Name: detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Nous apprécions et remercions l’assistance technique de Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin et Christiano Tanese De Souza. Nous remercions également Mina Ghahremani pour la conception graphique. Nous tenons également à remercier toutes les personnes qui ont participé et donné leurs échantillons de sang pour cette étude. DWC est soutenu en partie par la faculté et le département de médecine de l’Université d’Ottawa.

REMARQUE: Le protocole décrit ci-dessous adhère à toutes les directives d’éthique conformément au code de protocole 20200371-01H.
1. Production et évaluation du bioreporter HiBiT-RBD
<ol><li>Produire une quantité suffisante de bioreporter HiBiT-RBD<ol>
<li>Se préparer à la culture cellulaire<ol>
<li>Préparer le milieu Eagle modifié (DMEM) complet de Dulbecco contenant 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline/streptomycine. Ensuite, réchauffez le média dans un bain-ma...

<ol>
	<li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+coronavirus+2019+(COVID-19)+pandemic+outbreak:+A+comprehensive+review+of+the+current+literature.">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li><li>Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: <a target="_blank" href="https://www.worldometers.info/coronavirus/">https://www.worldometers.info/coronavirus/</a> (2021)</li><li>Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+wave+COVID-19+pandemics+in+Europe:+a+temporal+playbook.">Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).</li><li>COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines">https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines</a> (2021)</li><li>Hueston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+response+to+SARS-CoV-2+infection.">The antibody response to SARS-CoV-2 infection.</a> Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).</li><li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor.">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology.">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li><li>Premkumar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor-binding+domain+of+the+viral+spike+protein+is+an+immunodominant+and+highly+specific+target+of+antibodies+in+SARS-CoV-2+patients.">The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients.</a> Science Immunology. 5 (48), (2020).</li><li>Walls, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elicitation+of+potent+neutralizing+antibody+responses+by+designed+protein+nanoparticle+vaccines+for+SARS-CoV-2.">Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2.</a> Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).</li><li>Azad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+reveals+the+importance+of+N-+linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Mol Ther. , 0074-0075 (2021).</li><li>Bastos, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19:+systematic+review+and+meta-analysis.">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516 (2020).</li><li>Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa">https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa</a> (2021)</li><li>Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+bioluminescent+systems.">A brief review of bioluminescent systems.</a> Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion.">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening.">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP/TAZ-TEAD+biosensors.">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596 (2019).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis.">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li><li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide.">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion.">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).</li></ol>

Le nombre croissant de personnes infectées par le SARS-CoV-2 et les efforts continus pour la vaccination mondiale nécessitent des tests sérologiques sensibles et rapides qui peuvent être utilisés dans les enquêtes sérologiques à grande échelle. Des recherches récentes montrent que les biorapporteurs à base de nanoluciférase fractionnée peuvent être utilisés pour développer de tels tests. Nous avons récemment développé le biorapporteur HiBiT-RBD pour concevoir un test qui peut être utilisé pour détec...

