Name: detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

We waarderen en bedanken de technische assistentie van Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin en Christiano Tanese De Souza. We bedanken ook Mina Ghahremani voor grafisch ontwerp. We willen ook alle personen bedanken die hebben deelgenomen en hun bloedmonsters hebben gedoneerd voor deze studie. DWC wordt gedeeltelijk ondersteund door uOttawa Faculteit en Afdeling Geneeskunde.

OPMERKING: Het hieronder beschreven protocol voldoet aan alle ethische richtlijnen volgens protocolcode 20200371-01H.
1. Productie en evaluatie van de HiBiT-RBD bioreporter
<ol><li>Productie van een voldoende hoeveelheid HiBiT-RBD bioreporter<ol>
<li>Bereid je voor op celkweek<ol>
<li>Bereid het gemodificeerde Eagle medium (DMEM) van Dulbecco met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline /streptomycine volledig voor. Verwarm vervolgens de media in een waterbad van 37 °C.</li>
			<li>Zet de ...

<ol>
	<li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+coronavirus+2019+(COVID-19)+pandemic+outbreak:+A+comprehensive+review+of+the+current+literature.">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li><li>Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: <a target="_blank" href="https://www.worldometers.info/coronavirus/">https://www.worldometers.info/coronavirus/</a> (2021)</li><li>Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+wave+COVID-19+pandemics+in+Europe:+a+temporal+playbook.">Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).</li><li>COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines">https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines</a> (2021)</li><li>Hueston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+response+to+SARS-CoV-2+infection.">The antibody response to SARS-CoV-2 infection.</a> Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).</li><li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor.">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology.">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li><li>Premkumar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor-binding+domain+of+the+viral+spike+protein+is+an+immunodominant+and+highly+specific+target+of+antibodies+in+SARS-CoV-2+patients.">The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients.</a> Science Immunology. 5 (48), (2020).</li><li>Walls, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elicitation+of+potent+neutralizing+antibody+responses+by+designed+protein+nanoparticle+vaccines+for+SARS-CoV-2.">Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2.</a> Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).</li><li>Azad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+reveals+the+importance+of+N-+linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Mol Ther. , 0074-0075 (2021).</li><li>Bastos, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19:+systematic+review+and+meta-analysis.">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516 (2020).</li><li>Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa">https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa</a> (2021)</li><li>Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+bioluminescent+systems.">A brief review of bioluminescent systems.</a> Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion.">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening.">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP/TAZ-TEAD+biosensors.">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596 (2019).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis.">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li><li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide.">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion.">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).</li></ol>

Het toenemende aantal mensen dat besmet is met de SARS-CoV-2 en de voortdurende inspanning voor wereldwijde vaccinatie vereist gevoelige en snelle serologische tests die kunnen worden gebruikt in grootschalige serosurveys. Recent onderzoek toont aan dat gesplitste op nanoluciferase gebaseerde bioreporters kunnen worden gebruikt om dergelijke testen te ontwikkelen. We hebben onlangs de HiBiT-RBD bioreporter ontwikkeld om een test te ontwerpen die kan worden gebruikt om SARS-CoV-2-specifieke antilichamen in het serum van d...

