Name: detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Vi setter pris på og takker den tekniske hjelpen til Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin og Christiano Tanese De Souza. Vi takker også Mina Ghahremani for grafisk design. Vi vil også takke alle personene som deltok og donerte blodprøvene sine for denne studien. DWC støttes delvis av uOttawa Fakultet og Institutt for medisin.

MERK: Protokollen beskrevet nedenfor overholder alle etiske retningslinjer i henhold til protokollkode 20200371-01H.
1. Produksjon og evaluering av HiBiT-RBD bioreporter
<ol><li>Produserer en tilstrekkelig mengde HiBiT-RBD bioreporter<ol>
<li>Forbered deg på cellekultur<ol>
<li>Forbered komplett Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM) som inneholder 10% foster bovin serum og 1% penicillin / streptomycin. Varm deretter mediet i et 37 °C vannbad.</li>
			<li>Slå på det biologiske sikkerhet...

<ol>
	<li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+coronavirus+2019+(COVID-19)+pandemic+outbreak:+A+comprehensive+review+of+the+current+literature.">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li><li>Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: <a target="_blank" href="https://www.worldometers.info/coronavirus/">https://www.worldometers.info/coronavirus/</a> (2021)</li><li>Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+wave+COVID-19+pandemics+in+Europe:+a+temporal+playbook.">Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).</li><li>COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines">https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines</a> (2021)</li><li>Hueston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+response+to+SARS-CoV-2+infection.">The antibody response to SARS-CoV-2 infection.</a> Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).</li><li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor.">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology.">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li><li>Premkumar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor-binding+domain+of+the+viral+spike+protein+is+an+immunodominant+and+highly+specific+target+of+antibodies+in+SARS-CoV-2+patients.">The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients.</a> Science Immunology. 5 (48), (2020).</li><li>Walls, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elicitation+of+potent+neutralizing+antibody+responses+by+designed+protein+nanoparticle+vaccines+for+SARS-CoV-2.">Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2.</a> Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).</li><li>Azad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+reveals+the+importance+of+N-+linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Mol Ther. , 0074-0075 (2021).</li><li>Bastos, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19:+systematic+review+and+meta-analysis.">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516 (2020).</li><li>Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa">https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa</a> (2021)</li><li>Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+bioluminescent+systems.">A brief review of bioluminescent systems.</a> Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion.">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening.">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP/TAZ-TEAD+biosensors.">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596 (2019).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis.">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li><li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide.">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion.">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).</li></ol>

Det økende antallet personer som er smittet med SARS-CoV-2 og den pågående innsatsen for global vaksinasjon, krever sensitive og raske serologiske tester som kan brukes i store serosurveys. Nyere forskning viser at splittede nanoluciferasebaserte bioreportere kan brukes til å utvikle slike analyser. Vi utviklet nylig HiBiT-RBD bioreporter for å designe en test som kan brukes til å oppdage SARS-CoV-2-spesifikke antistoffer i pasientserum på en rask og pålitelig måte (figur 4C).
<...

