنزيم-2 المحول لأنجيوتنسين (ACE2) لبدء سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى دمج أغشية الفيروسات والخلايا6,7. وقد أثبتت العديد من الدراسات مؤخرا RBD من بروتين سبايك أن يكون لها دور حاسم في الحصول على استجابة قوية ومحددة للأجسام المضادة ضد السارس-CoV28,9,10,11. وعلى وجه الخصوص، فإن الارتباطات التي لاحظها بريمكومار وآخرون بين تأليه الأجسام المضادة الملزمة لل RBD وفعالية تحييد السارس-CoV-2 في بلازما المرضى تتسق مع كون RBD حجرة مناعية لهيكل الفيروس9. ومع وضع ذلك في الاعتبار، فإن العديد من الاختبارات التشخيصية المتاحة للكشف عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2 هي اختبارات تستغرق وقتا طويلا وكثيفة التكلفة، وتتطلب إجراء طويلا للحضانة والغسيل (فحص مناعة مرتبط بالإنزيم [ELISA])، أو تفتقر إلى الحساسية والدقة (الفحص المناعي للتدفق الجانبي [LFIA])12. ولذلك، فإن الطريقة الكمية والسريعة التكميلية للكشف عن الأجسام المضادة المشتقة من COVID-19 مع حساسية عالية واستجابة سريعة وتكلفة منخفضة نسبيا من شأنها أن تخدم الحاجة إلى اختبار مصلي موثوق به للمراقبة الوبائية سارس-كوف-2.
وقد أدت القيود المفروضة على المقايسات المصلية الحالية مجتمعة إلى إجراء تحقيق في نظام الإبلاغ عن الإنارة الحيوية كعامل تشخيصي محتمل في عمليات التحري المصلي في المستقبل. الإضاءة الحيوية هي تفاعل إنزيم/ركيزة طبيعي، مع انبعاث الضوء. Nanoluc luciferase هو أصغر (19 كيلودا) ، ومع ذلك ألمع نظام مقارنة رينيلا واليراع لوسيفيراز (36 كدا و 61 كدا ، على التوالي)13،14. علاوة على ذلك ، Nanoluc لديه أعلى نسبة إشارة إلى الضوضاء والاستقرار بين الأنظمة المذكورة سابقا. تدعم كثافة الإشارة العالية ل Nanoluc اكتشاف كميات منخفضة جدا من اندماج المراسلين15. تقنية Nanoluc الثنائية (NanoBiT) هي نسخة مقسمة من نظام Nanoluc ، والتي تتألف من جزأين: BiT الصغيرة (11 حمض أميني؛ ثنائية الأحماض الصغيرة (11 حمض أميني؛ 1998). SmBiT) وBiT كبيرة (LgBiT) مع التفاعلات منخفضة نسبيا تقارب (دينار كويتي = 190 ميكرومتر) لتشكيل مجمع الإنارة16. يستخدم NanoBiT على نطاق واسع في دراسات مختلفة تنطوي على تحديد التفاعلات البروتين البروتين15,17,18,19 ومسارات الإشارات الخلوية11,20,21.
في الآونة الأخيرة ، تم تقديم ببتيد صغير آخر مع تقارب أعلى بشكل واضح إلى LgBiT (KD = 0.7 nM) ، وهو نظام HiBiT Nano-Glo ، بدلا من SmBiT. تقارب عالية وإشارة قوية من نانو غلو "إضافة مزيج قراءة" المقايسة يجعل HiBiT مناسبة، كمية، علامة الببتيد الإنارة. في هذا النهج ، يتم إلحاق علامة HiBiT بالبروتين المستهدف من خلال تطوير بناء يفرض الحد الأدنى من التداخل الهيكلي. ومن شأن اندماج بروتين HiBiT أن يرتبط بنشاط بنظيره LgBiT، وينتج إنزيم لوسيفيراز نشط للغاية لتوليد الإضاءة الحيوية القابلة للكشف في وجود كاشفات الكشف (الشكل 1). وبالمثل، قمنا بتطوير نظام قائم على HiBiT Nano-Glo لقياس تاتر الأجسام المضادة المحايدة بسهولة في سيرا الأفراد المتعافين من السارس-CoV-2 وطورنا مؤخرا جهازا موسوما بالسارس-CoV-2 RBD. تصف هذه الورقة بروتوكول إنتاج التقرير الحيوي HiBiT-RBD باستخدام الإجراءات والمعدات المختبرية القياسية، وتبين كيف يمكن استخدام هذا المبلغ الحيوي في فحص سريع وفعال للكشف عن الأجسام المضادة المستهدفة بالسارس-CoV-2 RBD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Passive Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E194A</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>171020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td>100 mL kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT-RBD Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt
				gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata
				gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg
				aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta
				agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa
				ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg
				cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc
				gttgacattgattattgactagttattaatagt
				aatcaattacggggtcattagttcatagcccat
				atatggagttccgcgttacataacttacggtaa
				atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc
				ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc
				atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc
				aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact
				tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta
				cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg
				cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat
				gggactttcctacttggcagtacatctacgtat
				tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt
				ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg
				actcacggggatttccaagtctccaccccattg
				acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc
				aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg
				ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta
				cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg
				ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg
				aaattaatacgactcactatagggagacccaa
				gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga
				gctcggatccgccaccATGGAGACAGA
				CACACTCCTGCTATGGGTACTGC
				TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC
				TGGTGACtctggctctagcggctctggctct
				agcggcggcATGGTGAGCGGCTG
				GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC
				tctagcggcGACTACAAGGACC
				ACGACGGTGACTACAAGGACCA
				CGACATCGACTACAAGGACGAC
				GACGACAAGggcagcggctccggca
				gcagcggaggaggaggctctggaggagga
				ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg
				cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat
				ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga
				atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct
				gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt
				gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac
				ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt
				gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc
				acctggacagacaggcaagatcgccgactac
				aactataagctgccagacgatttcaccggct
				gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt
				ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac
				cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt
				tgagcgggatatcagcacagagatctaccag
				gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg
				gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc
				ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca
				tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg
				cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc
				gagggccgccacatgctggagatgggccatc
				atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag
				cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac
				ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt
				gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg
				ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac
				tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat
				cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg
				ggtggggtggggcaggacagcaaggggga
				ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg
				gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa
				agaaccagctggggctctagggggtatcccca
				cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg
				ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
				acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg
				ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt
				tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta
				gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc
				ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta
				gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc
				ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg
				gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc
				ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt
				gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg
				atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt
				ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc
				caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag
				catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg
				aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt
				atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac
				catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc
				ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc
				ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc
				cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa
				gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg
				caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc
				ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt
				cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg
				ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc
				tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct
				gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg
				cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg
				tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg
				cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct
				tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg
				ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc
				ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg
				ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg
				cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc
				ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg
				agcgagcacgtactcggatggaagccggtct
				tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat
				caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca
				ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg
				atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg
				ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt
				ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt
				ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct
				acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg
				aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg
				tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc
				ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg
				ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag
				cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat
				tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt
				cggaatcgttttccgggacgccggctggatga
				tcctccagcgcggggatctcatgctggagt
				tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta
				taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa
				atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt
				ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat
				cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct
				agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc
				ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac
				aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag
				cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat
				taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
				gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa
				tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg
				tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc
				gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt
				atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc
				cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa
				catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag
				gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt
				tccataggctccgcccccctgacgagcatcac
				aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa
				acccgacaggactataaagataccaggcgtt
				tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt
				ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc
				tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat
				agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag
				gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa
				ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc
				ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag
				acacgacttatcgccactggcagcagccactg
				gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc
				ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact
				acggctacactagaagaacagtatttggtatc
				tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa
				aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa
				ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca
				agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat
				ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt
				ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa
				gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct
				tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt
				ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
				ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg
				cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca
				tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac
				gatacgggagggcttaccatctggccccagtg
				ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc
				ggctccagatttatcagcaataaaccagccag
				ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg
				caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt
				gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt
				aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag
				gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg
				cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc
				gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag
				cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca
				gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
				tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg
				ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta
				ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg
				gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg
				ggataataccgcgccacatagcagaactttaa
				aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc
				gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat
				ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact
				gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc
				tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc
				cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga
				aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat
				attattgaagcatttatcagggttattgtc
				tcatgagcggatacatatttgaatgtattt
				agaaaaataaacaaataggggttccgcgca
				catttccccgaaaagtgccacctgacgtc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein G Magnetic Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Mx Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>96-well plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2520056</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter

وقد أدى ظهور وباء COVID-19 إلى زيادة الحاجة إلى طرق أفضل للكشف المصلي لتحديد الأثر الوبائي للفيروس التاجي للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (سارس-كوف-2). ويثير العدد المتزايد من الإصابات بالسارس-CoV-2 الحاجة إلى فحوصات أفضل للكشف عن الأجسام المضادة. طرق الكشف عن الأجسام المضادة الحالية تهدد الحساسية للسرعة أو حساسة ولكنها تستغرق وقتا طويلا. وتستهدف نسبة كبيرة من الأجسام المضادة المحايدة للسارس-CoV-2 المجال الملزم للمستقبلات، وهو أحد المقصورات المناعية الأولية للسارس-كوف-2. لقد قمنا مؤخرا بتصميم وتطوير نظام RBD شديد الحساسية وموسوم بيومونسنت (NanoLuc HiBiT-RBD) للكشف عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2. يصف النص التالي الإجراء لإنتاج مجمع HiBiT-RBD وإجراء تقييم سريع لتقييم وجود الأجسام المضادة المستهدفة RBD باستخدام هذه الأداة. ونظرا لمتانة منتج بروتين HiBiT-RBD على مدى مجموعة واسعة من درجات الحرارة والإجراءات التجريبية الأقصر التي يمكن إكمالها في غضون ساعة واحدة، يمكن اعتبار البروتوكول بديلا أكثر كفاءة للكشف عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2 في عينات مصل المريض.

