Name: detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

हम Xiaohong He, रिकार्डो Marius, जूलिया Petryk, ब्रैडली ऑस्टिन, और Christiano Tanese डी सूजा की तकनीकी सहायता की सराहना करते हैं और धन्यवाद देते हैं। हम ग्राफिक डिजाइन के लिए मीना घहरेमानी को भी धन्यवाद देते हैं। हम उन सभी व्यक्तियों को भी धन्यवाद देना चाहते हैं जिन्होंने इस अध्ययन के लिए भाग लिया और अपने रक्त के नमूने दान किए। DWC यू ओटावा संकाय और चिकित्सा विभाग द्वारा भाग में समर्थित है।

नोट:: नीचे वर्णित प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल कोड 20200371-01H के अनुसार सभी नैतिकता दिशानिर्देशों का पालन करता है।
1. HiBiT-RBD bioreporter का उत्पादन और मूल्यांकन
<ol><li>HiBiT-RBD bioreporter की पर्याप्त मात्रा का उत्पादन<ol>
<li>सेल संस्क...

<ol>
	<li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+coronavirus+2019+(COVID-19)+pandemic+outbreak:+A+comprehensive+review+of+the+current+literature.">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li><li>Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: <a target="_blank" href="https://www.worldometers.info/coronavirus/">https://www.worldometers.info/coronavirus/</a> (2021)</li><li>Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+wave+COVID-19+pandemics+in+Europe:+a+temporal+playbook.">Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).</li><li>COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines">https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines</a> (2021)</li><li>Hueston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+response+to+SARS-CoV-2+infection.">The antibody response to SARS-CoV-2 infection.</a> Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).</li><li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor.">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology.">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li><li>Premkumar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor-binding+domain+of+the+viral+spike+protein+is+an+immunodominant+and+highly+specific+target+of+antibodies+in+SARS-CoV-2+patients.">The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients.</a> Science Immunology. 5 (48), (2020).</li><li>Walls, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elicitation+of+potent+neutralizing+antibody+responses+by+designed+protein+nanoparticle+vaccines+for+SARS-CoV-2.">Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2.</a> Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).</li><li>Azad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+reveals+the+importance+of+N-+linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Mol Ther. , 0074-0075 (2021).</li><li>Bastos, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19:+systematic+review+and+meta-analysis.">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516 (2020).</li><li>Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa">https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa</a> (2021)</li><li>Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+bioluminescent+systems.">A brief review of bioluminescent systems.</a> Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion.">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening.">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP/TAZ-TEAD+biosensors.">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596 (2019).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis.">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li><li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide.">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion.">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).</li></ol>

सार्स-कोव-2 से संक्रमित लोगों की बढ़ती संख्या और वैश्विक टीकाकरण के लिए चल रहे प्रयास के लिए संवेदनशील और तेजी से सीरोलॉजिक परीक्षणों की आवश्यकता होती है जिनका उपयोग बड़े पैमाने पर सीरोसर्वे में किया ?...