L’émergence récente d’un nouveau coronavirus, le SRAS-CoV21, a causé plus de 2 800 000 décès et 128 millions d’infections au 30 mars 20212. En raison de l’absence d’une procédure de traitement fiable et bien établie pour les thérapies cliniques du SRAS-CoV-2, de nombreux efforts ont été déployés pour limiter la transmission virale et, plus important encore, pour développer un traitement efficace et robuste ou un vaccin3. À ce jour, plus de 50 candidats vaccins contre la COVID-19 font l’objet d’essais rapportés par l’Organisation mondiale de la Santé4. La détection d’anticorps contre le SARS-CoV-2 est d’une importance capitale pour déterminer la stabilité à long terme de la réponse humorale lors de l’administration du vaccin ainsi que chez les patients guéris de la COVID-195. Certaines études ont démontré qu’il est possible que les patients guéris du SRAS-CoV-2 perdent la plupart des anticorps de liaison à la RBD après 1 an5,6,7,8,9. Des recherches plus approfondies sont nécessaires pour mieux comprendre l’immunité durable, et des plates-formes de détection d’anticorps plus sensibles peuvent aider à poursuivre ces travaux. Les rapports sur l’immunité soutenue des infections légères par le SRAS-CoV-2, qui suggèrent des réponses anticorps à long terme, constituent également un domaine d’étude intéressant et utile. Une méthode de détection rapide et précise est essentielle pour surveiller les anticorps dans le sérum des individus afin de fournir plus d’informations sur l’immunité dans la population.
Comme d’autres coronavirus, le SARS-CoV-2 utilise la glycoprotéine de pointe saillante pour se lier à l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 (ACE2) afin d’initier une cascade d’événements qui conduisent à la fusion des membranes virale et cellulaire6,7. Plusieurs études ont récemment prouvé que la RBD de la protéine Spike joue un rôle crucial dans l’obtention d’une réponse anticorps puissante et spécifique contre le SARS-CoV28,9,10,11. En particulier, les corrélations observées par Premkumar et coll. entre le titre d’anticorps liant la RBD et la puissance de neutralisation du plasma des patients par le SRAS-CoV-2 sont compatibles avec le fait que la RBD est un compartiment immunogène de la structure du virus9. Dans cet esprit, de nombreux tests diagnostiques disponibles pour la détection des anticorps sars-CoV-2 sont longs et coûteux, nécessitent une longue procédure d’incubation et de lavage (test immuno-enzymatique [ELISA]), ou manquent de sensibilité et de précision (test immunologique à flux latéral [LFIA])12. Par conséquent, une méthode sérologique complémentaire quantitative et rapide de détection des anticorps dérivés de la COVID-19 avec une sensibilité élevée, une réponse rapide et un coût relativement faible répondrait au besoin d’un test sérologique fiable pour la surveillance épidémiologique du SRAS-CoV-2.
Collectivement, les limites des essais sérologiques actuels ont incité à étudier le système de déclaration bioluminescente en tant qu’agent de diagnostic potentiel dans les futures enquêtes sérologiques. La bioluminescence est une réaction enzyme/substrat naturelle, avec émission de lumière. La nanoluc luciférase est la plus petite (19 kDa), mais le système le plus brillant par rapport à Renilla et à la luciole luciférase (36 kDa et 61 kDa, respectivement)13,14. En outre, Nanoluc a le rapport signal / bruit le plus élevé et la stabilité parmi les systèmes mentionnés précédemment. L’intensité de signal élevée de Nanoluc prend en charge la détection de très faibles quantités de fusions rapporteures15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) est une version divisée du système Nanoluc, qui est composé de deux segments: petit BiT (11 acides aminés; SmBiT) et grand BiT (LgBiT) avec des interactions d’affinité relativement faible (KD = 190 μM) pour former un complexe luminescent16. NanoBiT est largement utilisé dans diverses études impliquant l’identification des interactions protéine-protéine15,17,18,19 et des voies de signalisation cellulaire11,20,21.
Récemment, un autre petit peptide avec une affinité nettement plus élevée pour LgBiT (KD = 0,7 nM) a été introduit, à savoir le système HiBiT Nano-Glo, à la place de SmBiT. La haute affinité et le signal fort du test Nano-Glo « add-mix-read » font de HiBiT une étiquette peptidique luminescente quantitative appropriée. Dans cette approche, la balise HiBiT est ajoutée à la protéine cible en développant une construction imposant une interférence structurelle minimale. La fusion de la protéine HiBiT se lierait activement à la contrepartie LgBiT, produisant une enzyme luciférase hautement active pour générer une bioluminescence détectable en présence de réactifs de détection (Figure 1). De même, nous avons développé un système basé sur HiBiT Nano-Glo pour mesurer facilement le titre d’anticorps neutralisants dans le sérum des individus guéris du SRAS-CoV-2 et avons récemment développé un RBD SARS-CoV-2 marqué HiBiT. Cet article décrit le protocole de production du biorapporteur HiBiT-RBD à l’aide de procédures et d’équipements de laboratoire standard, et montre comment ce biorapporteur peut être utilisé dans un test rapide et efficace pour détecter les anticorps ciblant le SARS-CoV-2 RBD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Passive Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E194A</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>171020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td>100 mL kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT-RBD Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt
				gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata
				gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg
				aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta
				agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa
				ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg
				cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc
				gttgacattgattattgactagttattaatagt
				aatcaattacggggtcattagttcatagcccat
				atatggagttccgcgttacataacttacggtaa
				atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc
				ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc
				atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc
				aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact
				tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta
				cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg
				cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat
				gggactttcctacttggcagtacatctacgtat
				tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt
				ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg
				actcacggggatttccaagtctccaccccattg
				acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc
				aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg
				ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta
				cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg
				ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg
				aaattaatacgactcactatagggagacccaa
				gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga
				gctcggatccgccaccATGGAGACAGA
				CACACTCCTGCTATGGGTACTGC
				TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC
				TGGTGACtctggctctagcggctctggctct
				agcggcggcATGGTGAGCGGCTG
				GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC
				tctagcggcGACTACAAGGACC
				ACGACGGTGACTACAAGGACCA
				CGACATCGACTACAAGGACGAC
				GACGACAAGggcagcggctccggca
				gcagcggaggaggaggctctggaggagga
				ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg
				cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat
				ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga
				atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct
				gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt
				gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac
				ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt
				gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc
				acctggacagacaggcaagatcgccgactac
				aactataagctgccagacgatttcaccggct
				gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt
				ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac
				cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt
				tgagcgggatatcagcacagagatctaccag
				gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg
				gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc
				ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca
				tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg
				cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc
				gagggccgccacatgctggagatgggccatc
				atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag
				cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac
				ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt
				gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg
				ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac
				tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat
				cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg
				ggtggggtggggcaggacagcaaggggga
				ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg
				gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa
				agaaccagctggggctctagggggtatcccca
				cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg
				ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
				acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg
				ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt
				tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta
				gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc
				ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta
				gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc
				ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg
				gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc
				ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt
				gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg
				atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt
				ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc
				caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag
				catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg
				aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt
				atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac
				catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc
				ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc
				ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc
				cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa
				gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg
				caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc
				ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt
				cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg
				ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc
				tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct
				gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg
				cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg
				tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg
				cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct
				tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg
				ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc
				ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg
				ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg
				cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc
				ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg
				agcgagcacgtactcggatggaagccggtct
				tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat
				caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca
				ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg
				atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg
				ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt
				ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt
				ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct
				acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg
				aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg
				tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc
				ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg
				ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag
				cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat
				tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt
				cggaatcgttttccgggacgccggctggatga
				tcctccagcgcggggatctcatgctggagt
				tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta
				taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa
				atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt
				ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat
				cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct
				agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc
				ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac
				aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag
				cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat
				taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
				gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa
				tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg
				tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc
				gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt
				atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc
				cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa
				catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag
				gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt
				tccataggctccgcccccctgacgagcatcac
				aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa
				acccgacaggactataaagataccaggcgtt
				tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt
				ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc
				tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat
				agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag
				gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa
				ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc
				ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag
				acacgacttatcgccactggcagcagccactg
				gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc
				ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact
				acggctacactagaagaacagtatttggtatc
				tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa
				aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa
				ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca
				agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat
				ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt
				ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa
				gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct
				tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt
				ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
				ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg
				cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca
				tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac
				gatacgggagggcttaccatctggccccagtg
				ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc
				ggctccagatttatcagcaataaaccagccag
				ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg
				caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt
				gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt
				aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag
				gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg
				cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc
				gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag
				cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca
				gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
				tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg
				ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta
				ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg
				gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg
				ggataataccgcgccacatagcagaactttaa
				aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc
				gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat
				ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact
				gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc
				tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc
				cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga
				aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat
				attattgaagcatttatcagggttattgtc
				tcatgagcggatacatatttgaatgtattt
				agaaaaataaacaaataggggttccgcgca
				catttccccgaaaagtgccacctgacgtc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein G Magnetic Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Mx Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>96-well plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2520056</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter

L’émergence de la pandémie de COVID-19 a accru le besoin de meilleures méthodes de détection sérologique pour déterminer l’impact épidémiologique du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2). Le nombre croissant d’infections par le SRAS-CoV-2 soulève la nécessité de meilleurs tests de détection des anticorps. Les méthodes actuelles de détection des anticorps compromettent la sensibilité pour la vitesse ou sont sensibles mais prennent beaucoup de temps. Une grande partie des anticorps neutralisant le SRAS-CoV-2 ciblent le domaine de liaison aux récepteurs (RBD), l’un des principaux compartiments immunogènes du SARS-CoV-2. Nous avons récemment conçu et développé un RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) hautement sensible et marqué au bioluminescent pour détecter les anticorps du SRAS-CoV-2. Le texte suivant décrit la procédure à suivre pour produire le complexe HiBiT-RBD et un test rapide pour évaluer la présence d’anticorps ciblant rbD à l’aide de cet outil. En raison de la durabilité du produit protéique HiBiT-RBD sur une large plage de températures et de la procédure expérimentale plus courte qui peut être achevée en 1 h, le protocole peut être considéré comme une alternative plus efficace pour détecter les anticorps du SRAS-CoV-2 dans les échantillons de sérum des patients.

Les signaux provenant à la fois du lysat cellulaire contenant du HiBit-RBD et du surnageant des cellules transfectées ont été enregistrés (Figure 2) pour évaluer la source de protéines appropriée. HiBiT-RBD et LgBit ont été utilisés séparément comme contrôles, et les données ont montré un faible arrière-plan par rapport à un signal fort lorsque les deux parties ont été combinées. Par conséquent, l’interaction HiBiT-RBD avec LgBiT est nécessaire pour générer une enz...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Le protocole décrit la procédure de production du complexe protéique du domaine de liaison au récepteur HiBiT et son application pour la détection rapide et sensible des anticorps anti-SARS-CoV-2.

