Name: detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Мы ценим и благодарим за техническую помощь Сяохун Хэ, Рикардо Мариуса, Джулии Петрик, Брэдли Остина и Кристиано Танезе Де Соуза. Мы также благодарим Мину Гахремани за графический дизайн. Мы также хотели бы поблагодарить всех людей, которые приняли участие и сдали свои образцы крови для этого исследования. DWC частично поддерживается факультетом uOttawa и кафедрой медицины.

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный ниже, придерживается всех этических принципов в соответствии с протокольным кодом 20200371-01H.
1. Производство и оценка биорепортера HiBiT-RBD
<ol><li>Производство достаточного количества биорепортера HiBiT-RBD<ol>
<li>Подготовка к культуре клеток<ol>
<li>При?...

<ol>
	<li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+coronavirus+2019+(COVID-19)+pandemic+outbreak:+A+comprehensive+review+of+the+current+literature.">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li><li>Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: <a target="_blank" href="https://www.worldometers.info/coronavirus/">https://www.worldometers.info/coronavirus/</a> (2021)</li><li>Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+wave+COVID-19+pandemics+in+Europe:+a+temporal+playbook.">Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).</li><li>COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines">https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines</a> (2021)</li><li>Hueston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+response+to+SARS-CoV-2+infection.">The antibody response to SARS-CoV-2 infection.</a> Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).</li><li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor.">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology.">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li><li>Premkumar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor-binding+domain+of+the+viral+spike+protein+is+an+immunodominant+and+highly+specific+target+of+antibodies+in+SARS-CoV-2+patients.">The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients.</a> Science Immunology. 5 (48), (2020).</li><li>Walls, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elicitation+of+potent+neutralizing+antibody+responses+by+designed+protein+nanoparticle+vaccines+for+SARS-CoV-2.">Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2.</a> Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).</li><li>Azad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+reveals+the+importance+of+N-+linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Mol Ther. , 0074-0075 (2021).</li><li>Bastos, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19:+systematic+review+and+meta-analysis.">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516 (2020).</li><li>Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa">https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa</a> (2021)</li><li>Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+bioluminescent+systems.">A brief review of bioluminescent systems.</a> Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion.">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening.">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP/TAZ-TEAD+biosensors.">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596 (2019).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis.">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li><li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide.">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion.">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).</li></ol>

Растущее число людей, инфицированных SARS-CoV-2, и продолжающиеся усилия по глобальной вакцинации требуют чувствительных и быстрых серологических тестов, которые могут быть использованы в крупномасштабных серообследовании. Недавние исследования показывают, что биорепортеры на основе ра...