हाल ही में एक नए कोरोनोवायरस, सार्स-कोव 21 के उद्भव ने 30 मार्च, 20212 तक 2,800,000 से अधिक मौतों और 128 मिलियन संक्रमणों का कारण बना है। सार्स-कोव -2 नैदानिक उपचारों के लिए एक विश्वसनीय और अच्छी तरह से स्थापित उपचार प्रक्रिया की कमी के कारण, आगे वायरल संचरण को प्रतिबंधित करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं और अधिक महत्वपूर्ण बात यह है कि एक प्रभावी और मजबूत उपचार या एक वैक्सीन विकसित करने के लिए। आज तक, विश्व स्वास्थ्य संगठन 4 द्वारा रिपोर्ट किए गए परीक्षणों में 50 से अधिक कोविड -19 वैक्सीन उम्मीदवार हैं। सार्स-कोव-2 के खिलाफ एंटीबॉडी का पता लगाना वैक्सीन के प्रशासन के साथ-साथ कोविड-195 के ठीक हो चुके रोगियों में ह्यूमरस प्रतिक्रिया की दीर्घकालिक स्थिरता को निर्धारित करने के लिए सर्वोपरि है। कुछ अध्ययनों से पता चला है कि इस बात की संभावना है कि बरामद सार्स-कोव -2 रोगियों ने 1 वर्ष 5,6,7,8,9 के बाद अधिकांश आरबीडी-बाध्यकारी एंटीबॉडी खो दिए हैं। स्थायी प्रतिरक्षा को बेहतर ढंग से समझने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है, और अधिक संवेदनशील एंटीबॉडी डिटेक्शन प्लेटफॉर्म इस तरह के काम को आगे बढ़ाने में मदद कर सकते हैं। हल्के सार्स-कोव -2 संक्रमणों की निरंतर प्रतिरक्षा की रिपोर्ट, जो दीर्घकालिक एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का सुझाव देती है, भी अध्ययन का एक दिलचस्प और सार्थक क्षेत्र है। आबादी में प्रतिरक्षा के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करने के लिए व्यक्तियों के सेरा में एंटीबॉडी की निगरानी के लिए पता लगाने का एक तेज़ और सटीक तरीका आवश्यक है।
अन्य कोरोनोवायरस की तरह, सार्स-कोव -2 एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम -2 (एसीई 2) को बांधने के लिए उभरे हुए स्पाइक ग्लाइकोप्रोटीन का उपयोग करता है ताकि वायरल और सेल झिल्ली के संलयन की ओर ले जाने वाली घटनाओं का एक झरना शुरू किया जा सके। कई अध्ययनों ने हाल ही में स्पाइक प्रोटीन के आरबीडी को सार्स-कोव 28,9,10,11 के खिलाफ शक्तिशाली और विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रिया प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए साबित किया है। विशेष रूप से, आरबीडी-बाइंडिंग एंटीबॉडी के टिटर और रोगियों के प्लाज्मा की सार्स-कोव -2 न्यूट्रलाइजेशन शक्ति के बीच प्रेमकुमार एट अल द्वारा देखे गए सहसंबंध आरबीडी के वायरस संरचना 9 के एक इम्युनोजेनिक डिब्बे होने के अनुरूप हैं। इस बात को ध्यान में रखते हुए, सार्स-कोव -2 एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए उपलब्ध कई नैदानिक परीक्षण समय और लागत-गहन हैं, इनक्यूबेशन और धोने की एक लंबी प्रक्रिया की आवश्यकता होती है (एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसोर्बेंट परख [एलिसा]), या संवेदनशीलता और सटीकता की कमी (पार्श्व प्रवाह immunoassay [LFIA])12। इसलिए, उच्च संवेदनशीलता, तेज प्रतिक्रिया और अपेक्षाकृत कम लागत के साथ कोविड-19-व्युत्पन्न एंटीबॉडी का पता लगाने की एक मात्रात्मक और तेजी से पूरक सीरोलॉजिकल विधि सार्स-कोव -2 महामारी विज्ञान निगरानी के लिए एक विश्वसनीय सेरोलॉजिक परीक्षण की आवश्यकता को पूरा करेगी।
सामूहिक रूप से, वर्तमान सीरोलॉजिकल assays की सीमाओं ने भविष्य के सेरोसर्वे में एक संभावित नैदानिक एजेंट के रूप में बायोल्यूमिनेसेंट रिपोर्टिंग सिस्टम की जांच को प्रेरित किया। बायोल्यूमिनेसेंस एक स्वाभाविक रूप से होने वाली एंजाइम / सब्सट्रेट प्रतिक्रिया है, जिसमें प्रकाश उत्सर्जन होता है। नैनोल्यूक लूसिफेरस सबसे छोटा (19 केडीए) है, फिर भी रेनिला और फायरफ्लाई लूसिफेरस (क्रमशः 36 केडीए और 61 केडीए) की तुलना में सबसे उज्ज्वल प्रणाली है। इसके अलावा, नैनोलक में पहले से उल्लिखित प्रणालियों के बीच शोर अनुपात और स्थिरता के लिए उच्चतम संकेत है। नैनोलक की उच्च संकेत तीव्रता रिपोर्टर fusions15 की भी बहुत कम मात्रा का पता लगाने का समर्थन करती है। नैनोल्यूक बाइनरी टेक्नोलॉजी (नैनोबीआईटी) नैनोल्यूक सिस्टम का एक विभाजित संस्करण है, जिसमें दो खंड शामिल हैं: छोटे बीआईटी (11 अमीनो एसिड); SmBiT) और अपेक्षाकृत कम आत्मीयता इंटरैक्शन (KD = 190 μM) के साथ बड़े BiT (LgBiT) एक luminescent complex16 बनाने के लिए। नैनोबीआईटी का उपयोग विभिन्न अध्ययनों में बड़े पैमाने पर किया जाता है जिसमें प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन 15,17,18,19 और सेलुलर सिग्नलिंग पाथवे 11,20,21 की पहचान शामिल है।
हाल ही में, LgBiT (KD = 0.7 nM) के लिए एक स्पष्ट रूप से उच्च आत्मीयता के साथ एक और छोटा पेप्टाइड पेश किया गया था, अर्थात् HiBiT नैनो-ग्लो सिस्टम, SmBiT के स्थान पर। नैनो-ग्लो "ऐड-मिक्स-रीड" परख के उच्च आत्मीयता और मजबूत संकेत HiBiT को एक उपयुक्त, मात्रात्मक, ल्यूमिनेसेंट पेप्टाइड टैग बनाता है। इस दृष्टिकोण में, HiBiT टैग को न्यूनतम संरचनात्मक हस्तक्षेप लागू करने वाले निर्माण को विकसित करके लक्ष्य प्रोटीन से जोड़ा जाता है। HiBiT-प्रोटीन संलयन सक्रिय रूप से LgBiT समकक्ष को बांध देगा, जो पता लगाने योग्य बायोल्यूमिनेसेंस उत्पन्न करने के लिए एक अत्यधिक सक्रिय लूसिफेरस एंजाइम का उत्पादन करेगा (चित्रा 1)। इसी तरह, हमने सार्स-कोव-2 बरामद व्यक्तियों के सेरा में बेअसर एंटीबॉडी टिटर को आसानी से मापने के लिए एक HiBiT नैनो-ग्लो-आधारित प्रणाली विकसित की और हाल ही में एक HiBiT-टैग किए गए SARS-CoV-2 RBD विकसित किया। यह पेपर मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं और उपकरणों का उपयोग करके HiBiT-RBD बायोरिपोर्टर के उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, और दिखाता है कि इस बायोरिपोर्टर का उपयोग SARS-CoV-2 RBD-targeting एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक तेज़ और कुशल परख में कैसे किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Passive Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E194A</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>171020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td>100 mL kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT-RBD Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
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				catttccccgaaaagtgccacctgacgtc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein G Magnetic Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Mx Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>96-well plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2520056</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter

कोविड-19 महामारी के उद्भव ने गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनोवायरस 2 (सार्स-कोव -2) के महामारी विज्ञान प्रभाव को निर्धारित करने के लिए बेहतर सीरोलॉजिकल डिटेक्शन विधियों की आवश्यकता को बढ़ा दिया है। सार्स-कोव-2 संक्रमणों की बढ़ती संख्या बेहतर एंटीबॉडी डिटेक्शन एसेस की आवश्यकता को बढ़ाती है। वर्तमान एंटीबॉडी का पता लगाने के तरीके गति के लिए संवेदनशीलता से समझौता करते हैं या संवेदनशील लेकिन समय लेने वाले होते हैं। SARS-CoV-2-neutralizing एंटीबॉडी का एक बड़ा हिस्सा रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (RBD) को लक्षित करता है, जो SARS-CoV-2 के प्राथमिक इम्युनोजेनिक डिब्बों में से एक है। हमने हाल ही में सार्स-कोव-2 एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील, बायोल्यूमिनेसेंट-टैग किए गए आरबीडी (नैनोलॉक HiBiT-RBD) को डिजाइन और विकसित किया है। निम्नलिखित पाठ HiBiT-RBD जटिल और इस उपकरण का उपयोग कर RBD-लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए एक तेजी से परख का उत्पादन करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है। तापमान की एक विस्तृत श्रृंखला पर HiBiT-RBD प्रोटीन उत्पाद के स्थायित्व और छोटी प्रयोगात्मक प्रक्रिया है कि 1 घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है के कारण, प्रोटोकॉल रोगी सीरम नमूनों में सार्स-CoV-2 एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक अधिक कुशल विकल्प के रूप में माना जा सकता है।