De recente opkomst van een nieuw coronavirus, SARS-CoV21, heeft op 30 maart 20212 meer dan 2.800.000 doden en 128 miljoen besmettingen veroorzaakt. Vanwege het ontbreken van een betrouwbare en gevestigde behandelingsprocedure voor sars-cov-2 klinische therapieën, zijn er veel inspanningen geleverd om verdere virale overdracht te beperken en nog belangrijker, om een effectieve en robuuste behandeling of een vaccin te ontwikkelen3. Tot op heden zijn er meer dan 50 COVID-19-vaccinkandidaten in onderzoeken gerapporteerd door de Wereldgezondheidsorganisatie4. Detectie van antilichamen tegen SARS-CoV-2 is van het grootste belang om de stabiliteit op lange termijn van de humorale respons bij toediening van het vaccin en bij herstelde patiënten van COVID-195 te bepalen. Sommige studies hebben aangetoond dat er een mogelijkheid is dat herstelde SARS-CoV-2-patiënten de meeste RBD-bindende antilichamen verliezen na 1 jaar5,6,7,8,9. Verder onderzoek is nodig om blijvende immuniteit beter te begrijpen, en meer gevoelige antilichaamdetectieplatforms kunnen dergelijk werk helpen bevorderen. Meldingen van aanhoudende immuniteit van milde SARS-CoV-2-infecties, die langdurige antilichaamresponsen suggereren, is ook een interessant en de moeite waard studiegebied. Een snelle en nauwkeurige detectiemethode is essentieel voor het monitoren van antilichamen in de sera van individuen om meer informatie te geven over immuniteit in de populatie.
Net als andere coronavirussen gebruikt SARS-CoV-2 uitstekende spike glycoproteïne om te binden aan angiotensine-converterend enzym-2 (ACE2) om een cascade van gebeurtenissen te initiëren die leiden tot de fusie van de virale en celmembranen6,7. Verschillende studies hebben onlangs aangetoond dat de RBD van het Spike-eiwit een cruciale rol speelt bij het opwekken van een krachtige en specifieke antilichaamrespons tegen SARS-CoV28,9,10,11. In het bijzonder zijn correlaties waargenomen door Premkumar et al. tussen de titer van RBD-bindend antilichaam en SARS-CoV-2 neutralisatiepotentie van het plasma van patiënten consistent met RBD als een immunogeen compartiment van de virusstructuur9. Met dat in gedachten zijn veel diagnostische tests die beschikbaar zijn voor SARS-CoV-2-antilichaamdetectie tijd- en kostenintensief, vereisen ze een langdurige procedure van incubatie en wassen (enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA]), of missen ze gevoeligheid en nauwkeurigheid (laterale flow immunoassay [LFIA])12. Daarom zou een kwantitatieve en snelle complementaire serologische methode van covid-19-afgeleide antilichaamdetectie met hoge gevoeligheid, snelle respons en relatief lage kosten voldoen aan de behoefte aan een betrouwbare serologische test voor SARS-CoV-2 epidemiologische surveillance.
Gezamenlijk hebben de beperkingen van de huidige serologische assays geleid tot het onderzoek van het bioluminescente rapportagesysteem als een potentieel diagnostisch middel in toekomstige serosurveys. Bioluminescentie is een natuurlijk voorkomende enzym/substraatreactie, met lichtemissie. Nanoluc luciferase is het kleinste (19 kDa), maar toch het helderste systeem in vergelijking met Renilla en firefly luciferase (respectievelijk 36 kDa en 61 kDa)13,14. Verder heeft Nanoluc de hoogste signaal/ruisverhouding en stabiliteit van de eerder genoemde systemen. De hoge signaalintensiteit van Nanoluc ondersteunt de detectie van zelfs zeer lage hoeveelheden reporterfusies15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) is een gesplitste versie van het Nanoluc-systeem, dat bestaat uit twee segmenten: kleine BiT (11 aminozuren; SmBiT) en grote BiT (LgBiT) met relatief lage affiniteitsinteracties (KD = 190 μM ) om een luminescerend complex te vormen16. NanoBiT wordt op grote schaal gebruikt in verschillende studies met betrekking tot de identificatie van eiwit-eiwitinteracties15,17,18,19 en cellulaire signaalroutes11,20,21.
Onlangs werd een ander klein peptide met een duidelijk hogere affiniteit voor LgBiT (KD = 0,7 nM) geïntroduceerd, namelijk het HiBiT Nano-Glo-systeem, in plaats van SmBiT. De hoge affiniteit en het sterke signaal van de Nano-Glo "add-mix-read" assay maakt HiBiT een geschikte, kwantitatieve, luminescerende peptide tag. In deze benadering wordt de HiBiT-tag toegevoegd aan het doeleiwit door een constructie te ontwikkelen die minimale structurele interferentie oplegt. HiBiT-eiwitfusie zou actief binden aan de LgBiT-tegenhanger, waardoor een zeer actief luciferase-enzym wordt geproduceerd om detecteerbare bioluminescentie te genereren in aanwezigheid van detectiereagentia (figuur 1). Op dezelfde manier ontwikkelden we een HiBiT Nano-Glo-gebaseerd systeem om de neutraliserende antilichaamtiter gemakkelijk te meten in de sera van SARS-CoV-2 herstelde individuen en ontwikkelden we onlangs een HiBiT-tagged SARS-CoV-2 RBD. Dit artikel beschrijft het protocol voor het produceren van de HiBiT-RBD bioreporter met behulp van standaard laboratoriumprocedures en apparatuur, en laat zien hoe deze bioreporter kan worden gebruikt in een snelle en efficiënte test om SARS-CoV-2 RBD-gerichte antilichamen te detecteren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Passive Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E194A</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>171020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td>100 mL kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT-RBD Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt
				gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata
				gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg
				aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta
				agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa
				ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg
				cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc
				gttgacattgattattgactagttattaatagt
				aatcaattacggggtcattagttcatagcccat
				atatggagttccgcgttacataacttacggtaa
				atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc
				ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc
				atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc
				aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact
				tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta
				cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg
				cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat
				gggactttcctacttggcagtacatctacgtat
				tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt
				ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg
				actcacggggatttccaagtctccaccccattg
				acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc
				aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg
				ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta
				cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg
				ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg
				aaattaatacgactcactatagggagacccaa
				gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga
				gctcggatccgccaccATGGAGACAGA
				CACACTCCTGCTATGGGTACTGC
				TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC
				TGGTGACtctggctctagcggctctggctct
				agcggcggcATGGTGAGCGGCTG
				GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC
				tctagcggcGACTACAAGGACC
				ACGACGGTGACTACAAGGACCA
				CGACATCGACTACAAGGACGAC
				GACGACAAGggcagcggctccggca
				gcagcggaggaggaggctctggaggagga
				ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg
				cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat
				ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga
				atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct
				gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt
				gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac
				ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt
				gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc
				acctggacagacaggcaagatcgccgactac
				aactataagctgccagacgatttcaccggct
				gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt
				ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac
				cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt
				tgagcgggatatcagcacagagatctaccag
				gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg
				gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc
				ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca
				tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg
				cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc
				gagggccgccacatgctggagatgggccatc
				atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag
				cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac
				ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt
				gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg
				ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac
				tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat
				cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg
				ggtggggtggggcaggacagcaaggggga
				ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg
				gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa
				agaaccagctggggctctagggggtatcccca
				cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg
				ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
				acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg
				ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt
				tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta
				gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc
				ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta
				gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc
				ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg
				gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc
				ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt
				gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg
				atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt
				ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc
				caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag
				catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg
				aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt
				atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac
				catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc
				ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc
				ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc
				cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa
				gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg
				caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc
				ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt
				cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg
				ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc
				tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct
				gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg
				cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg
				tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg
				cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct
				tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg
				ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc
				ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg
				ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg
				cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc
				ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg
				agcgagcacgtactcggatggaagccggtct
				tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat
				caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca
				ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg
				atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg
				ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt
				ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt
				ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct
				acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg
				aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg
				tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc
				ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg
				ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag
				cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat
				tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt
				cggaatcgttttccgggacgccggctggatga
				tcctccagcgcggggatctcatgctggagt
				tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta
				taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa
				atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt
				ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat
				cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct
				agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc
				ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac
				aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag
				cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat
				taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
				gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa
				tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg
				tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc
				gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt
				atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc
				cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa
				catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag
				gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt
				tccataggctccgcccccctgacgagcatcac
				aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa
				acccgacaggactataaagataccaggcgtt
				tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt
				ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc
				tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat
				agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag
				gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa
				ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc
				ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag
				acacgacttatcgccactggcagcagccactg
				gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc
				ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact
				acggctacactagaagaacagtatttggtatc
				tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa
				aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa
				ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca
				agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat
				ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt
				ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa
				gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct
				tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt
				ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
				ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg
				cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca
				tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac
				gatacgggagggcttaccatctggccccagtg
				ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc
				ggctccagatttatcagcaataaaccagccag
				ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg
				caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt
				gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt
				aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag
				gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg
				cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc
				gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag
				cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca
				gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
				tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg
				ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta
				ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg
				gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg
				ggataataccgcgccacatagcagaactttaa
				aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc
				gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat
				ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact
				gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc
				tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc
				cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga
				aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat
				attattgaagcatttatcagggttattgtc
				tcatgagcggatacatatttgaatgtattt
				agaaaaataaacaaataggggttccgcgca
				catttccccgaaaagtgccacctgacgtc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein G Magnetic Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Mx Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>96-well plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2520056</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter

De opkomst van de COVID-19-pandemie heeft de behoefte aan betere serologische detectiemethoden vergroot om de epidemiologische impact van ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) te bepalen. Het toenemende aantal SARS-CoV-2-infecties verhoogt de behoefte aan betere antilichaamdetectietests. De huidige antilichaamdetectiemethoden brengen de gevoeligheid voor snelheid in gevaar of zijn gevoelig maar tijdrovend. Een groot deel van de SARS-CoV-2-neutraliserende antilichamen richt zich op het receptorbindende domein (RBD), een van de primaire immunogene compartimenten van SARS-CoV-2. We hebben onlangs een zeer gevoelige, bioluminescente RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) ontworpen en ontwikkeld om SARS-CoV-2-antilichamen te detecteren. De volgende tekst beschrijft de procedure om het HiBiT-RBD-complex te produceren en een snelle test om de aanwezigheid van RBD-gerichte antilichamen met behulp van deze tool te evalueren. Vanwege de duurzaamheid van het HiBiT-RBD-eiwitproduct over een breed temperatuurbereik en de kortere experimentele procedure die binnen 1 uur kan worden voltooid, kan het protocol worden beschouwd als een efficiënter alternatief om SARS-CoV-2-antilichamen in serummonsters van patiënten te detecteren.