تم تسجيل الإشارات من كل من lysate الخلية المحتوية على HiBit-RBD وsupernatant من الخلايا المصابة (الشكل 2) لتقييم مصدر البروتين المناسب. تم استخدام HiBiT-RBD و LgBit بشكل منفصل كعناصر تحكم ، وأظهرت البيانات خلفية منخفضة مقارنة بإشارة قوية عندما تم الجمع بين كلا الجزءين. وبالتالي، فإن تفاعل HiBiT-RB...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

ويصف البروتوكول المحدد إجراءات إنتاج مجمع بروتين المجال الملزم لمستقبلات HiBiT وتطبيقه للكشف السريع والحساس عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2.

الكشف عن الأجسام المضادة للمجال الملزمة للمستقبلات من سارس-CoV-2 باستخدام جهاز تقرير حيوي قائم على HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

مختبري يعمل في أبحاث COVID-19، وقد طورنا مؤخرا فحصا جديدا سمح لنا بالكشف بسرعة ودقة عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2. يحدد هذا البروتوكول فحصا عاليا للنسب للكشف عن الأجسام المضادة للسارس-COV-2 في عينات مصل المريض، وهو أمر بالغ الأهمية نظرا للوباء الحالي. غالبية المقايسات المصلية الحالية تضحي بالسرعة من أجل الحساسية أو العكس بالعكس.تظهر بياناتنا أن المقايسة لدينا حساسة ولديها وقت استجابة سريع. من أجل إنتاج كمية كافية من HiBiT-RBD عالية التقارير الحيوية، تبدأ بالتحضير لثقافة الخلية. أولا، إعداد كامل دولبيكو تعديل النسر المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنين و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين.ثم تدفئة وسائل الإعلام في حمام مائي 37 درجة مئوية. تشغيل خزانة السلامة البيولوجية واستخدام الإيثانول 70٪ لتعقيم سطح الخزانة. زراعة خط الخلية، أخرجه من ناقص 80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل وتذوب في حمام مائي 37 درجة مئوية.امزج الخلايا المذابة مع ما لا يقل عن 10 ملليلتر من الوسط الكامل. ماصة تعليق الخلية في طبق بيتري 15 سنتيمترا ودوامة لوحة لتوزيع الخلايا بشكل موحد. ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون ، والرطوبة 85 إلى 95٪.مراقبة الخلايا تحت المجهر حتى يصل مستوى التقاء 80 إلى 90٪ عند التقاء عالية، وإزالة المتوسطة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني دافئ وإضافة ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من 0.25٪ تريبسين-EDTA لفصل الخلايا من السطح. بعد ما يقرب من خمس دقائق، ننظر في الخلايا تحت المجهر. إذا كانت جميع الخلايا عائمة، أضف أربعة ملليلترات على الأقل من المتوسط ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم جديد.عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وإضافة مليون خلية في كل بئر من لوحة من ستة آبار لtransfection. لإجراء عملية نقل ل HiBiT-RBD plasmid، استخدم ميكروجرام واحد من تعبير HiBiT-RBD البلازميد مع كاشف نقل مناسب. احتضان لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم إضافة الحجم الإجمالي إلى كل بئر من لوحة دروبوايز.في اليوم التالي، استبدل الوسط الذي يحتوي على خليط العدوى بمتوسط كامل. مراقبة التحكم في العدوى جيدا بعد 48 ساعة من العدوى. جمع supernatant في 1.5 ملليلتر الأنابيب الدقيقة.إضافة 500 ميكرولتر من 1X العازلة تحلل سلبي أو PLB إلى الخلايا، ثم احتضان ويهز لوحة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتحلل الخلية. بعد ذلك ، لتقييم إشارة التلألؤ من المبلغ الحيوي باستخدام مقايسة لوسيفيراز ، قم أولا بإعداد مكونات التفاعل واستخدام الفائق كمصدر للمراجز الحيوي. تمييع BiT كبيرة والركيزة إلى 1X قبل الاستخدام.