Name: detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

אנו מעריכים ומודים לסיוע הטכני של שיאוהונג הוא, ריקרדו מריוס, ג'וליה פטריק, בראדלי אוסטין וכריסטיאנו טאנזה דה סוזה. אנו מודים גם למינה גהרמני על עיצוב גרפי. ברצוננו גם להודות לכל האנשים שהשתתפו ותרמו את דגימות הדם שלהם למחקר זה. DWC נתמך בחלקו על ידי הפקולטה uOttawa והמחלקה לרפואה.

הערה: הפרוטוקול המתואר להלן דבק בכל הנחיות האתיקה על פי קוד הפרוטוקול 20200371-01H.
1. ייצור והערכה של הדו"ח הביולוגי HiBiT-RBD
<ol><li>ייצור כמות מספקת של ביו-סרבטור HiBiT-RBD<ol>
<li>הכנה לתרבות תאים<ol>
<li>הכן את מדיום הנשר (DMEM) המותאם של Dulbecco המכיל 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. לאחר ?...

<ol>
	<li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+coronavirus+2019+(COVID-19)+pandemic+outbreak:+A+comprehensive+review+of+the+current+literature.">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li><li>Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: <a target="_blank" href="https://www.worldometers.info/coronavirus/">https://www.worldometers.info/coronavirus/</a> (2021)</li><li>Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+wave+COVID-19+pandemics+in+Europe:+a+temporal+playbook.">Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).</li><li>COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines">https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines</a> (2021)</li><li>Hueston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+response+to+SARS-CoV-2+infection.">The antibody response to SARS-CoV-2 infection.</a> Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).</li><li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor.">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology.">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li><li>Premkumar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor-binding+domain+of+the+viral+spike+protein+is+an+immunodominant+and+highly+specific+target+of+antibodies+in+SARS-CoV-2+patients.">The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients.</a> Science Immunology. 5 (48), (2020).</li><li>Walls, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elicitation+of+potent+neutralizing+antibody+responses+by+designed+protein+nanoparticle+vaccines+for+SARS-CoV-2.">Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2.</a> Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).</li><li>Azad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+reveals+the+importance+of+N-+linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Mol Ther. , 0074-0075 (2021).</li><li>Bastos, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19:+systematic+review+and+meta-analysis.">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516 (2020).</li><li>Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa">https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa</a> (2021)</li><li>Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+bioluminescent+systems.">A brief review of bioluminescent systems.</a> Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion.">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening.">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP/TAZ-TEAD+biosensors.">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596 (2019).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis.">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li><li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide.">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion.">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).</li></ol>

המספר ההולך וגדל של אנשים שנדבקו ב- SARS-CoV-2 והמאמץ המתמשך לחיסון גלובלי מחייבים בדיקות סרולוגיות רגישות ומהירות שניתן להשתמש בהן בסרוסוריבים בקנה מידה גדול. מחקר שנערך לאחרונה מראה כי bioreporters מבוסס ננו-לוציפראז מפוצלים ניתן להשתמש כדי לפתח מותנים כאלה. לאחרונה פיתחנו את הביו-דו"ח HiBiT-RBD כדי ל...

