Name: detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Vi sætter pris på og takker den tekniske bistand fra Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin og Christiano Tanese De Souza. Vi takker også Mina Ghahremani for grafisk design. Vi vil også gerne takke alle de personer, der deltog og donerede deres blodprøver til denne undersøgelse. DWC støttes delvist af uOttawa Fakultet og Institut for Medicin.

BEMÆRK: Den protokol, der er beskrevet nedenfor, overholder alle etiske retningslinjer i henhold til protokolkode 20200371-01H.
1. Produktion og evaluering af HiBiT-RBD bioreporter
<ol><li>Producerer en tilstrækkelig mængde HiBiT-RBD bioreporter<ol>
<li>Forbered dig på cellekultur<ol>
<li>Forbered komplet Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM), der indeholder 10% fosterkvægsserum og 1% penicillin/streptomycin. Derefter opvarmes mediet i et 37 °C vandbad.</li>
			<li>Tænd for det b...

<ol>
	<li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+coronavirus+2019+(COVID-19)+pandemic+outbreak:+A+comprehensive+review+of+the+current+literature.">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li><li>Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: <a target="_blank" href="https://www.worldometers.info/coronavirus/">https://www.worldometers.info/coronavirus/</a> (2021)</li><li>Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+wave+COVID-19+pandemics+in+Europe:+a+temporal+playbook.">Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).</li><li>COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines">https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines</a> (2021)</li><li>Hueston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+response+to+SARS-CoV-2+infection.">The antibody response to SARS-CoV-2 infection.</a> Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).</li><li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor.">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology.">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li><li>Premkumar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor-binding+domain+of+the+viral+spike+protein+is+an+immunodominant+and+highly+specific+target+of+antibodies+in+SARS-CoV-2+patients.">The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients.</a> Science Immunology. 5 (48), (2020).</li><li>Walls, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elicitation+of+potent+neutralizing+antibody+responses+by+designed+protein+nanoparticle+vaccines+for+SARS-CoV-2.">Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2.</a> Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).</li><li>Azad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+reveals+the+importance+of+N-+linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Mol Ther. , 0074-0075 (2021).</li><li>Bastos, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19:+systematic+review+and+meta-analysis.">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516 (2020).</li><li>Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa">https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa</a> (2021)</li><li>Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+bioluminescent+systems.">A brief review of bioluminescent systems.</a> Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion.">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening.">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP/TAZ-TEAD+biosensors.">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596 (2019).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis.">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li><li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide.">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion.">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).</li></ol>

Det stigende antal personer, der er smittet med SARS-CoV-2, og den igangværende indsats for global vaccination kræver følsomme og hurtige serologiske tests, der kan bruges i store serosurveyer. Nyere forskning viser, at split nanoluciferase-baserede bioreportere kan bruges til at udvikle sådanne analyser. Vi har for nylig udviklet HiBiT-RBD bioreporter til at designe en test, der kan bruges til at opdage SARS-CoV-2-specifikke antistoffer i patientens serum på en hurtig og pålidelig måde (Figur...