Den nylige fremveksten av et nytt koronavirus, SARS-CoV21, har forårsaket mer enn 2.800.000 dødsfall og 128 millioner infeksjoner per 30. På grunn av mangelen på en pålitelig og veletablert behandlingsprosedyre for SARS-CoV-2 kliniske terapier, har mange bestrebelser blitt gjort for å begrense ytterligere virusoverføring og enda viktigere, for å utvikle en effektiv og robust behandling eller en vaksine3. Til dags dato er det mer enn 50 COVID-19 vaksinekandidater i studier rapportert av Verdens helseorganisasjon4. Påvisning av antistoffer mot SARS-CoV-2 er av avgjørende betydning for å bestemme den langsiktige stabiliteten av humoral respons ved administrering av vaksinen, så vel som hos gjenopprettede pasienter av COVID-195. Noen studier har vist at det er en mulighet for at gjenvunne sars-cov-2 pasienter mister de fleste av RBD-bindende antistoffer etter 1 år5,6,7,8,9. Videre undersøkelser er nødvendig for å bedre forstå varig immunitet, og mer sensitive antistoffdeteksjonsplattformer kan bidra til å fremme slikt arbeid. Rapporter om vedvarende immunitet av milde SARS-CoV-2-infeksjoner, som antyder langsiktige antistoffresponser, er også et interessant og verdig studieområde. En rask og nøyaktig metode for deteksjon er avgjørende for å overvåke antistoffer i individets sera for å gi mer informasjon om immunitet i befolkningen.
Som andre koronavirus bruker SARS-CoV-2 fremspringende spike glykoprotein for å binde seg til angiotensinkonverterende enzym-2 (ACE2) for å initiere en kaskade av hendelser som fører til sammensmelting av virale og cellemembraner6,7. Flere studier har nylig vist at RBD for Spike-proteinet har en avgjørende rolle i å fremkalle kraftig og spesifikk antistoffrespons mot SARS-CoV28,9,10,11. Spesielt er korrelasjoner observert av Premkumar et al. mellom titeret av RBD-bindende antistoff og SARS-CoV-2 nøytraliseringsstyrke av pasientens plasma i samsvar med at RBD er et immunogent rom i virusstrukturen9. Med det i tankene er mange diagnostiske tester tilgjengelig for SARS-CoV-2 antistoffdeteksjon tids- og kostnadskrevende, krever en langvarig prosedyre for inkubasjon og vasking (enzymbundet immunosorbentanalyse [ELISA]), eller mangler følsomhet og nøyaktighet (lateral flow immunoassay [LFIA])12. Derfor vil en kvantitativ og rask komplementær serologisk metode for COVID-19-avledet antistoffdeteksjon med høy følsomhet, rask respons og relativt lave kostnader tjene behovet for en pålitelig serologisk test for SARS-CoV-2 epidemiologisk overvåking.
Samlet førte begrensningene til nåværende serologiske analyser til undersøkelsen av det bioluminescerende rapporteringssystemet som et potensielt diagnostisk middel i fremtidige serosurveys. Bioluminescens er en naturlig forekommende enzym/substratreaksjon, med lysutslipp. Nanoluc luciferase er den minste (19 kDa), men det lyseste systemet sammenlignet med Renilla og firefly luciferase (henholdsvis 36 kDa og 61 kDa)13,14. Videre har Nanoluc det høyeste signal-til-støy-forholdet og stabiliteten blant de tidligere nevnte systemene. Nanolucs høye signalintensitet støtter påvisning av selv svært lave mengder reporterfusjoner15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) er en delt versjon av Nanoluc-systemet, som består av to segmenter: liten BiT (11 aminosyrer; SmBiT) og store BiT (LgBiT) med relativt lav affinitetsinteraksjoner (KD = 190 μM ) for å danne et lysende kompleks16. NanoBiT brukes mye i ulike studier som involverer identifisering av proteinproteininteraksjoner15,17,18,19 og cellulære signalveier11,20,21.
Nylig ble et annet lite peptid med en tydelig høyere affinitet til LgBiT (KD = 0,7 nM ) introdusert, nemlig HiBiT Nano-Glo-systemet, i stedet for SmBiT. Den høye affiniteten og det sterke signalet fra Nano-Glo-analysen "add-mix-read" gjør HiBiT til en passende, kvantitativ, lysende peptidkode. I denne tilnærmingen legges HiBiT-taggen til målproteinet ved å utvikle en konstruksjon som pålegger minimal strukturell interferens. HiBiT-proteinfusjon ville aktivt binde seg til LgBiT-motparten, og produsere et svært aktivt luciferaseenzym for å generere påviselig bioluminescens i nærvær av deteksjonsreagenser (figur 1). På samme måte utviklet vi et HiBiT Nano-Glo-basert system for å enkelt måle det nøytraliserende antistofftitren i sera av SARS-CoV-2 gjenopprettede individer og utviklet nylig en HiBiT-merket SARS-CoV-2 RBD. Dette dokumentet beskriver protokollen for produksjon av HiBiT-RBD bioreporter ved hjelp av standard laboratorieprosedyrer og utstyr, og viser hvordan denne bioreporteren kan brukes i en rask og effektiv analyse for å oppdage SARS-CoV-2 RBD-målrettede antistoffer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Passive Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E194A</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>171020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td>100 mL kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT-RBD Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt
				gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata
				gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg
				aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta
				agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa
				ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg
				cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc
				gttgacattgattattgactagttattaatagt
				aatcaattacggggtcattagttcatagcccat
				atatggagttccgcgttacataacttacggtaa
				atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc
				ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc
				atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc
				aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact
				tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta
				cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg
				cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat
				gggactttcctacttggcagtacatctacgtat
				tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt
				ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg
				actcacggggatttccaagtctccaccccattg
				acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc
				aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg
				ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta
				cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg
				ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg
				aaattaatacgactcactatagggagacccaa
				gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga
				gctcggatccgccaccATGGAGACAGA
				CACACTCCTGCTATGGGTACTGC
				TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC
				TGGTGACtctggctctagcggctctggctct
				agcggcggcATGGTGAGCGGCTG
				GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC
				tctagcggcGACTACAAGGACC
				ACGACGGTGACTACAAGGACCA
				CGACATCGACTACAAGGACGAC
				GACGACAAGggcagcggctccggca
				gcagcggaggaggaggctctggaggagga
				ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg
				cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat
				ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga
				atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct
				gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt
				gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac
				ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt
				gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc
				acctggacagacaggcaagatcgccgactac
				aactataagctgccagacgatttcaccggct
				gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt
				ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac
				cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt
				tgagcgggatatcagcacagagatctaccag
				gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg
				gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc
				ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca
				tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg
				cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc
				gagggccgccacatgctggagatgggccatc
				atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag
				cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac
				ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt
				gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg
				ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac
				tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat
				cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg
				ggtggggtggggcaggacagcaaggggga
				ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg
				gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa
				agaaccagctggggctctagggggtatcccca
				cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg
				ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
				acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg
				ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt
				tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta
				gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc
				ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta
				gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc
				ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg
				gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc
				ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt
				gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg
				atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt
				ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc
				caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag
				catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg
				aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt
				atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac
				catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc
				ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc
				ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc
				cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa
				gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg
				caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc
				ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt
				cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg
				ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc
				tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct
				gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg
				cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg
				tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg
				cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct
				tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg
				ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc
				ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg
				ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg
				cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc
				ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg
				agcgagcacgtactcggatggaagccggtct
				tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat
				caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca
				ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg
				atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg
				ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt
				ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt
				ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct
				acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg
				aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg
				tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc
				ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg
				ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag
				cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat
				tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt
				cggaatcgttttccgggacgccggctggatga
				tcctccagcgcggggatctcatgctggagt
				tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta
				taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa
				atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt
				ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat
				cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct
				agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc
				ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac
				aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag
				cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat
				taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
				gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa
				tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg
				tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc
				gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt
				atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc
				cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa
				catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag
				gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt
				tccataggctccgcccccctgacgagcatcac
				aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa
				acccgacaggactataaagataccaggcgtt
				tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt
				ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc
				tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat
				agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag
				gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa
				ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc
				ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag
				acacgacttatcgccactggcagcagccactg
				gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc
				ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact
				acggctacactagaagaacagtatttggtatc
				tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa
				aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa
				ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca
				agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat
				ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt
				ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa
				gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct
				tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt
				ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
				ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg
				cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca
				tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac
				gatacgggagggcttaccatctggccccagtg
				ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc
				ggctccagatttatcagcaataaaccagccag
				ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg
				caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt
				gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt
				aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag
				gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg
				cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc
				gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag
				cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca
				gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
				tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg
				ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta
				ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg
				gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg
				ggataataccgcgccacatagcagaactttaa
				aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc
				gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat
				ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact
				gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc
				tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc
				cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga
				aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat
				attattgaagcatttatcagggttattgtc
				tcatgagcggatacatatttgaatgtattt
				agaaaaataaacaaataggggttccgcgca
				catttccccgaaaagtgccacctgacgtc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein G Magnetic Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Mx Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>96-well plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2520056</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter

Fremveksten av COVID-19-pandemien har økt behovet for bedre serologiske deteksjonsmetoder for å bestemme den epidemiologiske effekten av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Det økende antallet SARS-CoV-2-infeksjoner øker behovet for bedre antistoffdeteksjonsanalyser. Nåværende antistoffdeteksjonsmetoder kompromitterer følsomhet for hastighet eller er følsomme, men tidkrevende. En stor andel av SARS-CoV-2-nøytraliserende antistoffer retter seg mot reseptorbindingsdomenet (RBD), et av de primære immunogene rommene i SARS-CoV-2. Vi har nylig designet og utviklet en svært følsom, bioluminescent-merket RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) for å oppdage SARS-CoV-2 antistoffer. Følgende tekst beskriver prosedyren for å produsere HiBiT-RBD-komplekset og en rask analyse for å evaluere tilstedeværelsen av RBD-målrettede antistoffer ved hjelp av dette verktøyet. På grunn av holdbarheten til HiBiT-RBD-proteinproduktet over et bredt spekter av temperaturer og den kortere eksperimentelle prosedyren som kan fullføres innen 1 time, kan protokollen betraktes som et mer effektivt alternativ for å oppdage SARS-CoV-2 antistoffer i pasientserumprøver.

Signalene fra både HiBit-RBD-inneholdende cellelys og supernatant av de transfiserte cellene ble registrert (figur 2) for å evaluere riktig proteinkilde. HiBiT-RBD og LgBit ble brukt separat som kontroller, og dataene viste lav bakgrunn sammenlignet med et sterkt signal da begge delene ble kombinert. Derfor er HiBiT-RBD-interaksjon med LgBiT nødvendig for å generere aktivt enzym for substrat fordøyelse og bioluminescensaktivitet (figur 1).
<p class="jov...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Den skisserte protokollen beskriver prosedyren for å produsere HiBiT-reseptorbindingsdomeneproteinkomplekset og dets anvendelse for rask og sensitiv deteksjon av SARS-CoV-2-antistoffer.

Påvisning av SARS-CoV-2 reseptorbindende domeneantistoff ved hjelp av en HiBiT-basert bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Laboratoriet mitt har jobbet med COVID-19-forskning, og vi har nylig utviklet en ny analyse som tillot oss å raskt og nøyaktig oppdage SARS-CoV-2 antistoffer. Denne protokollen skisserer en høy gjennomstrømningsanalyse for å oppdage anti-SARS-CoV-2 antistoffer i pasientserumprøver, noe som er kritisk gitt den nåværende pandemien. De fleste nåværende serologiske analyser ofrer hastighet for følsomhet eller omvendt.Dataene våre viser at analysen vår er både følsom og har rask responstid. For å produsere en tilstrekkelig mengde høy HiBiT-RBD bioreporter, begynn med å forberede seg på cellekultur. For det første, forbered komplett Dulbeccos modifiserte ørnemedium som inneholder 10% fetal bovin serum og 1% penicillin og streptomycin.Varm deretter mediene i et 37 graders Celsius vannbad. Slå på det biologiske sikkerhetsskapet og bruk 70% etanol for sterilisering av skapoverflaten. For å dyrke cellelinjen, ta den ut fra minus 80 grader Celsius eller flytende nitrogen og tine den i et 37 grader Celsius vannbad.Bland de tinte cellene med minst 10 milliliter komplett medium. Pipette celleopphenget i en 15 centimeter Petri-tallerken og virvle platen for å fordele cellene jevnt. Plasser parabolen i en cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid og 85 til 95% fuktighet.Vær oppmerksom på cellene under mikroskopet til konfluensanivået når 80 til 90%Ved høy samløp, fjern mediet, vask cellene med varm PBS og legg til tre til fem milliliter 0,25% trypsin-EDTA for å løsne cellene fra overflaten. Etter omtrent fem minutter, se på cellene under et mikroskop. Hvis alle cellene flyter, tilsett minst fire milliliter medium og overfør cellefjæringen til et nytt sterilt rør.Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og legg til en million celler i hver brønn av en seks-brønns plate for transfeksjon. For å utføre transfeksjon av HiBiT-RBD-plasmid, bruk ett mikrogram HiBiT-RBD-uttrykksplasmid med et egnet transfeksjonsreagens. Inkuber i 10 til 15 minutter ved romtemperatur, og legg deretter det totale volumet til hver brønn av platen dropwise.På neste dag erstatter du mediet som inneholder transfeksjonsblandingen med komplett medium. Vær oppmerksom på transfeksjonskontrollbrønnen 48 timer etter transfeksjonen. Samle supernatanten i 1,5 milliliter mikrorør.Tilsett 500 mikroliter 1X passiv lysisbuffer eller PLB til cellene, inkuber deretter og rist platen i 15 minutter ved romtemperatur for cellelys. Deretter, for å evaluere luminescenssignalet fra bioreporteren ved hjelp av en luciferaseanalyse, må du først forberede reaksjonskomponentene og bruke supernatanten som kilde til bioreporteren. Fortynn det store BiT- og substratet til 1X før bruk.Overfør 50 mikroliter av supernatanten fra hver brønn eller rør til en 96-brønns plate og tilsett 50 mikroliter 1X stor BiT til hver brønn. Inkuber i fem minutter ved romtemperatur. Åpne luminometerprogramvaren, legg