De signalen van zowel het HiBit-RBD-bevattende cellysaat als het supernatant van de getransfecteerde cellen werden geregistreerd (figuur 2) om de juiste eiwitbron te evalueren. HiBiT-RBD en LgBit werden afzonderlijk gebruikt als controles en de gegevens vertoonden een lage achtergrond in vergelijking met een sterk signaal wanneer beide delen werden gecombineerd. Daarom is HiBiT-RBD-interactie met LgBiT noodzakelijk om een actief enzym te genereren voor substraatvertering en bioluminescentiea...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Het geschetste protocol beschrijft de procedure voor de productie van het HiBiT-receptor-bindende domeineiwitcomplex en de toepassing ervan voor snelle en gevoelige detectie van SARS-CoV-2-antilichamen.

Detectie van SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody met behulp van een HiBiT-gebaseerde Bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Mijn lab heeft gewerkt aan COVID-19-onderzoek en we hebben onlangs een nieuwe test ontwikkeld waarmee we SNEL en nauwkeurig SARS-CoV-2-antilichamen konden detecteren. Dit protocol schetst een hoge doorvoertest voor het detecteren van anti-SARS-CoV-2-antilichamen in serummonsters van patiënten, wat van cruciaal belang is gezien de huidige pandemie. De meeste van de huidige serologische testen offeren snelheid op voor gevoeligheid of omgekeerd.Onze gegevens laten zien dat onze test zowel gevoelig is als een snelle reactietijd heeft. Om een voldoende hoeveelheid hoge HiBiT-RBD bioreporter te produceren, begint u met de voorbereiding op celkweek. Bereid eerst het gemodificeerde adelaarmedium van Dulbecco met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline en streptomycine.Verwarm vervolgens de media in een waterbad van 37 graden Celsius. Zet de biologische veiligheidskast aan en gebruik 70% ethanol voor het steriliseren van het kastoppervlak. Om de cellijn te kweken, haal je het uit min 80 graden Celsius of vloeibare stikstof en ontdooi je het in een waterbad van 37 graden Celsius.Meng de ontdooide cellen met ten minste 10 milliliter volledig medium. Pipetteer de celsuspensie in een petrischaaltje van 15 centimeter en draai de plaat om de cellen gelijkmatig te verdelen. Plaats de schaal in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 85 tot 95% luchtvochtigheid.Observeer de cellen onder de microscoop totdat het confluentieniveau 80 tot 90% bereikt Bij hoge confluentie verwijdert u het medium, wast u de cellen met warme PBS en voegt u drie tot vijf milliliter van 0,25% trypsine-EDTA toe om de cellen van het oppervlak los te maken. Bekijk na ongeveer vijf minuten de cellen onder een microscoop. Als alle cellen drijven, voegt u ten minste vier milliliter medium toe en brengt u de celsuspensie over in een nieuwe steriele buis.Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en voeg een miljoen cellen toe aan elke put van een plaat met zes putten voor transfectie. Om transfectie van het HiBiT-RBD plasmide uit te voeren, gebruikt u één microgram hiBiT-RBD expressie plasmide met een geschikt transfectiereagens. Incubeer gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur en voeg vervolgens het totale volume druppelsgewijs toe aan elk putje van de plaat.Vervang de volgende dag het medium met het transfectiemengsel door het volledige medium. Observeer de transfectiecontrole goed 48 uur na transfectie. Verzamel het supernatant in microbuisjes van 1,5 milliliter.Voeg 500 microliter 1X passieve lysisbuffer of PLB toe aan de cellen, incubeer en schud de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voor cellysis. Om vervolgens het luminescentiesignaal van de bioreporter te evalueren met behulp van een luciferasetest, bereidt u eerst de reactiecomponenten voor en gebruikt u het supernatant als bron van de bioreporter. Verdun de grote BiT en het substraat voor gebruik tot 1X.Breng 50 microliter van het supernatant van elke put of buis over naar een plaat met 96 putten en voeg 50 microliter 1x grote BiT toe aan elke put. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Open de luminometersoftware, voeg 50 microliter 1X substraat toe aan elke put, plaats de plaat in de luminometer en voer de software uit.Om de HiBiT-RBD antilichaamdetectietest uit te voeren, bereidt u de HiBiT-RBD-bioreporter voor zoals eerder beschreven en combineert u 50 microliter van het HiBiT-RBD-bevattende supernatant met één microgram van het commerciële SARS-CoV-2 RBD-antilichaam in een microbuisje van 1,5 milliliter. Voeg 20 microliter immunoglobulinebindend eiwit of eiwit G toe aan de oplossing. Breng het totale volume op 300 microliter door PBS toe te voegen.Incubeer de buizen op een buisschudder of rotator gedurende 30 minuten. Centrifugeer bij 12.000 G gedurende 