उचित प्रोटीन स्रोत का मूल्यांकन करने के लिए HiBit-RBD-युक्त सेल लिसेट और ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं के supernatant दोनों से संकेतों को दर्ज किया गया था (चित्रा 2)। HiBiT-RBD और LgBit को अलग-अलग नियंत्रण के रूप में उपयो?...

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Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

उल्लिखित प्रोटोकॉल HiBiT-रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के उत्पादन की प्रक्रिया और SARS-CoV-2 एंटीबॉडी के तेज और संवेदनशील पता लगाने के लिए इसके आवेदन का वर्णन करता है।

सार्स-कोव-2 रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन एंटीबॉडी का पता लगाना एक HiBiT-आधारित बायोरिपोर्टर का उपयोग करके

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

मेरी प्रयोगशाला कोविड -19 अनुसंधान में काम कर रही है, और हमने हाल ही में एक उपन्यास परख विकसित की है जिसने हमें सार्स-कोव -2 एंटीबॉडी का जल्दी और सटीक रूप से पता लगाने की अनुमति दी है। यह प्रोटोकॉल रोगी सीरम नमूनों में एंटी-सार्स-कोव -2 एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक उच्च थ्रूपुट परख की रूपरेखा तैयार करता है, जो वर्तमान महामारी को देखते हुए महत्वपूर्ण है। वर्तमान सीरोलॉजिकल assays के बहुमत संवेदनशीलता या इसके विपरीत के लिए गति बलिदान.हमारे डेटा से पता चलता है कि हमारे परख दोनों संवेदनशील है और एक त्वरित प्रतिक्रिया समय है. उच्च HiBiT-RBD bioreporter की पर्याप्त मात्रा का उत्पादन करने के लिए, सेल संस्कृति की तैयारी करके शुरू करें। सबसे पहले, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त पूर्ण ड्यूलबेको के संशोधित ईगल माध्यम को तैयार करें।फिर 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मीडिया को गर्म करें। जैविक सुरक्षा कैबिनेट को चालू करें और कैबिनेट की सतह को निष्फल करने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें। सेल लाइन को कल्चर करने के लिए इसे माइनस 80 डिग्री सेल्सियस या लिक्विड नाइट्रोजन से बाहर निकालकर 37 डिग्री सेल्सियस वॉटर बाथ में पिघला लें।पूर्ण माध्यम के कम से कम 10 मिलीलीटर के साथ पिघले हुए कोशिकाओं को मिलाएं। एक 15 सेंटीमीटर पेट्री पकवान में सेल निलंबन pipette और कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेट घुमाना। डिश को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 85 से 95% आर्द्रता पर रखें।माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें जब तक कि confluency स्तर 80 से 90% तक नहीं पहुंच जाता है उच्च confluency पर, माध्यम को हटा दें, गर्म PBS के साथ कोशिकाओं को धोएं और सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के तीन से पांच मिलीलीटर जोड़ें। लगभग पांच मिनट के बाद, माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं को देखें। यदि सभी कोशिकाएं तैर रही हैं, तो मध्यम के कम से कम चार मिलीलीटर जोड़ें और सेल निलंबन को एक नई बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें।हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और अभिकर्मक के लिए छह-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक मिलियन कोशिकाओं को जोड़ें। HiBiT-RBD प्लास्मिड के अभिकर्मक करने के लिए, एक उपयुक्त अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ HiBiT-RBD अभिव्यक्ति प्लास्मिड के एक माइक्रोग्राम का उपयोग करें। कमरे के तापमान पर 10 से 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, फिर प्लेट के प्रत्येक कुएं में कुल मात्रा जोड़ें।अगले दिन, पूर्ण माध्यम के साथ अभिकर्मक मिश्रण युक्त माध्यम को बदलें। अभिकर्मक नियंत्रण को अभिकर्मक के 48 घंटे बाद अच्छी तरह से देखें। 1.5 मिलीलीटर microtubes में supernatant ले लीजिए.कोशिकाओं में 1X पैसिव लाइसिस बफर या पीएलबी के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, फिर सेल लाइसिस के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट और हिलाएं। अगला, एक लूसिफेरस परख का उपयोग कर bioreporter से luminescence संकेत का मूल्यांकन करने के लिए, पहले प्रतिक्रिया घटकों को तैयार करने और bioreporter के स्रोत के रूप में supernatant का उपयोग करें। उपयोग से पहले बड़े बीआईटी और सब्सट्रेट को 1X तक पतला करें।प्रत्येक कुएं या ट्यूब से supernatant के 50 माइक्रोलीटर को 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें और प्रत्येक कुएं में 1X बड़े बीआईटी के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ल्यूमिनोमीटर सॉफ़्टवेयर खोलें, प्रत्येक अच्छी तरह से 1X सब्सट्रेट के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, प्लेट को ल्यूमिनोमीटर में रखें और सॉफ़्टवेयर चलाएं।