Détection de l’anticorps du domaine de liaison au récepteur du SARS-CoV-2 à l’aide d’un biorapporteur basé sur HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Mon laboratoire a travaillé dans la recherche sur la COVID-19 et nous avons récemment mis au point un nouveau test qui nous a permis de détecter rapidement et avec précision les anticorps anti-SRAS-CoV-2. Ce protocole décrit un test à haut débit pour détecter les anticorps anti-SARS-CoV-2 dans les échantillons de sérum des patients, ce qui est essentiel compte tenu de la pandémie actuelle. La majorité des tests sérologiques actuels sacrifient la vitesse pour la sensibilité ou vice versa.Nos données montrent que notre test est à la fois sensible et a un temps de réponse rapide. Afin de produire une quantité suffisante de biorapporteur HiBiT-RBD élevé, commencez par vous préparer à la culture cellulaire. Tout d’abord, préparez le milieu d’aigle modifié complet de Dulbecco contenant 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline et de streptomycine.Ensuite, réchauffez les médias dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Allumez l’armoire de sécurité biologique et utilisez de l’éthanol à 70 % pour stériliser la surface de l’armoire. Pour cultiver la lignée cellulaire, retirez-la de moins 80 degrés Celsius ou d’azote liquide et décongelez-la dans un bain-marie de 37 degrés Celsius.Mélanger les cellules décongelées avec au moins 10 millilitres de milieu complet. Pipettez la suspension cellulaire dans une boîte de Petri de 15 centimètres et faites tourbillonner la plaque pour répartir les cellules uniformément. Placez le plat dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 85 à 95% d’humidité.Observez les cellules au microscope jusqu’à ce que le niveau de confluence atteigne 80 à 90% À haute confluence, retirez le milieu, lavez les cellules avec du PBS chaud et ajoutez trois à cinq millilitres de 0,25% de trypsine-EDTA pour détacher les cellules de la surface. Après environ cinq minutes, regardez les cellules au microscope. Si toutes les cellules flottent, ajoutez au moins quatre millilitres de milieu et transférez la suspension cellulaire dans un nouveau tube stérile.Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajoutez un million de cellules dans chaque puits d’une plaque de six puits pour la transfection. Pour effectuer la transfection du plasmide HiBiT-RBD, utilisez un microgramme du plasmide d’expression HiBiT-RBD avec un réactif de transfection approprié. Incuber pendant 10 à 15 minutes à température ambiante, puis ajouter le volume total à chaque puits de la plaque goutte à goutte.Le lendemain, remplacer le milieu contenant le mélange de transfection par un milieu complet. Observez bien le contrôle de la transfection 48 heures après la transfection. Recueillir le surnageant dans des microtubes de 1,5 millilitre.Ajouter 500 microlitres de tampon de lyse passive 1X ou PLB aux cellules, puis incuber et agiter la plaque pendant 15 minutes à température ambiante pour la lyse cellulaire. Ensuite, pour évaluer le signal de luminescence du bioreporter à l’aide d’un test de luciférase, préparez d’abord les composants de la réaction et utilisez le surnageant comme source du bioreporter. Diluer le grand BiT et le substrat à 1X avant utilisation.Transférez 50 microlitres du surnageant de chaque puits ou tube vers une plaque de 96 puits et ajoutez 50 microlitres de 1X grand BiT à chaque puits. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Ouvrez le logiciel du luminomètre, ajoutez 50 microlitres de substrat 1X à chaque puits, placez la plaque dans le luminomètre et exécutez le logiciel.Afin d’effectuer le test de détection d’anticorps HiBiT-RBD, préparez le bioreporter HiBiT-RBD comme décrit précédemment et combinez 50 microlitres du surnageant contenant du HiBiT-RBD avec un microgramme de l’anticorps commercial SARS-CoV-2 RBD dans un microtube de 1,5 millilitre. Ajouter 20 microlitres de protéine de liaison aux immunoglobulines ou de protéine G à la solution. Porter le volume total à 300 microlitres en ajoutant pbS.Incuber les tubes sur un agitateur à tube ou un rotateur pendant 30 minutes. Centrifuger à 12 000 G pendant 30 secondes. Ensuite, jetez le surnageant et lavez-le avec du PBS.Répétez le processus trois fois pour supprimer HiBiT-RBD libre. Remettez en suspension les cellules dans 50 microlitres de PBS et transférez-les sur une plaque de 96 puits. Ajoutez 50 microlitres de 1X grand BiT et attendez cinq minutes.Ajoutez ensuite 50 microlitres de substrat 1X NanoLuc. Lisez immédiatement le signal de luminescence avec un luminomètre. Préparer de plus grandes quantités du biorapporteur HiBiT-RBD pour un essai à haut débit et combiner 20 microlitres de protéine G magnétique avec 50 microlitres du surnageant HiBiT-RBD dans chaque puits d’une plaque de 96 puits pour chaque échantillon.Ajouter 10 microlitres de l’échantillon de sérum à chaque puits et porter le volume total à 150 microlitres en ajoutant du PBS. Incuber pendant 30 minutes sur un agitateur à température ambiante. Ensuite, placez la plaque sur une rondelle magnétique pour précipiter le complexe d’anticorps de la protéine G.Jetez la solution dans la section centrale de chaque puits et ajoutez PBS pour le lavage. Répétez l’étape de lavage au moins trois fois pour éliminer l’excès de HiBiT-RBD. Ajouter 50 microlitres de 1X PBS et 50 microlitres de 1X grand BiT et incuber pendant au moins cinq minutes à température ambiante.Préparez le logiciel du luminomètre. Ajoutez ensuite 50 microlitres de substrat 1X. Placez la plaque dans la machine, exécutez le logiciel et enregistrez les signaux.Comparez les signaux des échantillons de sérum, des échantillons de contrôle et du signal de fond des puits vides. Les signaux provenant à la fois du lysat cellulaire contenant du HiBiT-RBD et du surnageant des cellules transfectées ont été enregistrés pour évaluer la source de protéines appropriée. Les données ont montré un arrière-plan faible par rapport à un signal fort lorsque les deux parties ont été combinées.L’ajout de protéine G aide à la précipitation des anticorps. Le test a été utilisé pour comparer le signal d’un anticorps neutralisant commercial du SRAS-CoV-2 avec une IgG témoin. Le signal d’anticorps spécifique était robuste, tandis que l’anticorps témoin avait un niveau proche du niveau de fond luminescent.Le virus de la stomatite vésiculeuse vésiculeuse atténuée recombinante ou VSV avec une mutation à la position 51 de la protéine M exprimant la RBD exogène a été utilisé pour vacciner des souris. Le sérum prélevé sur des souris vaccinées a produit un signal robuste par rapport à aucun signal chez les souris injectées avec VSV témoin. Ce protocole peut être utilisé pour la détection des anticorps anti-SARS-CoV-2 dans des échantillons de sérum de patients.Les étapes de lavage après l’incubation avec la protéine G sont essentielles pour réduire le fond. De plus, il est important d’ajouter le substrat le plus rapidement possible pour éviter la perte de signal. Avec quelques étapes d’optimisation supplémentaires, le même test peut être utilisé pour analyser des échantillons de sang et pourrait être une méthode efficace pour déterminer les anticorps anti-SARS-CoV-2 dans les échantillons de sang de patients.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisation du SARS-CoV-2 à l’aide de l’hybridation in situ par immuno-ARN-fluorescence