Недавнее появление нового коронавируса SARS-CoV21 вызвало более 2 800 000 смертельных случаев и 128 миллионов инфекций по состоянию на 30 марта 20212 года. Из-за отсутствия надежной и хорошо отлаженной процедуры лечения для клинической терапии SARS-CoV-2 было предпринято много усилий по ограничению дальнейшей передачи вируса и, что более важно, по разработке эффективного и надежного лечения или вакцины3. На сегодняшний день в испытаниях, о которых сообщила Всемирная организация здравоохранения4, насчитывается более 50 вакцин-кандидатов на вакцину от COVID-19. Выявление антител против SARS-CoV-2 имеет первостепенное значение для определения долгосрочной стабильности гуморального ответа при введении вакцины, а также у выздоровевших пациентов с COVID-195. Некоторые исследования показали, что существует вероятность того, что выздоровевшие пациенты с SARS-CoV-2 теряют большую часть RBD-связывающих антител через 1 год5,6,7,8,9. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше понять устойчивый иммунитет, и более чувствительные платформы обнаружения антител могут помочь в дальнейшей такой работе. Сообщения о устойчивом иммунитете к легким инфекциям SARS-CoV-2, которые предполагают долгосрочные реакции антител, также являются интересной и стоящей областью исследования. Быстрый и точный метод обнаружения необходим для мониторинга антител в сыворотках людей, чтобы предоставить больше информации об иммунитете в популяции.
Как и другие коронавирусы, SARS-CoV-2 использует выступающий шип гликопротеин для связывания с ангиотензинпревращающим ферментом-2 (ACE2), чтобы инициировать каскад событий, которые приводят к слиянию вирусной и клеточной мембран6,7. Несколько исследований недавно доказали, что RBD белка Spike играет решающую роль в получении мощного и специфического ответа антител против SARS-CoV28,9,10,11. В частности, корреляции, наблюдаемые Premkumar et al. между титром RBD-связывающего антитела и эффективностью нейтрализации SARS-CoV-2 плазмы пациентов, согласуются с тем, что RBD является иммуногенным компартментом структуры вируса9. Имея это в виду, многие диагностические тесты, доступные для обнаружения антител к SARS-CoV-2, являются трудоемкими и дорогостоящими, требуют длительной процедуры инкубации и промывки (иммуноферментный анализ [ИФА]) или отсутствия чувствительности и точности (иммуноанализ бокового потока [LFIA])12. Таким образом, количественный и быстрый комплементарный серологический метод обнаружения антител, полученных из COVID-19, с высокой чувствительностью, быстрым ответом и относительно низкой стоимостью, послужил бы необходимости в надежном серологическом тесте для эпидемиологического эпиднадзора SARS-CoV-2.
В совокупности ограничения текущих серологических анализов побудили к исследованию системы биолюминесцентной отчетности в качестве потенциального диагностического агента в будущих серообследовании. Биолюминесценция представляет собой естественную реакцию фермента / субстрата с излучением света. Нанолюк люцифераза является самой маленькой (19 кДа), но самой яркой системой по сравнению с Люциферазой Рениллы и светлячка (36 кДа и 61 кДа соответственно)13,14. Кроме того, Nanoluc имеет самое высокое отношение сигнал/шум и стабильность среди ранее упомянутых систем. Высокая интенсивность сигнала Nanoluc поддерживает обнаружение даже очень низких количеств репортерных слияний15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) представляет собой разделенную версию системы Nanoluc, которая состоит из двух сегментов: малого BiT (11 аминокислот; SmBiT) и большой BiT (LgBiT) с относительно низкими аффинными взаимодействиями (KD = 190 мкМ) с образованием люминесцентного комплекса16. NanoBiT широко используется в различных исследованиях, включающих идентификацию белково-белковых взаимодействий15,17,18,19 и клеточных сигнальных путей11,20,21.
Недавно вместо SmBiT был введен еще один небольшой пептид с явно более высоким сродством к LgBiT (KD = 0,7 нМ), а именно система HiBiT Nano-Glo. Высокое сродство и сильный сигнал анализа Nano-Glo «add-mix-read» делает HiBiT подходящей, количественной, люминесцентной пептидной меткой. В этом подходе тег HiBiT добавляется к белку-мишени путем разработки конструкции, накладывающей минимальные структурные помехи. Слияние HiBiT-белка будет активно связываться с аналогом LgBiT, производя высокоактивный фермент люциферазы для генерации обнаруживаемой биолюминесценции в присутствии реагентов обнаружения (рисунок 1). Аналогичным образом, мы разработали систему на основе HiBiT Nano-Glo для легкого измерения титра нейтрализующих антител в сыворотках выздоровевших людей SARS-CoV-2 и недавно разработали HIBiT-помеченный SARS-CoV-2 RBD. В этой статье описывается протокол производства биорепортера HiBiT-RBD с использованием стандартных лабораторных процедур и оборудования, и показано, как этот биорепортер может быть использован в быстром и эффективном анализе для обнаружения антител, нацеленных на SARS-CoV-2 RBD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Passive Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E194A</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>171020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td>100 mL kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT-RBD Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt
				gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata
				gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg
				aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta
				agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa
				ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg
				cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc
				gttgacattgattattgactagttattaatagt
				aatcaattacggggtcattagttcatagcccat
				atatggagttccgcgttacataacttacggtaa
				atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc
				ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc
				atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc
				aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact
				tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta
				cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg
				cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat
				gggactttcctacttggcagtacatctacgtat
				tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt
				ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg
				actcacggggatttccaagtctccaccccattg
				acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc
				aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg
				ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta
				cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg
				ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg
				aaattaatacgactcactatagggagacccaa
				gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga
				gctcggatccgccaccATGGAGACAGA
				CACACTCCTGCTATGGGTACTGC
				TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC
				TGGTGACtctggctctagcggctctggctct
				agcggcggcATGGTGAGCGGCTG
				GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC
				tctagcggcGACTACAAGGACC
				ACGACGGTGACTACAAGGACCA
				CGACATCGACTACAAGGACGAC
				GACGACAAGggcagcggctccggca
				gcagcggaggaggaggctctggaggagga
				ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg
				cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat
				ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga
				atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct
				gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt
				gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac
				ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt
				gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc
				acctggacagacaggcaagatcgccgactac
				aactataagctgccagacgatttcaccggct
				gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt
				ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac
				cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt
				tgagcgggatatcagcacagagatctaccag
				gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg
				gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc
				ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca
				tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg
				cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc
				gagggccgccacatgctggagatgggccatc
				atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag
				cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac
				ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt
				gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg
				ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac
				tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat
				cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg
				ggtggggtggggcaggacagcaaggggga
				ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg
				gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa
				agaaccagctggggctctagggggtatcccca
				cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg
				ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
				acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg
				ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt
				tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta
				gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc
				ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta
				gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc
				ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg
				gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc
				ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt
				gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg
				atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt
				ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc
				caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag
				catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg
				aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt
				atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac
				catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc
				ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc
				ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc
				cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa
				gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg
				caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc
				ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt
				cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg
				ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc
				tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct
				gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg
				cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg
				tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg
				cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct
				tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg
				ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc
				ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg
				ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg
				cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc
				ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg
				agcgagcacgtactcggatggaagccggtct
				tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat
				caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca
				ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg
				atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg
				ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt
				ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt
				ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct
				acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg
				aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg
				tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc
				ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg
				ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag
				cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat
				tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt
				cggaatcgttttccgggacgccggctggatga
				tcctccagcgcggggatctcatgctggagt
				tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta
				taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa
				atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt
				ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat
				cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct
				agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc
				ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac
				aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag
				cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat
				taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
				gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa
				tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg
				tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc
				gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt
				atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc
				cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa
				catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag
				gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt
				tccataggctccgcccccctgacgagcatcac
				aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa
				acccgacaggactataaagataccaggcgtt
				tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt
				ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc
				tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat
				agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag
				gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa
				ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc
				ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag
				acacgacttatcgccactggcagcagccactg
				gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc
				ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact
				acggctacactagaagaacagtatttggtatc
				tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa
				aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa
				ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca
				agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat
				ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt
				ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa
				gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct
				tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt
				ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
				ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg
				cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca
				tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac
				gatacgggagggcttaccatctggccccagtg
				ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc
				ggctccagatttatcagcaataaaccagccag
				ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg
				caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt
				gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt
				aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag
				gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg
				cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc
				gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag
				cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca
				gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
				tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg
				ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta
				ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg
				gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg
				ggataataccgcgccacatagcagaactttaa
				aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc
				gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat
				ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact
				gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc
				tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc
				cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga
				aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat
				attattgaagcatttatcagggttattgtc
				tcatgagcggatacatatttgaatgtattt
				agaaaaataaacaaataggggttccgcgca
				catttccccgaaaagtgccacctgacgtc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein G Magnetic Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Mx Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>96-well plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2520056</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter

Появление пандемии COVID-19 увеличило потребность в более совершенных серологических методах выявления для определения эпидемиологического воздействия тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2). Растущее число инфекций SARS-CoV-2 повышает потребность в лучших анализах обнаружения антител. Современные методы обнаружения антител ставят под угрозу чувствительность для скорости или являются чувствительными, но отнимают много времени. Большая часть SARS-CoV-2-нейтрализующих антител нацелена на рецептор-связывающий домен (RBD), один из первичных иммуногенных компартментов SARS-CoV-2. Недавно мы спроектировали и разработали высокочувствительный, биолюминесцентный RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) для обнаружения антител к SARS-CoV-2. В следующем тексте описывается процедура получения комплекса HiBiT-RBD и быстрый анализ для оценки наличия антител, нацеленных на RBD, с использованием этого инструмента. Благодаря долговечности белкового продукта HiBiT-RBD в широком диапазоне температур и более короткой экспериментальной процедуре, которая может быть завершена в течение 1 ч, протокол можно рассматривать как более эффективную альтернативу для обнаружения антител к SARS-CoV-2 в образцах сыворотки крови пациента.

Сигналы как от HiBit-RBD-содержащего клеточного лизата, так и от супернатанта трансфектированных клеток были записаны (рисунок 2) для оценки соответствующего источника белка. HiBiT-RBD и LgBit использовались отдельно в качестве элементов управления, и данные показали низкий фон п?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Описанный протокол описывает процедуру получения белкового комплекса HiBiT-рецептор-связывающего домена и его применение для быстрого и чувствительного обнаружения антител к SARS-CoV-2.