til 50 mikroliter 1X substrat til hver brønn, plasser platen i luminometeret og kjør programvaren.For å utføre HiBiT-RBD antistoffdeteksjonsanalysen, forberede HiBiT-RBD bioreporter som tidligere beskrevet og kombinere 50 mikroliter av HiBiT-RBD som inneholder supernatant med ett mikrogram av det kommersielle SARS-CoV-2 RBD-antistoffet i en 1,5 milliliter mikrotube. Tilsett 20 mikroliter immunglobulinbindende protein eller protein G til løsningen. Ta det totale volumet til 300 mikroliter ved å legge til PBS.Inkuber rørene på en rør shaker eller rotator i 30 minutter. Sentrifuge ved 12.000 G i 30 sekunder. Kast deretter supernatanten og vask med PBS.Gjenta prosessen tre ganger for å fjerne gratis HiBiT-RBD. Resuspend cellene i 50 mikroliter AV PBS og overfør den til en 96-brønns plate. Tilsett 50 mikroliter 1X stor BiT og vent i fem minutter.Tilsett deretter 50 mikroliter 1X NanoLuc-substrat. Les umiddelbart luminescenssignalet med et luminometer. Forbered større mengder HiBiT-RBD bioreporter for en høy gjennomstrømningsanalyse og kombiner 20 mikroliter magnetisk Protein G med 50 mikroliter HiBiT-RBD supernatant i hver brønn av en 96-brønns plate for hver prøve.Tilsett 10 mikroliter av serumprøven til hver brønn og ta det totale volumet til 150 mikroliter ved å legge til PBS. Inkuber i 30 minutter på en shaker ved romtemperatur. Plasser deretter platen på en magnetisk vaskemaskin for å utfelle Protein G antistoffkomplekset.Kast løsningen i den midterste delen av hver brønn og legg til PBS for vasking. Gjenta vasketrinnet minst tre ganger for å fjerne overflødig HiBiT-RBD. Tilsett 50 mikroliter 1X PBS og 50 mikroliter 1X stor BiT og inkuber i minst fem minutter ved romtemperatur.Klargjør luminometerprogramvaren. Tilsett deretter 50 mikroliter 1X substrat. Plasser platen i maskinen, kjør programvare og registrer signalene.Sammenlign signalene fra serumprøver, kontrollprøver og bakgrunnssignal fra tomme brønner. Signalene fra både HiBiT-RBD som inneholder cellelysat og supernatant av de transfiserte cellene ble registrert for å evaluere riktig proteinkilde. Dataene viste lav bakgrunn sammenlignet med et sterkt signal da begge delene ble kombinert.Tilsetningen av Protein G hjelper antistoffutfelling. Analysen ble brukt til å sammenligne signalet fra et kommersielt SARS-CoV-2 nøytraliserende antistoff med en kontroll-IgG. Det spesifikke antistoffsignalet var robust, mens kontrollantistoffet hadde nær det lysende bakgrunnsnivået.Rekombinant svekket onkolytisk vesikulær stomatittvirus eller VSV med en mutasjon i posisjon 51 av M-proteinet som uttrykker eksogen RBD ble brukt til å vaksinere mus. Serumet som ble samlet inn fra vaksinerte mus, ga et robust signal sammenlignet med ingen signaler hos mus injisert med kontroll VSV. Denne protokollen kan brukes til påvisning av SARS-CoV-2 antistoffer i pasientserumprøver.Vasketrinnene etter inkubasjon med Protein G er avgjørende for å redusere bakgrunnen. I tillegg er det viktig å legge til substratet så raskt som mulig for å unngå signaltap. Med noen få ekstra optimaliseringstrinn kan den samme analysen brukes til å analysere blodprøver og kan være en effektiv metode for å bestemme anti-SARS-CoV-2 antistoffer i pasientblodprøver.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering av SARS-CoV-2 ved hjelp av Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Påvisning av SARS-CoV-2 Nøytraliserende antistoffer ved bruk av fluorescerende avbildning av pseudovirusinfeksjon med høy gjennomstrømning

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

En rask, Multiplex Dual Reporter IgG og IgM SARS-CoV-2 nøytraliseringsanalyse for et Multiplexed Bead-basert flytanalysesystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Levende avbildning og kvantifisering av virusinfeksjon hos K18 hACE2 transgene mus ved hjelp av Reporter-Expressing Rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Effektiv SARS-CoV-2 kvantitativ omvendt transkripsjon PCR spytt diagnostisk strategi ved hjelp av åpen kildekode pipettering roboter

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multipleks immunanalyse for Borrelia-spesifikk IgG og IgM i serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Forfatter Spotlight: Utvide omfanget av multipleks immunanalyser for diagnostikk av borreliose og patogenforskning 

Samtidig påvisning av forskjellige antistoffklasser i en multiplekset serologisk test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Kvantifisering av vaksineinduserte nøytraliserende antistoffer i SARS-CoV-2-varianter

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Forfatter Spotlight: Et pseudotype-virussystem for vurdering av omikron-subvarianter og nøytraliserende antistoffer i SARS-CoV-2-forskning

Anvendelse av Ha-CoV-2 pseudovirus for rask kvantifisering av SARS-CoV-2-varianter og nøytraliserende antistoffer

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...