Name: detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Apprezziamo e ringraziamo l'assistenza tecnica di Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin e Christiano Tanese De Souza. Ringraziamo anche Mina Ghahremani per il Graphic Design. Vorremmo anche ringraziare tutte le persone che hanno partecipato e donato i loro campioni di sangue per questo studio. DWC è supportato in parte dalla Facoltà di uOttawa e dal Dipartimento di Medicina.

NOTA: Il protocollo descritto di seguito aderisce a tutte le linee guida etiche secondo il codice di protocollo 20200371-01H.
1. Produzione e valutazione del bioreporter HiBiT-RBD
<ol><li>Produrre una quantità sufficiente di bioreporter HiBiT-RBD<ol>
<li>Prepararsi per la coltura cellulare<ol>
<li>Preparare il mezzo Eagle modificato (DMEM) completo di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina/streptomicina. Quindi, riscaldare il supporto a bagnomaria a 37 °C.<...

<ol>
	<li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+coronavirus+2019+(COVID-19)+pandemic+outbreak:+A+comprehensive+review+of+the+current+literature.">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li><li>Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: <a target="_blank" href="https://www.worldometers.info/coronavirus/">https://www.worldometers.info/coronavirus/</a> (2021)</li><li>Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+wave+COVID-19+pandemics+in+Europe:+a+temporal+playbook.">Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).</li><li>COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines">https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines</a> (2021)</li><li>Hueston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+response+to+SARS-CoV-2+infection.">The antibody response to SARS-CoV-2 infection.</a> Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).</li><li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor.">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology.">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li><li>Premkumar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor-binding+domain+of+the+viral+spike+protein+is+an+immunodominant+and+highly+specific+target+of+antibodies+in+SARS-CoV-2+patients.">The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients.</a> Science Immunology. 5 (48), (2020).</li><li>Walls, A. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19:+systematic+review+and+meta-analysis.">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516 (2020).</li><li>Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa">https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa</a> (2021)</li><li>Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+bioluminescent+systems.">A brief review of bioluminescent systems.</a> Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion.">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening.">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP/TAZ-TEAD+biosensors.">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596 (2019).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis.">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li><li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide.">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion.">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).</li></ol>

Il crescente numero di persone infette da SARS-CoV-2 e lo sforzo in corso per la vaccinazione globale richiedono test sierologici sensibili e veloci che possono essere utilizzati in indagini sierologiche su larga scala. Recenti ricerche dimostrano che i bioreporter a base di nanoluciferasi split possono essere utilizzati per sviluppare tali saggi. Recentemente abbiamo sviluppato il bioreporter HiBiT-RBD per progettare un test che possa essere utilizzato per rilevare gli anticorpi specifici di SARS-CoV-2 nel siero del paz...