Обнаружение рецептор-связывающего домена антитела SARS-CoV-2 с помощью биорепортера на основе HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Моя лаборатория занимается исследованиями COVID-19, и недавно мы разработали новый анализ, который позволил нам быстро и точно обнаружить антитела к SARS-CoV-2. Этот протокол описывает высокопроизводительный анализ для обнаружения антител против SARS-CoV-2 в образцах сыворотки пациентов, что имеет решающее значение с учетом текущей пандемии. Большинство современных серологических анализов жертвуют скоростью ради чувствительности или наоборот.Наши данные показывают, что наш анализ чувствителен и имеет быстрое время отклика. Для того чтобы произвести достаточное количество биорепортера с высоким содержанием HiBiT-RBD, начните с подготовки к культуре клеток. Во-первых, приготовьте полную модифицированную орлиную среду Dulbecco, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина и стрептомицина.Затем прогрейте среду на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия. Включите шкаф биологической безопасности и используйте 70% этанол для стерилизации поверхности шкафа. Чтобы культивировать клеточную линию, выньте ее от минус 80 градусов по Цельсию или жидкого азота и разморозьте на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия.Смешайте размороженные клетки с содержанием не менее 10 миллилитров полной среды. Пипетка клеточной суспензии в 15-сантиметровую чашку Петри и закрутите пластину, чтобы распределить ячейки равномерно. Поместите блюдо в инкубатор клеточных культур при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа и влажности от 85 до 95%.Наблюдают за клетками под микроскопом до тех пор, пока уровень сливания не достигнет от 80 до 90% При высокой стечении удаляют среду, промывают клетки теплым PBS и добавляют от трех до пяти миллилитров 0,25% трипсина-ЭДТА для отделения клеток от поверхности. Примерно через пять минут посмотрите на клетки под микроскопом. Если все клетки плавают, добавьте не менее четырех миллилитров среды и перенесите клеточную суспензию в новую стерильную трубку.Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и добавьте один миллион клеток в каждую лунку шестилуночной пластины для трансфекции. Для выполнения трансфекции плазмиды HiBiT-RBD используйте один микрограмм экспрессионной плазмиды HiBiT-RBD с подходящим трансфекционным реагентом. Инкубировать в течение 10-15 минут при комнатной температуре, затем добавить общий объем к каждой лунке пластины по каплям.На следующий день замените среду, содержащую трансфекционную смесь, на полную среду. Хорошо наблюдают за контролем трансфекции через 48 часов после трансфекции. Соберите супернатант в 1,5 миллилитровых микротрубках.Добавьте 500 микролитров 1X пассивного лизисного буфера или PLB к клеткам, затем инкубируйте и встряхните пластину в течение 15 минут при комнатной температуре для лизиса клеток. Затем, чтобы оценить сигнал люминесценции от биорепортера с помощью анализа люциферазы, сначала подготовьте компоненты реакции и используйте супернатант в качестве источника биорепортера. Разбавьте большой BiT и субстрат до 1X перед использованием.Перенесите 50 микролитров супернатанта из каждой скважины или трубы в 96-луночную пластину и добавьте 50 микролитров 1X большого BiT в каждую скважину. Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. Откройте программное обеспечение люминометра, добавьте 50 микролитров подложки 1X в каждую скважину, поместите пластину в люминометр и запустите программное обеспечение.Чтобы выполнить анализ обнаружения антител HiBiT-RBD, подготовьте биорепортер HiBiT-RBD, как описано ранее, и объедините 50 микролитров HiBiT-RBD, содержащего супернатант, с одним микрограммом коммерческого антитела SARS-CoV-2 RBD в микропробирке объемом 1,5 миллилитра. Добавьте в раствор 20 микролитров иммуноглобулинсвязывающего белка или белка G. Доведите общий объем до 300 микролитров, добавив PBS.Инкубируйте трубки на шейкере или ротаторе в течение 30 минут. Центрифуга при 12 000 G в течение 30 секунд. Затем выбросьте супернатант и смойте PBS.Повторите этот процесс три раза, чтобы удалить свободный HiBiT-RBD. Повторно суспендируйте ячейки в 50 микролитрах PBS и перенесите их на 96-луночную пластину. Добавьте 50 микролитров 1X большого BiT и подождите пять минут.Затем добавьте 50 микролитров подложки 1X NanoLuc. Сразу же считывает сигнал люминесценции с помощью люминометра. Подготовьте большие количества биорепортера HiBiT-RBD для анализа с высокой пропускной способностью и объедините 20 микролитров магнитного белка G с 50 микролитрами супернатанта HiBiT-RBD в каждой скважине 96-луночной пластины для каждого образца.Добавьте 10 микролитров образца сыворотки в каждую лунку и доведите общий объем до 150 микролитров, добавив PBS. Инкубировать в течение 30 минут на шейкере при комнатной температуре. Затем поместите пластину на магнитную шайбу, чтобы вывести в осадок комплекс антител белка G.Выбросьте раствор в средней секции каждой лунки и добавьте PBS для промывки. Повторите этап стирки не менее трех раз, чтобы удалить избыток HiBiT-RBD. Добавьте 50 микролитров 1X PBS и 50 микролитров 1X большого BiT и инкубируйте в течение не менее пяти минут при комнатной температуре.Подготовьте программное обеспечение люминометра. Затем добавьте 50 микролитров подложки 1X. Поместите пластину в машину, запустите программное обеспечение и запишите сигналы.Сравните сигналы от образцов сыворотки, контрольных образцов и фонового сигнала из пустых скважин. Сигналы как от HiBiT-RBD, содержащего клеточный лизат, так и от супернатанта трансфектированных клеток были записаны для оценки соответствующего источника белка. Данные показали низкий фон по сравнению с сильным сигналом, когда обе части были объединены.Добавление белка G способствует осаждению антител. Анализ использовался для сравнения сигнала от коммерческого нейтрализующего антитела SARS-CoV-2 с контрольным IgG. Специфический сигнал антитела был надежным, в то время как контрольное антитело имело близкий к люминесцентному фоновому уровню.Рекомбинантный ослабленный онколитический вирус везикулярного стоматита или VSV с мутацией в позиции 51 белка М, экспрессирующего экзогенный RBD, использовался для вакцинации мышей. Сыворотка, собранная у вакцинированных мышей, производила надежный сигнал по сравнению с отсутствием сигнала у мышей, которым вводили контрольный VSV. Этот протокол может быть использован для обнаружения антител к SARS-CoV-2 в образцах сыворотки крови пациента.Этапы промывки после инкубации с белком G имеют решающее значение для снижения фона. Кроме того, важно добавить подложку как можно быстрее, чтобы избежать потери сигнала. С помощью нескольких дополнительных шагов оптимизации тот же анализ может быть использован для анализа образцов крови и может быть эффективным методом определения антител против SARS-CoV-2 в образцах крови пациентов.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Визуализация ТОРС-КоВ-2 с использованием иммуноРНК-флуоресценции в гибридизации Ситус