Den nylige fremkomst af et nyt coronavirus, SARS-CoV21, har forårsaget mere end 2.800.000 dødsfald og 128 millioner infektioner pr. 30. marts 20212. På grund af manglen på en pålidelig og veletableret behandlingsprocedure for sars-CoV-2 kliniske behandlinger, mange bestræbelser er blevet gjort for at begrænse yderligere viral transmission og endnu vigtigere, at udvikle en effektiv og robust behandling eller en vaccine3. Til dato er der mere end 50 covid-19-vaccinekandidater i forsøg rapporteret af Verdenssundhedsorganisationen4. Påvisning af antistoffer mod SARS-CoV-2 er af afgørende betydning for at bestemme den langsigtede stabilitet af humoral respons ved administration af vaccinen samt hos genvundne patienter med COVID-195. Nogle undersøgelser har vist, at der er en mulighed for, at genvundne SARS-CoV-2-patienter mister de fleste af de RBD-bindende antistoffer efter 1 år5,6,7,8,9. Yderligere undersøgelser er nødvendige for bedre at forstå varig immunitet, og mere følsomme antistofdetekteringsplatforme kan bidrage til at fremme et sådant arbejde. Rapporter om vedvarende immunitet af milde SARS-CoV-2 infektioner, som tyder på langsigtede antistofresponser, er også et interessant og værdifuldt studieområde. En hurtig og præcis metode til påvisning er afgørende for overvågning af antistoffer i enkeltpersoners sera for at give mere information om immunitet i befolkningen.
Ligesom andre coronavirusser bruger SARS-CoV-2 fremspringende spike glycoprotein til at binde sig til angiotensinkonverterende enzym-2 (ACE2) til at indlede en kaskade af begivenheder, der fører til fusion af virus- og cellemembranerne6,7. Flere undersøgelser har for nylig vist, at RBD af Spike-proteinet har en afgørende rolle i fremkalde kraftig og specifik antistofrespons mod SARS-CoV28,9,10,11. Navnlig er korrelationer observeret af Premkumar et al. mellem titeren af RBD-bindende antistof og SARS-CoV-2-neutraliseringsstyrken af patienternes plasma i overensstemmelse med, at RBD er et immunogent rum i virusstrukturen9. Med dette in mente er mange diagnostiske test, der er tilgængelige for SARS-CoV-2-antistofdetektering, tids- og omkostningskrævende, kræver en langvarig procedure for inkubation og vask (enzymrelateret immunosorbentanalyse [ELISA]) eller mangler følsomhed og nøjagtighed (lateral flow immunoassay [LFIA])12. Derfor vil en kvantitativ og hurtig supplerende serologisk metode til covid-19-afledt antistofdetektering med høj følsomhed, hurtig respons og relativt lave omkostninger tjene behovet for en pålidelig serologisk test for SARS-CoV-2 epidemiologisk overvågning.
Samlet set førte begrænsningerne i de nuværende serologiske analyser til en undersøgelse af det bioluminescerende rapporteringssystem som et potentielt diagnostisk middel i fremtidige serosurveyer. Bioluminescens er en naturligt forekommende enzym/substratreaktion med let emission. Nanoluc luciferase er den mindste (19 kDa), men det klareste system sammenlignet med Renilla og firefly luciferase (henholdsvis 36 kDa og 61 kDa)13,14. Desuden har Nanoluc det højeste signal til støjforhold og stabilitet blandt de tidligere nævnte systemer. Nanoluc's høje signalintensitet understøtter påvisning af selv meget lave mængder af reporterfusioner15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) er en opdelt version af Nanoluc-systemet, som består af to segmenter: små BiT (11 aminosyrer; SmBiT) og stor bit (LgBiT) med relativt lav-affinitet interaktioner (KD = 190 μM) til at danne en selvlysende kompleks16. NanoBiT anvendes i vid udstrækning i forskellige undersøgelser, der involverer identifikation af protein-protein interaktioner15,17,18,19 og cellulære signaleringsveje11,20,21.
For nylig blev en anden lille peptid med en udpræget højere affinitet til LgBiT (KD = 0,7 nM) indført, nemlig HiBiT Nano-Glo-systemet i stedet for SmBiT. Den høje affinitet og stærke signal af Nano-Glo "add-mix-read" assay gør HiBiT en passende, kvantitativ, selvlysende peptid tag. I denne tilgang er HiBiT-mærket vedhæftet målproteinet ved at udvikle en konstruktion, der pålægger minimal strukturel interferens. HiBiT-protein fusion ville aktivt binde sig til LgBiT modstykke, der producerer en meget aktiv luciferase enzym til at generere påviselig bioluminescens i overværelse af detektion reagenser (Figur 1). På samme måde udviklede vi et HiBiT Nano-Glo-baseret system til let at måle den neutraliserende antistof titer i sera af SARS-CoV-2 genvundne individer og udviklede for nylig en HiBiT-mærket SARS-CoV-2 RBD. Dette papir beskriver protokollen til fremstilling af HiBiT-RBD bioreporter ved hjælp af standard laboratorieprocedurer og udstyr, og viser, hvordan denne bioreporter kan bruges i en hurtig og effektiv analyse til at opdage SARS-CoV-2 RBD-målretning antistoffer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Passive Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E194A</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>171020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td>100 mL kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT-RBD Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt
				gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata
				gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg
				aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta
				agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa
				ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg
				cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc
				gttgacattgattattgactagttattaatagt
				aatcaattacggggtcattagttcatagcccat
				atatggagttccgcgttacataacttacggtaa
				atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc
				ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc
				atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc
				aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact
				tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta
				cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg
				cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat
				gggactttcctacttggcagtacatctacgtat
				tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt
				ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg
				actcacggggatttccaagtctccaccccattg
				acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc
				aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg
				ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta
				cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg
				ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg
				aaattaatacgactcactatagggagacccaa
				gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga
				gctcggatccgccaccATGGAGACAGA
				CACACTCCTGCTATGGGTACTGC
				TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC
				TGGTGACtctggctctagcggctctggctct
				agcggcggcATGGTGAGCGGCTG
				GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC
				tctagcggcGACTACAAGGACC
				ACGACGGTGACTACAAGGACCA
				CGACATCGACTACAAGGACGAC
				GACGACAAGggcagcggctccggca
				gcagcggaggaggaggctctggaggagga
				ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg
				cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat
				ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga
				atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct
				gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt
				gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac
				ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt
				gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc
				acctggacagacaggcaagatcgccgactac
				aactataagctgccagacgatttcaccggct
				gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt
				ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac
				cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt
				tgagcgggatatcagcacagagatctaccag
				gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg
				gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc
				ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca
				tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg
				cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc
				gagggccgccacatgctggagatgggccatc
				atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag
				cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac
				ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt
				gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg
				ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac
				tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat
				cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg
				ggtggggtggggcaggacagcaaggggga
				ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg
				gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa
				agaaccagctggggctctagggggtatcccca
				cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg
				ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
				acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg
				ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt
				tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta
				gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc
				ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta
				gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc
				ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg
				gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc
				ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt
				gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg
				atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt
				ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc
				caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag
				catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg
				aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt
				atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac
				catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc
				ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc
				ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc
				cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa
				gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg
				caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc
				ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt
				cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg
				ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc
				tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct
				gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg
				cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg
				tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg
				cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct
				tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg
				ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc
				ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg
				ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg
				cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc
				ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg
				agcgagcacgtactcggatggaagccggtct
				tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat
				caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca
				ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg
				atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg
				ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt
				ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt
				ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct
				acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg
				aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg
				tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc
				ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg
				ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag
				cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat
				tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt
				cggaatcgttttccgggacgccggctggatga
				tcctccagcgcggggatctcatgctggagt
				tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta
				taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa
				atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt
				ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat
				cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct
				agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc
				ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac
				aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag
				cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat
				taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
				gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa
				tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg
				tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc
				gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt
				atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc
				cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa
				catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag
				gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt
				tccataggctccgcccccctgacgagcatcac
				aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa
				acccgacaggactataaagataccaggcgtt
				tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt
				ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc
				tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat
				agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag
				gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa
				ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc
				ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag
				acacgacttatcgccactggcagcagccactg
				gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc
				ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact
				acggctacactagaagaacagtatttggtatc
				tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa
				aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa
				ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca
				agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat
				ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt
				ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa
				gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct
				tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt
				ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
				ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg
				cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca
				tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac
				gatacgggagggcttaccatctggccccagtg
				ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc
				ggctccagatttatcagcaataaaccagccag
				ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg
				caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt
				gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt
				aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag
				gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg
				cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc
				gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag
				cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca
				gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
				tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg
				ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta
				ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg
				gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg
				ggataataccgcgccacatagcagaactttaa
				aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc
				gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat
				ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact
				gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc
				tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc
				cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga
				aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat
				attattgaagcatttatcagggttattgtc
				tcatgagcggatacatatttgaatgtattt
				agaaaaataaacaaataggggttccgcgca
				catttccccgaaaagtgccacctgacgtc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein G Magnetic Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Mx Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>96-well plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2520056</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter

Fremkomsten af COVID-19-pandemien har øget behovet for bedre serologiske påvisningsmetoder til at bestemme de epidemiologiske virkninger af svær akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Det stigende antal SARS-CoV-2-infektioner øger behovet for bedre antistofdetekteringsanalyser. De nuværende metoder til antistofdetektion kompromitterer følsomheden for hastighed eller er følsomme, men tidskrævende. En stor del af SARS-CoV-2-neutraliserende antistoffer er rettet mod det receptorbindende domæne (RBD), et af de primære immunogene rum i SARS-CoV-2. Vi har for nylig designet og udviklet en meget følsom, bioluminescerende-mærket RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) til at opdage SARS-CoV-2 antistoffer. I følgende tekst beskrives proceduren for fremstilling af HiBiT-RBD-komplekset og en hurtig analyse for at evaluere tilstedeværelsen af RBD-målretningsantistoffer ved hjælp af dette værktøj. På grund af holdbarheden af HiBiT-RBD-proteinproduktet over en lang række temperaturer og den kortere forsøgsprocedure, der kan afsluttes inden for 1 time, kan protokollen betragtes som et mere effektivt alternativ til påvisning af SARS-CoV-2 antistoffer i patient serumprøver.

Signalerne fra både hibit-RBD-holdige cellelyt og supernatant af de transfected celler blev registreret (figur 2) for at evaluere den relevante proteinkilde. HiBiT-RBD og LgBit blev brugt separat som kontroller, og dataene viste lav baggrund sammenlignet med et stærkt signal, når begge dele blev kombineret. Derfor er HiBiT-RBD interaktion med LgBiT nødvendig for at generere aktivt enzym til fordøjelse af substratet og bioluminescensaktivitet (Figur 1).
...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Den skitserede protokol beskriver proceduren for fremstilling af HiBiT-receptorbindende domæneproteinkompleks og dets anvendelse til hurtig og følsom påvisning af SARS-CoV-2 antistoffer.

Påvisning af SARS-CoV-2 receptorbindende domæneantistof ved hjælp af en HiBiT-baseret bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Mit laboratorium har arbejdet med COVID-19 forskning, og vi har for nylig udviklet en ny analyse, der gjorde det muligt for os hurtigt og præcist at opdage SARS-CoV-2 antistoffer. Denne protokol skitserer en høj gennemløbsanalyse til påvisning af anti-SARS-CoV-2 antistoffer i patient serum prøver, som er kritisk i betragtning af den nuværende pandemi. De fleste af de nuværende serologiske analyser ofrer hastighed for følsomhed eller omvendt.Vores data viser, at vores analyse er både følsom og har en hurtig responstid. For at producere en tilstrækkelig mængde høj HiBiT-RBD bioreporter, begynde med at forberede cellekultur. Først forberede komplet Dulbecco modificeret ørn medium, der indeholder 10% føtalt kvæg serum og 1% penicillin og streptomycin.Derefter varme medierne i en 37 grader Celsius vandbad. Tænd det biologiske sikkerhedsskab og brug 70% ethanol til sterilisering af kabinettets overflade. For at dyrke cellelinjen skal du tage den ud fra minus 80 grader Celsius eller flydende nitrogen og optø den i et 37 grader Celsius vandbad.Bland de optøede celler med mindst 10 milliliter komplet medium. Pipette celle suspension i en 15 centimeter Petri parabol og hvirvle pladen til at distribuere cellerne ensartet. Placer skålen i en cellekultur inkubator ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid og 85 til 95% fugtighed.Overhold cellerne under mikroskopet, indtil sammenløbet når 80 til 90% Ved højt sammenløb skal du fjerne mediet, vaske cellerne med varm PBS og tilsæt tre til fem milliliter på 0,25% trypsin-EDTA for at løsne cellerne fra overfladen. Efter ca. fem minutter skal du se på cellerne under et mikroskop. Hvis alle celler flyder, tilsættes mindst fire milliliter medium og overfører celleaffjedringen til et nyt sterilt rør.Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer og tilsæt en million celler i hver brønd af en seks-brønd plade til transfection. For at udføre transfection af HiBiT-RBD plasmid skal du bruge et mikrogram af HiBiT-RBD-udtryksplasmiden med et passende transfefektreage. Inkuber i 10 til 15 minutter ved stuetemperatur, og tilsæt derefter det samlede volumen til hver brønd af pladen dropwise.På den næste dag skal du udskifte det medium, der indeholder transfectionblandingen, med komplet medium. Overhold transinfektionskontrollen godt 48 timer efter transfektion. Saml supernatant i 1,5 milliliter mikrorør.Tilsæt 500 mikroliter af 1X passiv lysis buffer eller PLB til cellerne, inkuber og ryst derefter pladen i 15 minutter ved stuetemperatur for celle lysis. Dernæst for at evaluere luminescenssignalet fra bioreporteren ved hjælp af en luciferaseanalyse skal du først forberede reaktionskomponenterne og bruge supernatanten som kilde til bioreporteren. Fortynd den store BiT og substrat til 1X før brug.Overfør 50 mikroliter af supernatanten fra hver brønd eller rør til en 96-brønds plade og tilsæt 50 mikroliter af 1X stor BiT til hver brønd. Inkuber i fem minutter ved stuetemperatur. Åbn luminometersoftwaren, tilsæt 50 mikroliter af 1X substrat til hver brønd, placer pladen i luminometeret og kør softwaren.For at kunne udføre HiBiT-RBD antistofdetekteringsanalysen skal HiBiT-RBD bioreporteren forberedes som tidligere beskrevet og kombinere 50 mikroliter af HiBiT-RBD, der indeholder supernatant, med et mikrogram af det kommercielle SARS-CoV-2 RBD-antistof i et 1,5 millilitermikrorør. Tilsæt 20 mikroliter immunoglobulin bindende protein eller Protein G til opløsningen. Bring den samlede volumen til 300 mikroliter ved at tilføje PBS.Inkuber rørene på en rør shaker eller rotator i 30 minutter. Centrifuge ved 12.000 G i 30 sekunder. Kassér derefter supernatanten og vask med PBS.Gentag processen tre gange for at fjerne gratis HiBiT-RBD. Resuspend cellerne i 50 mikroliter af PBS og overføre det til en 96-brønd plade. Tilsæt 50 mikroliter af 1X stor bit og vent i fem minutter.Tilsæt derefter 50 mikroliter af 1X NanoLuc substrat. Læs straks luminescenssignalet med et luminometer. Forbered større mængder af HiBiT-RBD bioreporter til en høj gennemløbsanalyse, og kombiner 20 mikroliter magnetisk protein G med 50 mikroliter af HiBiT-RBD supernatanten i hver brønd af en 96-brønds plade for hver prøve.Tilsæt 10 mikroliter af serumprøven til hver brønd og bring det samlede volumen til 150 mikroliter ved at tilføje PBS. Inkuber i 30 minutter på en shaker ved stuetemperatur. Placer derefter pladen på en magnetisk skive for at udfælde protein G antistofkomplekset.Kassér opløsningen i den midterste del af hver brønd og tilsæt PBS til vask. Gentag vasketrinnet mindst tre gange for at fjerne overskydende HiBiT-RBD. Tilsæt 50 mikroliter af 1X PBS og 50 mikroliter af 1X stor bit og inkuber i mindst fem minutter ved stuetemperatur.Forbered luminometersoftwaren. Tilsæt derefter 50 mikroliter af 1X substrat. Placer pladen i maskinen, kør software og optag signalerne.Sammenlign signalerne fra serumprøver, kontrolprøver og baggrundssignal fra tomme brønde. Signalerne fra både HiBiT-RBD, der indeholder cellelysate og supernatant af de transfected celler blev registreret for at evaluere den relevante proteinkilde. Dataene viste lav baggrund sammenlignet med et stærkt signal, når begge dele blev kombineret.Tilsætning af Protein G hjælper antistof nedbør. Analysen blev brugt til at sammenligne signalet fra et kommercielt SARS-CoV-2 neutraliserende antistof med en kontrol-IgG. Det specifikke antistofsignal var robust, mens kontrolantistoffet havde tæt på det selvlysende baggrundsniveau.Rekombinant svækket onkolytisk vesikulær stomatitisvirus eller VSV med en mutation på position 51 i M-proteinet, der udtrykker eksogen RBD, blev anvendt til at vaccinere mus. Det serum, der blev indsamlet fra vaccinerede mus, gav et robust signal sammenlignet med intet signal hos mus, der blev injiceret med kontrol VSV. Denne protokol kan bruges til påvisning af SARS-CoV-2 antistoffer i patient serum prøver.Vasketrinene efter inkubation med Protein G er afgørende for at reducere baggrunden. Derudover er det vigtigt at tilføje substratet så hurtigt som muligt for at undgå signaltab. Med et par ekstra optimering trin, den samme analyse kan bruges til at analysere blodprøver og kunne være en effektiv metode til bestemmelse anti-SARS-CoV-2 antistoffer i patientens blodprøver.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering af SARS-CoV-2 ved hjælp af Immuno RNA-fluorescens In Situ Hybridisering