הופעתו האחרונה של נגיף הקורונה החדש, SARS-CoV21, גרמה ליותר מ-2,800,000 מקרי מוות ו-128 מיליון זיהומים נכון ל-30 במרץ 20212. בשל היעדר הליך טיפול אמין ומבוסס היטב לטיפולים קליניים SARS-CoV-2, נעשו מאמצים רבים להגביל העברה ויראלית נוספת וחשוב מכך, לפתח טיפול יעיל וחזק או חיסון3. עד כה, ישנם יותר מ -50 מועמדים לחיסון COVID-19 בניסויים שדווחו על ידי ארגון הבריאות העולמי4. איתור נוגדנים נגד SARS-CoV-2 הוא בעל חשיבות עליונה לקבוע את היציבות ארוכת הטווח של תגובה הומוריסטית בעת מתן החיסון, כמו גם בחולים שהחלימו מ- COVID-195. מספר מחקרים הראו כי קיימת אפשרות כי חולי SARS-CoV-2 התאושש לאבד את רוב נוגדנים מחייב RBD לאחר שנה אחת5,6,7,8,9. דרושה חקירה נוספת כדי להבין טוב יותר את החסינות המתמשכת, ופלטפורמות רגישות יותר לזיהוי נוגדנים יכולות לסייע בהמשך עבודה כזו. דיווחים על חסינות מתמשכת של זיהומים מתונים SARS-CoV-2, המציעים תגובות נוגדנים לטווח ארוך, הוא גם תחום מחקר מעניין וכדאי. שיטת זיהוי מהירה ומדויקת חיונית לניטור נוגדנים בסרה של אנשים כדי לספק מידע נוסף על חסינות באוכלוסייה.
כמו נגיפי קורונה אחרים, SARS-CoV-2 משתמש בגליקופרוטאין ספייק בולט כדי להיקשר לאנגי-טנסין-ממיר אנזים-2 (ACE2) כדי ליזום מפל של אירועים שמובילים להיתוך של קרום הנגיפי והתא6,7. מספר מחקרים הוכיחו לאחרונה כי ל-RBD של חלבון ספייק יש תפקיד מכריע בהצתת תגובת נוגדנים עוצמתית וספציפית נגד SARS-CoV28,9,10,11. בפרט, קורלציות שנצפו על ידי Premkumar ואח ' בין titer של נוגדן מחייב RBD ועוצמה נטרול SARS-CoV-2 של פלזמה של חולים עולים בקנה אחד עם RBD להיות תא אימונוגני של מבנה הנגיף9. עם זאת, בדיקות אבחון רבות הזמינות לזיהוי נוגדנים SARS-CoV-2 הן זמן ועלויות אינטנסיביות, דורשות הליך ממושך של דגירה ושטיפה (בדיקת חיסונים הקשורה לאנזים [ELISA]), או חוסר רגישות ודיוק (אימונואוסי זרימה לרוחב [LFIA])12. לכן, שיטה סרולוגית משלימה כמותית ומהירה של זיהוי נוגדנים שמקורו ב- COVID-19 עם רגישות גבוהה, תגובה מהירה ועלות נמוכה יחסית תשרת את הצורך בבדיקה סרולוגית אמינה למעקב אפידמיולוגי SARS-CoV-2.
באופן קולקטיבי, המגבלות של הבדיקות הסרולוגיות הנוכחיות הובילו לחקירת מערכת הדיווח הביו-זוהרת כסוכן אבחון פוטנציאלי בסרוסוריים עתידיים. ביולומינציה היא תגובת אנזים/מצע טבעית, עם פליטת אור. Nanoluc לוציפראז הוא הקטן ביותר (19 kDa), עדיין המערכת הבהירה ביותר בהשוואה רנילה ולוציפראז גחלילית (36 kDa ו 61 kDa, בהתאמה)13,14. יתר על כן, Nanoluc יש את יחס האות לרעש הגבוה ביותר ויציבות בין המערכות שהוזכרו קודם לכן. עוצמת האות הגבוהה של Nanoluc תומכת בזיהוי כמויות נמוכות מאוד של היתוך כתבים15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) היא גרסה מפוצלת של מערכת Nanoluc, המורכבת משני מקטעים: BiT קטן (11 חומצות אמינו; SmBiT) ו- BiT גדול (LgBiT) עם אינטראקציות זיקה נמוכה יחסית (KD = 190 מיקרומטר ) כדי ליצור קומפלקס זוהר16. NanoBiT נמצא בשימוש נרחב במחקרים שונים הכוללים זיהוי של אינטראקציות חלבון חלבון15,17,18,19 ומסלולי איתות תאיים11,20,21.
לאחרונה, פפטיד קטן נוסף עם זיקה גבוהה יותר באופן מובהק LgBiT (KD = 0.7 nM) הוצג, כלומר מערכת HiBiT Nano-Glo, במקום SmBiT. הזיקה הגבוהה והאות החזק של ננו-גלו "להוסיף-לערבב-לקרוא" אסאי עושה HiBiT מתאים, כמותי, תג פפטיד זוהר. בגישה זו, תג HiBiT מצורף לחלבון היעד על ידי פיתוח מבנה המטיל הפרעה מבנית מינימלית. היתוך חלבון HiBiT ייקשר באופן פעיל למקבילו LgBiT, ויפיק אנזים לוציפראז פעיל מאוד כדי ליצור ביו-לומינציה הניתנת לזיהוי בנוכחות ריאגנטים לזיהוי (איור 1). באופן דומה, פיתחנו מערכת מבוססת HiBiT Nano-Glo כדי למדוד בקלות את טיטר הנוגדנים המנטרל בסרה של אנשים שהתאוששו SARS-CoV-2 ולאחרונה פיתחנו RBD SARS-CoV-2 מתויג HiBiT. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לייצור bioreporter HiBiT-RBD באמצעות נהלי מעבדה סטנדרטיים וציוד, ומראה כיצד ניתן להשתמש ב- bioreporter זה בבוחן מהיר ויעיל לזיהוי נוגדנים המיועדים ל- SARS-CoV-2 RBD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Passive Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E194A</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>171020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td>100 mL kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT-RBD Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt
				gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata
				gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg
				aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta
				agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa
				ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg
				cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc
				gttgacattgattattgactagttattaatagt
				aatcaattacggggtcattagttcatagcccat
				atatggagttccgcgttacataacttacggtaa
				atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc
				ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc
				atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc
				aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact
				tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta
				cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg
				cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat
				gggactttcctacttggcagtacatctacgtat
				tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt
				ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg
				actcacggggatttccaagtctccaccccattg
				acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc
				aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg
				ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta
				cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg
				ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg
				aaattaatacgactcactatagggagacccaa
				gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga
				gctcggatccgccaccATGGAGACAGA
				CACACTCCTGCTATGGGTACTGC
				TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC
				TGGTGACtctggctctagcggctctggctct
				agcggcggcATGGTGAGCGGCTG
				GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC
				tctagcggcGACTACAAGGACC
				ACGACGGTGACTACAAGGACCA
				CGACATCGACTACAAGGACGAC
				GACGACAAGggcagcggctccggca
				gcagcggaggaggaggctctggaggagga
				ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg
				cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat
				ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga
				atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct
				gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt
				gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac
				ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt
				gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc
				acctggacagacaggcaagatcgccgactac
				aactataagctgccagacgatttcaccggct
				gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt
				ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac
				cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt
				tgagcgggatatcagcacagagatctaccag
				gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg
				gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc
				ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca
				tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg
				cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc
				gagggccgccacatgctggagatgggccatc
				atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag
				cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac
				ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt
				gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg
				ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac
				tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat
				cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg
				ggtggggtggggcaggacagcaaggggga
				ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg
				gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa
				agaaccagctggggctctagggggtatcccca
				cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg
				ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
				acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg
				ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt
				tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta
				gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc
				ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta
				gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc
				ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg
				gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc
				ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt
				gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg
				atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt
				ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc
				caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag
				catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg
				aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt
				atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac
				catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc
				ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc
				ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc
				cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa
				gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg
				caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc
				ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt
				cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg
				ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc
				tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct
				gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg
				cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg
				tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg
				cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct
				tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg
				ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc
				ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg
				ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg
				cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc
				ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg
				agcgagcacgtactcggatggaagccggtct
				tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat
				caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca
				ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg
				atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg
				ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt
				ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt
				ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct
				acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg
				aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg
				tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc
				ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg
				ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag
				cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat
				tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt
				cggaatcgttttccgggacgccggctggatga
				tcctccagcgcggggatctcatgctggagt
				tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta
				taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa
				atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt
				ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat
				cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct
				agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc
				ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac
				aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag
				cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat
				taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
				gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa
				tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg
				tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc
				gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt
				atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc
				cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa
				catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag
				gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt
				tccataggctccgcccccctgacgagcatcac
				aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa
				acccgacaggactataaagataccaggcgtt
				tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt
				ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc
				tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat
				agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag
				gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa
				ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc
				ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag
				acacgacttatcgccactggcagcagccactg
				gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc
				ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact
				acggctacactagaagaacagtatttggtatc
				tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa
				aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa
				ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca
				agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat
				ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt
				ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa
				gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct
				tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt
				ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
				ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg
				cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca
				tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac
				gatacgggagggcttaccatctggccccagtg
				ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc
				ggctccagatttatcagcaataaaccagccag
				ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg
				caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt
				gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt
				aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag
				gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg
				cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc
				gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag
				cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca
				gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
				tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg
				ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta
				ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg
				gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg
				ggataataccgcgccacatagcagaactttaa
				aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc
				gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat
				ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact
				gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc
				tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc
				cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga
				aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat
				attattgaagcatttatcagggttattgtc
				tcatgagcggatacatatttgaatgtattt
				agaaaaataaacaaataggggttccgcgca
				catttccccgaaaagtgccacctgacgtc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein G Magnetic Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Mx Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>96-well plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2520056</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter

הופעתה של מגפת COVID-19 הגבירה את הצורך בשיטות זיהוי סרולוגיות טובות יותר כדי לקבוע את ההשפעה האפידמיולוגית של תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2). המספר ההולך וגדל של זיהומי SARS-CoV-2 מעלה את הצורך בגילוי נוגדנים טוב יותר. שיטות זיהוי הנוגדנים הנוכחיות פוגעות ברגישות למהירות או רגישות אך גוזלות זמן רב. חלק גדול מהנוגדנים המנטרלים SARS-CoV-2 מכוונים לתחום איגוד הקולטן (RBD), אחד התאים האימונוגניים העיקריים של SARS-CoV-2. לאחרונה עיצבנו ופיתחנו RBD רגיש מאוד, מתויג ביו-זוהר (NanoLuc HiBiT-RBD) כדי לזהות נוגדנים SARS-CoV-2. הטקסט הבא מתאר את ההליך לייצור קומפלקס HiBiT-RBD ובחינת הפעלה מהירה כדי להעריך את נוכחותם של נוגדנים המיועדים ל-RBD באמצעות כלי זה. בשל עמידותו של מוצר חלבון HiBiT-RBD על פני מגוון רחב של טמפרטורות ואת ההליך הניסיוני הקצר יותר שניתן להשלים בתוך 1 שעות, הפרוטוקול יכול להיחשב כחלופה יעילה יותר לזיהוי נוגדנים SARS-CoV-2 בדגימות סרום המטופל.