आदेश में HiBiT-RBD एंटीबॉडी का पता लगाने परख प्रदर्शन करने के लिए, HiBiT-RBD bioreporter तैयार करने के रूप में पहले वर्णित है और HiBiT-RBD के 50 माइक्रोलीटर एक 1.5 मिलीलीटर माइक्रोट्यूब में वाणिज्यिक SARS-CoV-2 RBD एंटीबॉडी के एक माइक्रोग्राम के साथ supernatant युक्त गठबंधन. समाधान में इम्युनोग्लोबुलिन बाइंडिंग प्रोटीन या प्रोटीन जी के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। PBS जोड़कर कुल मात्रा को 300 माइक्रोलीटर पर लाएं।ट्यूबों को 30 मिनट के लिए ट्यूब शेकर या रोटेटर पर इनक्यूबेट करें। 30 सेकंड के लिए 12, 000 जी पर सेंट्रीफ्यूज। फिर supernatant छोड़ दें और पीबीएस के साथ धो लें।मुफ्त HiBiT-RBD को हटाने के लिए प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं। पीबीएस के 50 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और इसे 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें। 1X बड़े BiT के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और पांच मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।फिर 1X NanoLuc सब्सट्रेट के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। तुरंत एक luminometer के साथ luminescence संकेत पढ़ें. एक उच्च थ्रूपुट परख के लिए HiBiT-RBD bioreporter की बड़ी मात्रा में तैयार करें और प्रत्येक नमूने के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में HiBiT-RBD supernatant के 50 माइक्रोलीटर के साथ चुंबकीय प्रोटीन जी के 20 माइक्रोलीटर को संयोजित करें।प्रत्येक अच्छी तरह से सीरम नमूने के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें और पीबीएस जोड़कर कुल मात्रा को 150 माइक्रोलीटर तक लाएं। कमरे के तापमान पर एक शेकर पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर प्रोटीन जी एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स को अवक्षेपित करने के लिए प्लेट को चुंबकीय वॉशर पर रखें।प्रत्येक अच्छी तरह से के मध्य खंड में समाधान को छोड़ दें और धोने के लिए पीबीएस जोड़ें। अतिरिक्त HiBiT-RBD को हटाने के लिए कम से कम तीन बार धोने के चरण को दोहराएं। 1X PBS के 50 माइक्रोलीटर और 1X बड़े BiT के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर कम से कम पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।Luminometer Software तैयार करें। फिर 1X सब्सट्रेट के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्लेट को मशीन में रखें, सॉफ़्टवेयर चलाएं और संकेतों को रिकॉर्ड करें।सीरम नमूनों से संकेतों की तुलना करें, नमूनों को नियंत्रित करें, और खाली कुओं से पृष्ठभूमि संकेत। HiBiT-RBD दोनों से संकेतों में सेल लिसेट और ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं के supernatant शामिल हैं, उपयुक्त प्रोटीन स्रोत का मूल्यांकन करने के लिए दर्ज किए गए थे। डेटा ने एक मजबूत संकेत की तुलना में कम पृष्ठभूमि दिखाई जब दोनों भागों को जोड़ा गया था।प्रोटीन जी के अलावा एंटीबॉडी वर्षा में मदद करता है। परख का उपयोग एक वाणिज्यिक सार्स-कोव-2 से सिग्नल की तुलना करने के लिए किया गया था, जो एक नियंत्रण आईजीजी के साथ एंटीबॉडी को बेअसर करता है। विशिष्ट एंटीबॉडी सिग्नल मजबूत था, जबकि नियंत्रण एंटीबॉडी ल्यूमिनेसेंट पृष्ठभूमि स्तर के करीब था।पुनः संयोजक क्षीण oncolytic vesicular stomatitis वायरस या वीएसवी एम प्रोटीन की स्थिति 51 पर एक उत्परिवर्तन के साथ बहिर्जात आरबीडी व्यक्त चूहों को टीका लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। टीकाकरण वाले चूहों से एकत्र किए गए सीरम ने नियंत्रण वीएसवी के साथ इंजेक्ट किए गए चूहों में कोई संकेत नहीं होने की तुलना में एक मजबूत संकेत का उत्पादन किया। इस प्रोटोकॉल का उपयोग रोगी सीरम नमूनों में सार्स-कोव -2 एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।प्रोटीन जी के साथ इनक्यूबेशन के बाद धोने के चरण पृष्ठभूमि को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, सिग्नल हानि से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके सब्सट्रेट को जोड़ना महत्वपूर्ण है। कुछ अतिरिक्त अनुकूलन चरणों के साथ, एक ही परख का उपयोग रक्त के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है और रोगी रक्त के नमूनों में एंटी-सार्स-कोव -2 एंटीबॉडी का निर्धारण करने के लिए एक प्रभावी तरीका हो सकता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