نقل 50 ميكرولتر من supernatant من كل بئر أو أنبوب إلى لوحة 96 جيدا وإضافة 50 ميكرولتر من 1X BiT كبيرة لكل بئر. احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. فتح برنامج لومينوميتر، إضافة 50 ميكرولتر من ركيزة 1X إلى كل بئر، ووضع لوحة في لومينوميتر وتشغيل البرنامج.من أجل إجراء اختبار الكشف عن الأجسام المضادة HiBiT-RBD ، قم بإعداد التقرير الحيوي HiBiT-RBD كما هو موضح سابقا والجمع بين 50 ميكرولتر من HiBiT-RBD التي تحتوي على ميكرونات واحد مع ميكروجرام واحد من الأجسام المضادة التجارية سارس-CoV-2 RBD في ميكروب 1.5 ملليلتر. إضافة 20 ميكرولتر من البروتين المناعي ملزمة أو البروتين G إلى الحل. رفع الحجم الإجمالي إلى 300 ميكرولتر بإضافة برنامج تلفزيوني.احتضان الأنابيب على أنبوب شاكر أو الدوار لمدة 30 دقيقة. جهاز طرد مركزي في 12، 000 G لمدة 30 ثانية. ثم تجاهل supernatant وغسل مع برنامج تلفزيوني.كرر العملية ثلاث مرات لإزالة HiBiT-RBD مجانا. Resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ونقله إلى لوحة 96 جيدا. إضافة 50 ميكرولتر من 1X BiT كبيرة وانتظر لمدة خمس دقائق.ثم أضف 50 ميكرولتر من ركيزة NanoLuc 1X. قراءة فورا إشارة التلألؤ مع لومينوميتر. إعداد كميات أكبر من HiBiT-RBD بيوبورتر لإجراء فحص الإنتاجية العالية والجمع بين 20 ميكرولتر من البروتين المغناطيسي G مع 50 ميكرولتر من HiBiT-RBD supernatant في كل بئر من لوحة 96 جيدا لكل عينة.إضافة 10 ميكرولتر من عينة المصل إلى كل بئر وبذلك يصل الحجم الإجمالي إلى 150 ميكرولتر عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 30 دقيقة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. ثم ضع اللوحة على غسالة مغناطيسية لتسريع مجمع الأجسام المضادة البروتين G.تجاهل الحل في القسم الأوسط من كل بئر وإضافة برنامج تلفزيوني للغسيل. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات على الأقل لإزالة HiBiT-RBD الزائدة. إضافة 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X و 50 ميكرولتر من 1X BiT كبيرة واحتضان لمدة خمس دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.إعداد برنامج قياس اللمومتر. ثم أضف 50 ميكرولتر من ركيزة 1X. ضع اللوحة في الجهاز، تشغيل البرامج وتسجيل الإشارات.قارن الإشارات من عينات المصل وعينات التحكم وإشارة الخلفية من الآبار الفارغة. تم تسجيل الإشارات من كل من HiBiT-RBD التي تحتوي على lysate الخلية وsupernatant من الخلايا المصابة لتقييم مصدر البروتين المناسب. وأظهرت البيانات خلفية منخفضة مقارنة بإشارة قوية عندما تم الجمع بين كلا الجزءين.إضافة البروتين G يساعد الأجسام المضادة هطول الأمطار. وقد استخدم هذا الفحص لمقارنة الاشارة من جهاز مضاد تجاري لتحييد السارس-كوف-2 مع جهاز IgG مسيطر. كانت إشارة الجسم المضاد المحددة قوية ، في حين كان الجسم المضاد للتحكم قريبا من مستوى الخلفية الإنارة.تم استخدام فيروس التهاب الفم الوهن الموهن أو VSV مع طفرة في الموضع 51 من بروتين M الذي يعبر عن RBD الخارجي لتطعيم الفئران. أنتج المصل الذي تم جمعه من الفئران الملقحة إشارة قوية مقارنة مع عدم وجود إشارة في الفئران التي تم حقنها باستخدام VSV التحكم. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للكشف عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2 في عينات مصل المريض.تعتبر خطوات الغسيل التالية للحضانة باستخدام Protein G أمرا حاسما لتقليل الخلفية. بالإضافة إلى ذلك، من المهم إضافة الركيزة في أسرع وقت ممكن لتجنب فقدان الإشارة. ومع بعض الخطوات الإضافية للتحسين، يمكن استخدام نفس المقايسة لتحليل عينات الدم ويمكن أن تكون طريقة فعالة لتحديد الأجسام المضادة المضادة للسارس-COV-2 في عينات دم المرضى.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