האותות הן מהתאים המכילים HiBit-RBD והן מ-supernatant של התאים שהודבקו נרשמו (איור 2) כדי להעריך את מקור החלבון המתאים. HiBiT-RBD ו- LgBit שימשו בנפרד כפקדים, והנתונים הראו רקע נמוך בהשוואה לאות חזק כאשר שני החלקים שולבו. לפיכך, אינטראקציה HiBiT-RBD עם LgBiT הכרחית כדי ליצור אנזים פעיל לעיכול מצע ופע?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

הפרוטוקול המתואר מתאר את ההליך לייצור קומפלקס חלבון תחום מחייב קולטן HiBiT ויישום שלו לזיהוי מהיר ורגיש של נוגדני SARS-CoV-2.

זיהוי נוגדן דומיין מחייב קולטן SARS-CoV-2 באמצעות ביו-דו"ח מבוסס HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

המעבדה שלי עובדת במחקר COVID-19, ולאחרונה פיתחנו בדיקת ניסיון חדשנית שאפשרה לנו לזהות במהירות ובדייקנות נוגדני SARS-CoV-2. פרוטוקול זה מתאר בדיקת תפוקה גבוהה לאיתור נוגדנים נגד SARS-CoV-2 בדגימות סרום מטופלים, וזה קריטי בהתחשב במגפה הנוכחית. רוב ההקרבות הסרולוגיות הנוכחיות מקריבות מהירות לרגישות או להיפך.הנתונים שלנו מראים שביידת התחת שלנו רגישה ויש לה זמן תגובה מהיר. על מנת לייצר כמות מספקת של bioreporter HiBiT-RBD גבוה, להתחיל על ידי הכנה לתרבות התא. ראשית, הכינו את מדיום הנשר המותאם של דולבק המכיל 10% סרום בקר עוברי ו-1%פניצילין וסטסטרוטומיצין.ואז לחמם את התקשורת באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הפעל את ארון הבטיחות הביולוגי והשתמש ב-70% אתנול לחיטוי פני הארון. כדי לתרבות קו התא, להוציא אותו ממינוס 80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי ולהפשיר אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.מערבבים את התאים המופשרים עם לפחות 10 מיליליטר של מדיום מלא. פיפטה את התליית התא לתוך צלחת פטרי 15 ס"מ מערבבים את הצלחת כדי להפיץ את התאים באופן אחיד. מניחים את המנה באינקובטור תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני ו-85 עד 95% לחות.התבונן בתאים מתחת למיקרוסקופ עד שרמת ההשפעה מגיעה ל -80 עד 90% בעוצמה גבוהה, הסר את המדיום, שטף את התאים עם PBS חם והוסף שלושה עד חמישה מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA כדי לנתק את התאים מפני השטח. לאחר כחמש דקות, להסתכל על התאים תחת מיקרוסקופ. אם כל התאים צפים, להוסיף לפחות ארבעה מיליליטר של בינוני ולהעביר את השעיית התא לתוך צינור סטרילי חדש.לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהוסיף מיליון תאים לתוך כל באר של צלחת שש באר עבור transfection. כדי לבצע טרנספקטציה של הפלסמיד HiBiT-RBD, השתמש במיקרוגרם אחד של ביטוי HiBiT-RBD plasmid עם ריאגנט transfection מתאים. דגירה במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף את הנפח הכולל לכל באר של הצלחת dropwise.למחרת, להחליף את המדיום המכיל את תערובת transfection עם מדיום מלא. שימו לב לבקרת ההדבקה היטב 48 שעות לאחר ההדבקה. לאסוף את supernatant ב 1.5 מיליליטר microtubes.הוסף 500 מיקרוליטרים של חיץ תמה פסיבית 1X או PLB לתאים, ולאחר מכן לדגור ולנער את הצלחת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עבור תמה תא. לאחר מכן, כדי להעריך את אות luminescence מן bioreporter באמצעות בדיקת לוציפראז, ראשית להכין את רכיבי התגובה ולהשתמש supernatant כמקור של bioreporter. יש לדלל את ה-BiT הגדול ואת המצע לפי 1 לפני השימוש.העבר 50 מיקרוליטרים של supernatant מכל באר או צינור לצלחת 96 טוב ולהוסיף 50 microliters של 1X גדול BiT לכל באר. דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. פתח את תוכנת לומינומטר, הוסף 50 מיקרוליטרים של מצע פי 1 לכל באר, מקם את הצלחת ב- luminometer והפעל את התוכנה.על מנת לבצע את בדיקות זיהוי הנוגדנים HiBiT-RBD, הכינו את הביו-דו"ח HiBiT-RBD כפי שתואר בעבר ושלבו 50 מיקרוליטרים של HiBiT-RBD המכילים סופרנטנט עם מיקרוגרם אחד של נוגדן SARS-CoV-2 RBD מסחרי במיקרו-טיוב של 1.5 מיליליטר. הוסיפו לתמיסה 20 מיקרוליטרים של חלבון מחייב אימונוגלובולין או חלבון G. הבא את הנפח הכולל ל- 300 מיקרוליטרים על-ידי הוספת PBS.לדגור את הצינורות על שייקר צינור או סיבוב במשך 30 דקות. צנטריפוגה ב-12, 000 אלף למשך 30 שניות. ואז להשליך את supernatant ולשטוף עם PBS.חזור על התהליך שלוש פעמים כדי להסיר HiBiT-RBD בחינם. resuspend התאים ב 50 microliters של PBS ולהעביר אותו לצלחת 96 באר. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של BiT גדול פי 1 והמתינו חמש דקות.לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטרים של מצע 1X NanoLuc. מיד לקרוא את אות הזוהר עם לומינומטר. הכן כמויות גדולות יותר של bioreporter HiBiT-RBD לבדיקת תפוקה גבוהה ולשלב 20 מיקרוליטרים של חלבון G מגנטי עם 50 מיקרוליטרים של Supernatant HiBiT-RBD בכל באר של צלחת 96 טוב עבור כל מדגם.הוסף 10 מיקרוליטרים של דגימת הסרום לכל באר והבא את הנפח הכולל ל-150 מיקרוליטרים על ידי הוספת PBS. דגירה במשך 30 דקות על שייקר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מניחים את הצלחת על מכונת כביסה מגנטית כדי לזרז את קומפלקס נוגדני חלבון G.יש להשליך את הפתרון בחלק האמצעי של כל באר ולהוסיף PBS לשטיפה. חזור על שלב הכביסה לפחות שלוש פעמים כדי להסיר עודף HiBiT-RBD. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של 1X PBS ו-50 מיקרוליטרים של BiT גדול פי 1 ודגרה למשך חמש דקות לפחות בטמפרטורת החדר.הכן את תוכנת מד הזוהר. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטרים של מצע פי 1. הנח את הלוח במכונה, הפעל תוכנה והקלט את האותות.השווה את האותות מדגימות סרום, דגימות בקרה ואות רקע מבארות ריקות. האותות הן של HiBiT-RBD המכיל ליסאט תא סופרנטנט של התאים transfected נרשמו כדי להעריך את מקור החלבון המתאים. הנתונים הראו רקע נמוך בהשוואה לאות חזק כאשר שני החלקים שולבו.התוספת של חלבון G מסייעת למשפכי נוגדנים. ההבחנה שימשה כדי להשוות את האות מנוגדן נטרול SARS-CoV-2 מסחרי עם IgG שליטה. אות הנוגדנים הספציפי היה חזק, בעוד שנוגדן הבקרה היה קרוב לרמת הרקע הזוהרת.רקומביננט מוחלש על ידי וירוס ריסוליטיס או VSV עם מוטציה במיקום 51 של חלבון M המבטא RBD אקסוגני שימש לחיסון עכברים. הסרום שנאסף מעכברים מחוסנים יצר אות חזק בהשוואה ללא אות בעכברים שהוזרקו עם בקרת VSV. פרוטוקול זה יכול לשמש לגילוי נוגדני SARS-CoV-2 בדגימות סרום המטופל.שלבי הכביסה לאחר הדגירה עם חלבון G הם קריטיים להפחתת הרקע. בנוסף, חשוב להוסיף את המצע מהר ככל האפשר כדי למנוע אובדן אות. עם כמה צעדי אופטימיזציה נוספים, ניתן להשתמש באותה בדיקת אסדה כדי לנתח דגימות דם ויכולה להיות שיטה יעילה לקביעת נוגדנים נגד SARS-CoV-2 בדגימות דם של מטופלים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