सीटू संकरण में इम्यूनो आरएनए-फ्लोरेसेंस का उपयोग करके सार्स-सीओवी-2 का दृश्य

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

सार्स-सीओवी-2 का पता लगाना छद्म वायरस संक्रमण के उच्च थ्रूपुट फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग करके एंटीबॉडी को बेअसर करना

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

एक मल्टीप्लेक्स, मल्टीप्लेक्स ड्यूल रिपोर्टर आईजीजी और आईजीएम सार्स-सीओवी-2 बेअसर परख एक मल्टीप्लेक्स मनका आधारित प्रवाह विश्लेषण प्रणाली के लिए

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

रिपोर्टर-एक्सप्रेसिंग पुनः संयोजक सार्स-सीओवी-2 का उपयोग करते हुए के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों में वायरल संक्रमण की लाइव इमेजिंग और मात्रा का ठहराव

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

कुशल SARS-CoV-2 मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज पीसीआर लार नैदानिक रणनीति ओपन-सोर्स पिपेटिंग रोबोट का उपयोग कर

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

एक मल्टीप्लेक्स्ड सीरोलॉजिकल टेस्ट में विभिन्न एंटीबॉडी वर्गों का एक साथ पता लगाना

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

न्यूट्रलाइजेशन परख के माध्यम से SARS-CoV-2 के खिलाफ हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए एक आणविक उपकरण के रूप में छद्म टाइप वायरस

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Smartphone-Integrated Dengue NS1 Paper-Based Diagnostic Device

Portable Paper-Based Immunoassay Combined with Smartphone Application for Colorimetric and Quantitative Detection of Dengue NS1 Antigen

Author Spotlight: Development of a Smartphone-Enhanced Paper-Based Device for Rapid Dengue NS1 Detection

पोर्टेबल पेपर-आधारित इम्यूनोसे डेंगू NS1 एंटीजन के वर्णमिति और मात्रात्मक पहचान के लिए स्मार्टफोन एप्लिकेशन के साथ संयुक्त

Dengue virus (DENV) infection, which is transmitted by Aedes mosquitoes, is a major public health concern in tropical and subtropical countries. With an ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

रेबीज का उपयोग करके रेबीज आईजीजी और आईजीएम एंटीबॉडी का पता लगाना अप्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...