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Обнаружение нейтрализующих антител SARS-CoV-2 с использованием высокопроизводительной флуоресцентной визуализации псевдовирусной инфекции

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Экспресс-мультиплексный двойной репортер IgG и IgM SARS-CoV-2 нейтрализуя для мультиплексированной системы анализа потоков на основе шариков

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Живая визуализация и количественная оценка вирусной инфекции у трансгенных мышей K18 hACE2 с использованием репортер-экспрессирующего рекомбинантного SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Эффективная sars-CoV-2 количественная обратная транскриптаза ПЦР стратегия диагностики слюны с использованием роботов для пипетирования с открытым исходным кодом

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

Одновременное обнаружение различных классов антител в мультиплексном серологическом тесте

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Псевдотипированные вирусы как молекулярный инструмент мониторинга гуморальных иммунных реакций против SARS-CoV-2 с помощью нейтрализационного анализа

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Smartphone-Integrated Dengue NS1 Paper-Based Diagnostic Device

Portable Paper-Based Immunoassay Combined with Smartphone Application for Colorimetric and Quantitative Detection of Dengue NS1 Antigen

Author Spotlight: Development of a Smartphone-Enhanced Paper-Based Device for Rapid Dengue NS1 Detection

Портативный бумажный иммунологический анализ в сочетании с приложением для смартфона для колориметрического и количественного обнаружения антигена Dengue NS1

Dengue virus (DENV) infection, which is transmitted by Aedes mosquitoes, is a major public health concern in tropical and subtropical countries. With an ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

Выявление антител IgG и IgM к бешенству с помощью непрямого флуоресцентного теста на антитела к бешенству

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...