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Recherche

Immunologie et infection

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Détection des anticorps neutralisants du SRAS-CoV-2 à l’aide de l’imagerie fluorescente à haut débit de l’infection à pseudovirus

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Un test de neutralisation rapide et multiplex à double rapporteur IgG et IgM SARS-CoV-2 pour un système d’analyse de débit à base de billes multiplexées

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Imagerie vivante et quantification de l’infection virale chez des souris transgéniques K18 hACE2 à l’aide du SARS-CoV-2 recombinant exprimant le rapporteur

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Stratégie de diagnostic de la salive par PCR à transcriptase inverse quantitative efficace du SRAS-CoV-2 utilisant des robots de pipetage open source

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Dosage immunologique multiplex pour les IgG et IgM spécifiques de Borrelia dans le sérum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Pleins feux sur l’auteur : Élargissement de la portée des immunoessais multiplex pour le diagnostic de la borréliose de Lyme et la recherche sur les agents pathogènes 

Détection simultanée de différentes classes d’anticorps dans un test sérologique multiplexé

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantification des anticorps neutralisants induits par le vaccin dans les variants du SRAS-CoV-2

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Pleins feux sur l’auteur : Un système de pseudotype de virus pour évaluer les sous-variants d’Omicron et les anticorps neutralisants dans la recherche sur le SRAS-CoV-2

Application du pseudovirus Ha-CoV-2 pour la quantification rapide des variants du SRAS-CoV-2 et des anticorps neutralisants

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...