הדמיה של SARS-CoV-2 באמצעות אימונו RNA-פלואורסצנטיות בהכלאה Situ

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

זיהוי נוגדנים מנטרלים SARS-CoV-2 באמצעות הדמיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה של זיהום פסאודווירוס

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

בדיקת נטרול מהירה, מולטיפלקס כפולה IgG ו- IgM SARS-CoV-2 עבור מערכת ניתוח זרימה מבוססת חרוזים מרובי קסים

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי בעכברים מהונדסים K18 hACE2 באמצעות דיווח-מבטא רקומביננטי SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

יעיל SARS-CoV-2 כמותי הפוך Transcriptase PCR רוק אסטרטגיה אבחון באמצעות רובוטים צנרת קוד פתוח

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay עבור IgG ו- IgM ספציפיים לבורליה בסרום

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

זרקור המחבר: הרחבת היקף הבדיקות החיסוניות המרובות לאבחון בורליוזיס ליים ומחקר פתוגנים 

זיהוי סימולטני של סוגי נוגדנים שונים בבדיקה סרולוגית מרובת משתתפים

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

כימות נוגדנים מנטרלים הנגרמים על ידי חיסון בגרסאות SARS-CoV-2

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

זרקור המחבר: מערכת וירוס פסאודוטיפ להערכת תת-וריאנטים של אומיקרון ונטרול נוגדנים במחקר SARS-CoV-2

יישום של Ha-CoV-2 Pseudovirus לכימות מהיר של גרסאות SARS-CoV-2 ונוגדנים מנטרלים

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...