30 seconden. Gooi vervolgens het supernatant weg en was met PBS.Herhaal het proces drie keer om de gratis HiBiT-RBD te verwijderen. Resuspend de cellen in 50 microliter PBS en breng het over naar een 96-well plaat. Voeg 50 microliter 1x grote BiT toe en wacht vijf minuten.Voeg vervolgens 50 microliter 1X NanoLuc-substraat toe. Lees onmiddellijk het luminescentiesignaal af met een luminometer. Bereid grotere hoeveelheden van de HiBiT-RBD bioreporter voor een high throughput assay en combineer 20 microliter magnetisch eiwit G met 50 microliter van het HiBiT-RBD supernatant in elke put van een 96-well plaat voor elk monster.Voeg 10 microliter van het serummonster toe aan elke put en breng het totale volume op 150 microliter door PBS toe te voegen. Incubeer gedurende 30 minuten op een shaker bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens de plaat op een magnetische ring om het Protein G-antilichaamcomplex neer te slaan.Gooi de oplossing in het middelste gedeelte van elke put weg en voeg PBS toe voor het wassen. Herhaal de wasstap minstens drie keer om overtollige HiBiT-RBD te verwijderen. Voeg 50 microliter 1X PBS en 50 microliter 1X grote BiT toe en incubeer gedurende ten minste vijf minuten bij kamertemperatuur.Bereid de luminometersoftware voor. Voeg vervolgens 50 microliter 1X substraat toe. Plaats de plaat in de machine, voer software uit en neem de signalen op.Vergelijk de signalen van serummonsters, controlemonsters en achtergrondsignalen van lege putten. De signalen van zowel de HiBiT-RBD bevattende cellysaat als supernatant van de getransfecteerde cellen werden geregistreerd om de juiste eiwitbron te evalueren. De gegevens toonden een lage achtergrond in vergelijking met een sterk signaal wanneer beide delen werden gecombineerd.De toevoeging van proteïne G helpt antilichaamprecipitatie. De test werd gebruikt om het signaal van een commercieel SARS-CoV-2 neutraliserend antilichaam te vergelijken met een controle-IgG. Het specifieke antilichaamsignaal was robuust, terwijl het controleantilichaam dicht bij het luminescerende achtergrondniveau lag.Recombinant verzwakt oncolytisch vesiculair stomatitisvirus of VSV met een mutatie op positie 51 van het M-eiwit dat exogene RBD tot expressie brengt, werd gebruikt om muizen te vaccineren. Het serum verzameld van gevaccineerde muizen produceerde een robuust signaal in vergelijking met geen signaal bij muizen geïnjecteerd met controle VSV. Dit protocol kan worden gebruikt voor de detectie van de SARS-CoV-2-antilichamen in serummonsters van patiënten.De wasstappen na incubatie met proteïne G zijn van cruciaal belang voor het verminderen van de achtergrond. Daarnaast is het belangrijk om het substraat zo snel mogelijk toe te voegen om signaalverlies te voorkomen. Met een paar extra optimalisatiestappen kan dezelfde test worden gebruikt om bloedmonsters te analyseren en kan het een effectieve methode zijn voor het bepalen van anti-SARS-CoV-2-antilichamen in bloedmonsters van patiënten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisatie van SARS-CoV-2 met behulp van Immuno RNA-Fluorescentie In Situ Hybridisatie

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Detectie van SARS-CoV-2 neutraliserende antilichamen met behulp van high-throughput fluorescerende beeldvorming van pseudovirusinfectie

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Een Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG en IgM SARS-CoV-2 Neutralisatie assay voor een Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie bij K18 hACE2 transgene muizen met reporter-expressing recombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Efficiënte SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Speeksel diagnostische strategie met behulp van Open-Source Pipetteerrobots

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex-immunoassay voor Borrelia-specifiek IgG en IgM in serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Auteur in de schijnwerpers: uitbreiding van de reikwijdte van multiplex immunoassays voor diagnostiek en onderzoek naar pathogenen van Lyme Borreliose 

Gelijktijdige detectie van verschillende antilichaamklassen in een gemultiplexte serologische test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Kwantificering van door vaccins geïnduceerde neutraliserende antilichamen in SARS-CoV-2-varianten

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Auteur in de schijnwerpers: een pseudotype-virussysteem voor het beoordelen van Omicron-subvarianten en neutraliserende antilichamen in SARS-CoV-2-onderzoek

Toepassing van Ha-CoV-2-pseudovirus voor snelle kwantificering van SARS-CoV-2-varianten en neutraliserende antilichamen

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...