La recente comparsa di un nuovo coronavirus, SARS-CoV21, ha causato oltre 2.800.000 morti e 128 milioni di infezioni al 30 marzo 20212. A causa della mancanza di una procedura di trattamento affidabile e consolidata per le terapie cliniche SARS-CoV-2, sono stati fatti molti sforzi per limitare l'ulteriore trasmissione virale e, cosa più importante, per sviluppare un trattamento efficace e robusto o un vaccino3. Ad oggi, ci sono più di 50 candidati vaccini COVID-19 in studi segnalati dall'Organizzazione Mondiale della Sanità4. Il rilevamento di anticorpi contro SARS-CoV-2 è di fondamentale importanza per determinare la stabilità a lungo termine della risposta umorale alla somministrazione del vaccino e nei pazienti guariti di COVID-195. Alcuni studi hanno dimostrato che esiste la possibilità che i pazienti con SARS-CoV-2 recuperati perdano la maggior parte degli anticorpi che legano RBD dopo 1 anno5,6,7,8,9. Sono necessarie ulteriori indagini per comprendere meglio l'immunità duratura e piattaforme di rilevamento degli anticorpi più sensibili possono aiutare ulteriormente tale lavoro. Anche le segnalazioni di immunità sostenuta di infezioni lievi da SARS-CoV-2, che suggeriscono risposte anticorpali a lungo termine, sono un'area di studio interessante e utile. Un metodo di rilevamento rapido e accurato è essenziale per il monitoraggio degli anticorpi nei sieri degli individui per fornire maggiori informazioni sull'immunità nella popolazione.
Come altri coronavirus, SARS-CoV-2 utilizza la glicoproteina spike sporgente per legarsi all'enzima-2 di conversione dell'angiotensina (ACE2) per avviare una cascata di eventi che portano alla fusione delle membrane virali e cellulari6,7. Diversi studi hanno recentemente dimostrato che l'RBD della proteina Spike ha un ruolo cruciale nell'suscitare una risposta anticorpale potente e specifica contro SARS-CoV28,9,10,11. In particolare, le correlazioni osservate da Premkumar et al. tra il titolo dell'anticorpo legante RBD e la potenza di neutralizzazione sars-CoV-2 del plasma dei pazienti sono coerenti con RBD come compartimento immunogenico della struttura del virus9. Con questo in mente, molti test diagnostici disponibili per il rilevamento degli anticorpi SARS-CoV-2 richiedono tempo e costi, richiedono una lunga procedura di incubazione e lavaggio (saggio immunoassorbente enzimatico [ELISA]) o mancano di sensibilità e accuratezza (saggio immunologico a flusso laterale [LFIA])12. Pertanto, un metodo sierologico complementare quantitativo e rapido di rilevamento degli anticorpi derivati da COVID-19 con elevata sensibilità, risposta rapida e costo relativamente basso servirebbe alla necessità di un test sierologico affidabile per la sorveglianza epidemiologica sars-CoV-2.
Collettivamente, i limiti degli attuali saggi sierologici hanno spinto lo studio del sistema di segnalazione bioluminescente come potenziale agente diagnostico in future indagini sierosoratorie. La bioluminescenza è una reazione enzima/substrato naturale, con emissione luminosa. La nanoluc luciferasi è la più piccola (19 kDa), ma il sistema più luminoso rispetto alla Renilla e alla lucciola luciferasi (36 kDa e 61 kDa, rispettivamente)13,14. Inoltre, Nanoluc ha il più alto rapporto segnale/rumore e stabilità tra i sistemi precedentemente menzionati. L'elevata intensità del segnale di Nanoluc supporta il rilevamento anche di quantità molto basse di fusioni di reporter15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) è una versione divisa del sistema Nanoluc, che è composto da due segmenti: piccolo BiT (11 amminoacidi; SmBiT) e BiT di grandi dimensioni (LgBiT) con interazioni di affinità relativamente bassa (KD = 190 μM ) per formare un complesso luminescente16. NanoBiT è ampiamente utilizzato in vari studi che coinvolgono l'identificazione delle interazioni proteina-proteina15,17,18,19 e delle vie di segnalazione cellulare11,20,21.
Recentemente, è stato introdotto un altro piccolo peptide con un'affinità nettamente superiore a LgBiT (KD = 0,7 nM ), vale a dire il sistema HiBiT Nano-Glo, al posto di SmBiT. L'alta affinità e il segnale forte del test Nano-Glo "add-mix-read" rendono HiBiT un tag peptidico adatto, quantitativo e luminescente. In questo approccio, il tag HiBiT viene aggiunto alla proteina bersaglio sviluppando un costrutto che impone interferenze strutturali minime. La fusione HiBiT-proteina si legherebbe attivamente alla controparte LgBiT, producendo un enzima luciferasi altamente attivo per generare bioluminescenza rilevabile in presenza di reagenti di rilevamento (Figura 1). Allo stesso modo, abbiamo sviluppato un sistema basato su HiBiT Nano-Glo per misurare prontamente il titolo anticorpale neutralizzante nei sieri di individui recuperati da SARS-CoV-2 e recentemente abbiamo sviluppato un RBD SARS-CoV-2 con tag HiBiT. Questo documento descrive il protocollo per la produzione del bioreporter HiBiT-RBD utilizzando procedure e apparecchiature di laboratorio standard e mostra come questo bioreporter può essere utilizzato in un test rapido ed efficiente per rilevare gli anticorpi mirati a SARS-CoV-2 RBD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Passive Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E194A</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>171020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td>100 mL kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT-RBD Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
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				catttccccgaaaagtgccacctgacgtc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein G Magnetic Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Mx Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>96-well plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2520056</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter

L'emergere della pandemia di COVID-19 ha aumentato la necessità di migliori metodi di rilevamento sierologico per determinare l'impatto epidemiologico della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Il crescente numero di infezioni da SARS-CoV-2 solleva la necessità di migliori test di rilevamento degli anticorpi. Gli attuali metodi di rilevamento degli anticorpi compromettono la sensibilità per la velocità o sono sensibili ma richiedono molto tempo. Una grande percentuale di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 prende di mira il dominio di legame del recettore (RBD), uno dei compartimenti immunogenici primari di SARS-CoV-2. Recentemente abbiamo progettato e sviluppato un RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) altamente sensibile e bioluminescente per rilevare gli anticorpi SARS-CoV-2. Il testo seguente descrive la procedura per produrre il complesso HiBiT-RBD e un test rapido per valutare la presenza di anticorpi mirati alla RBD utilizzando questo strumento. A causa della durata del prodotto proteico HiBiT-RBD su un'ampia gamma di temperature e della procedura sperimentale più breve che può essere completata entro 1 ora, il protocollo può essere considerato un'alternativa più efficiente per rilevare gli anticorpi SARS-CoV-2 nei campioni di siero dei pazienti.

I segnali provenienti sia dal lisato cellulare contenente HiBit-RBD che dal surnatante delle cellule trasfettate sono stati registrati (Figura 2) per valutare la fonte proteica appropriata. HiBiT-RBD e LgBit sono stati utilizzati separatamente come controlli e i dati hanno mostrato uno sfondo basso rispetto a un segnale forte quando entrambe le parti sono state combinate. Pertanto, l'interazione HiBiT-RBD con LgBiT è necessaria per generare un enzima attivo per la digestione del substrato e...

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Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Il protocollo delineato descrive la procedura per la produzione del complesso proteico del dominio legante il recettore HiBiT e la sua applicazione per il rilevamento rapido e sensibile degli anticorpi SARS-CoV-2.