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Påvisning af SARS-CoV-2 neutraliserende antistoffer ved hjælp af fluorescerende billeddannelse af pseudovirusinfektion

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

En hurtig, Multiplex Dual Reporter IgG og IgM SARS-CoV-2 neutralisering Assay for en multiplexed perle-baseret Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Live imaging og kvantificering af virusinfektion i K18 hACE2 transgene mus ved hjælp af reporter-udtrykkende rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Effektiv SARS-CoV-2 kvantitativ omvendt transkriptase PCR spytdiagnostisk strategi ved hjælp af open source pipetteringsrobotter

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex immunassay for Borrelia-specifikt IgG og IgM i serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Forfatter Spotlight: Udvidelse af omfanget af multiplex immunassays til Lyme Borreliose-diagnostik og patogenforskning 

Samtidig påvisning af forskellige antistofklasser i en multiplexet serologisk test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Kvantificering af vaccineinducerede neutraliserende antistoffer i SARS-CoV-2-varianter

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Forfatter Spotlight: Et pseudotype-virussystem til vurdering af Omicron-undervarianter og neutraliserende antistoffer i SARS-CoV-2-forskning

Anvendelse af Ha-CoV-2 pseudovirus til hurtig kvantificering af SARS-CoV-2-varianter og neutraliserende antistoffer

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...