تصور سارس-CoV-2 باستخدام الحمض النووي الريبي المناعي-فلورسينس في التهجين في الموقع

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

الكشف عن الأجسام المضادة المحايدة للسارس-CoV-2 باستخدام التصوير الفلوري عالي الإنتاجية للعدوى بالفيروس الزائف

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

سريع، متعدد المراسل المزدوج IgG وIgM سارس-CoV-2 تحييد المقايسة لنظام تحليل التدفق متعددة الخرز القائم

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

التصوير الحي والقياس الكمي للعدوى الفيروسية في الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 باستخدام SARS-CoV-2 المؤتلف الذي يعبر عنه المراسل

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

استراتيجية فعالة لتشخيص اللعاب باستخدام روبوتات السحب العكسي الكمية ل SARS-CoV-2 باستخدام روبوتات السحب مفتوحة المصدر

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

المقايسة المناعية المتعددة ل IgG و IgM الخاصة بالبوريليا في المصل

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

تسليط الضوء على المؤلف: توسيع نطاق المقايسات المناعية المتعددة لتشخيص داء لايم وأبحاث مسببات الأمراض 

الكشف المتزامن عن فئات مختلفة من الأجسام المضادة في اختبار مصلي متعدد الإرسال

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

القياس الكمي للأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح في متغيرات SARS-CoV-2

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

تسليط الضوء على المؤلف: نظام فيروس من النمط الكاذب لتقييم المتغيرات الفرعية لأوميكرون وتحييد الأجسام المضادة في أبحاث SARS-CoV-2

تطبيق الفيروس الكاذب Ha-CoV-2 للقياس الكمي السريع لمتغيرات SARS-CoV-2 وتحييد الأجسام المضادة

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...