Rilevazione dell'anticorpo sars-CoV-2 Receptor-Binding Domain utilizzando un bioreporter basato su HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Il mio laboratorio ha lavorato nella ricerca COVID-19 e abbiamo recentemente sviluppato un nuovo test che ci ha permesso di rilevare rapidamente e con precisione gli anticorpi SARS-CoV-2. Questo protocollo delinea un test ad alto rendimento per rilevare gli anticorpi anti-SARS-CoV-2 nei campioni di siero dei pazienti, che è fondamentale data l'attuale pandemia. La maggior parte degli attuali saggi sierologici sacrifica la velocità per la sensibilità o viceversa.I nostri dati mostrano che il nostro test è sensibile e ha un tempo di risposta rapido. Al fine di produrre una quantità sufficiente di bioreporter HiBiT-RBD elevato, iniziare preparandosi per la coltura cellulare. Per prima cosa, prepara il mezzo dell'aquila modificato completo di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina e streptomicina.Quindi riscaldare il supporto in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Accendere l'armadio di sicurezza biologica e utilizzare il 70% di etanolo per sterilizzare la superficie dell'armadio. Per coltivare la linea cellulare, estrarla da meno 80 gradi Celsius o azoto liquido e scongelarla in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.Mescolare le cellule scongelate con almeno 10 millilitri di mezzo completo. Pipettare la sospensione cellulare in una capsula di Petri di 15 centimetri e ruotare la piastra per distribuire uniformemente le cellule. Posizionare il piatto in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 85-95% di umidità.Osservare le cellule al microscopio fino a quando il livello di confluenza raggiunge l'80-90% ad alta confluenza, rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS caldo e aggiungere da tre a cinque millilitri di 0,25% tripsina-EDTA per staccare le cellule dalla superficie. Dopo circa cinque minuti, guarda le cellule al microscopio. Se tutte le cellule sono galleggianti, aggiungere almeno quattro millilitri di mezzo e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo sterile.Contare le cellule usando un emocitometro e aggiungere un milione di cellule in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti per la trasfezione. Per eseguire la trasfezione del plasmide HiBiT-RBD, utilizzare un microgrammo del plasmide di espressione HiBiT-RBD con un reagente di trasfezione adatto. Incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere il volume totale a ciascun pozzetto della piastra a goccia.Il giorno successivo, sostituire il mezzo contenente la miscela di trasfezione con il mezzo completo. Osservare bene il controllo della trasfezione 48 ore dopo la trasfezione. Raccogliere il surnatante in microtubi da 1,5 millilitri.Aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi passiva 1X o PLB alle cellule, quindi incubare e scuotere la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente per la lisi cellulare. Successivamente, per valutare il segnale di luminescenza dal bioreporter utilizzando un test di luciferasi, preparare prima i componenti della reazione e utilizzare il surnatante come fonte del bioreporter. Diluire il Grande BiT e il substrato a 1X prima dell'uso.Trasferire 50 microlitri del surnatante da ciascun pozzo o tubo a una piastra da 96 pozzetti e aggiungere 50 microlitri di BiT 1X grande a ciascun pozzo. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Aprire il software del luminometro, aggiungere 50 microlitri di substrato 1X a ciascun pozzetto, posizionare la piastra nel luminometro ed eseguire il software.Per eseguire il test di rilevamento degli anticorpi HiBiT-RBD, preparare il bioreporter HiBiT-RBD come descritto in precedenza e combinare 50 microlitri del surnatante contenente HiBiT-RBD con un microgrammo dell'anticorpo commerciale SARS-CoV-2 RBD in un microtubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 20 microlitri di proteina legante le immunoglobuline o proteina G alla soluzione. Porta il volume totale a 300 microlitri aggiungendo PBS.Incubare i tubi su uno shaker o rotatore per 30 minuti. Centrifugare a 12.000 G per 30 secondi. Quindi scartare il surnatante e lavare con PBS.Ripetere il processo tre volte per rimuovere HiBiT-RBD libero. Risospesciare le celle in 50 microlitri di PBS e trasferirle in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 50 microlitri di BiT 1X grande e attendere cinque minuti.Quindi aggiungere 50 microlitri di substrato 1X NanoLuc. Leggere immediatamente il segnale di luminescenza con un luminometro. Preparare grandi quantità del bioreporter HiBiT-RBD per un test ad alto rendimento e combinare 20 microlitri di proteina magnetica G con 50 microlitri del surnatante HiBiT-RBD in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti per ciascun campione.Aggiungere 10 microlitri del campione di siero a ciascun pozzetto e portare il volume totale a 150 microlitri aggiungendo PBS. Incubare per 30 minuti su uno shaker a temperatura ambiente. Quindi posizionare la piastra su una rondella magnetica per precipitare il complesso di anticorpi della proteina G.Scartare la soluzione nella sezione centrale di ciascun pozzetto e aggiungere PBS per il lavaggio. Ripetere la fase di lavaggio almeno tre volte per rimuovere l'eccesso di HiBiT-RBD. Aggiungere 50 microlitri di 1X PBS e 50 microlitri di 1X BiT di grandi dimensioni e incubare per almeno cinque minuti a temperatura ambiente.Preparare il software del luminometro. Quindi aggiungere 50 microlitri di substrato 1X. Posizionare la piastra nella macchina, eseguire il software e registrare i segnali.Confronta i segnali provenienti da campioni di siero, campioni di controllo e segnali di fondo da pozzi vuoti. I segnali provenienti sia dal lisato cellulare contenente HiBiT-RBD che dal surnatante delle cellule trasfettate sono stati registrati per valutare la fonte proteica appropriata. I dati hanno mostrato uno sfondo basso rispetto a un segnale forte quando entrambe le parti sono state combinate.L'aggiunta di proteina G aiuta la precipitazione degli anticorpi. Il test è stato utilizzato per confrontare il segnale di un anticorpo neutralizzante commerciale SARS-CoV-2 con un IgG di controllo. Il segnale anticorpale specifico era robusto, mentre l'anticorpo di controllo aveva un livello di fondo vicino al livello di fondo luminescente.Il virus della stomatite vescicolare oncolitica attenuata ricombinante o VSV con una mutazione in posizione 51 della proteina M che esprime RBD esogena è stato utilizzato per vaccinare i topi. Il siero raccolto da topi vaccinati ha prodotto un segnale robusto rispetto a nessun segnale nei topi iniettati con VSV di controllo. Questo protocollo può essere utilizzato per il rilevamento degli anticorpi SARS-CoV-2 nei campioni di siero dei pazienti.Le fasi di lavaggio successive all'incubazione con la proteina G sono fondamentali per ridurre lo sfondo. Inoltre, è importante aggiungere il substrato il più rapidamente possibile per evitare la perdita di segnale. Con alcune fasi di ottimizzazione aggiuntive, lo stesso test può essere utilizzato per analizzare campioni di sangue e potrebbe essere un metodo efficace per determinare gli anticorpi anti-SARS-CoV-2 nei campioni di sangue dei pazienti.

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