Name: detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Agradecemos y agradecemos la asistencia técnica de Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin y Christiano Tanese De Souza. También agradecemos a Mina Ghahremani por el diseño gráfico. También nos gustaría agradecer a todas las personas que participaron y donaron sus muestras de sangre para este estudio. DWC es apoyado en parte por la Facultad y el Departamento de Medicina de uOttawa.

NOTA: El protocolo que se describe a continuación se adhiere a todas las pautas de ética de acuerdo con el código de protocolo 20200371-01H.
1. Producción y evaluación del bioreportaje HiBiT-RBD
<ol><li>Producir una cantidad suficiente de bioreportero HiBiT-RBD<ol>
<li>Prepárese para el cultivo celular<ol>
<li>Prepare el medio Eagle modificado (DMEM) completo de Dulbecco que contenga 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina/estreptomicina. Luego, caliente los medios en un baño de ...

<ol>
	<li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+coronavirus+2019+(COVID-19)+pandemic+outbreak:+A+comprehensive+review+of+the+current+literature.">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li><li>Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: <a target="_blank" href="https://www.worldometers.info/coronavirus/">https://www.worldometers.info/coronavirus/</a> (2021)</li><li>Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+wave+COVID-19+pandemics+in+Europe:+a+temporal+playbook.">Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).</li><li>COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines">https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines</a> (2021)</li><li>Hueston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+response+to+SARS-CoV-2+infection.">The antibody response to SARS-CoV-2 infection.</a> Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).</li><li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor.">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology.">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li><li>Premkumar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor-binding+domain+of+the+viral+spike+protein+is+an+immunodominant+and+highly+specific+target+of+antibodies+in+SARS-CoV-2+patients.">The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients.</a> Science Immunology. 5 (48), (2020).</li><li>Walls, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elicitation+of+potent+neutralizing+antibody+responses+by+designed+protein+nanoparticle+vaccines+for+SARS-CoV-2.">Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2.</a> Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).</li><li>Azad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+reveals+the+importance+of+N-+linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Mol Ther. , 0074-0075 (2021).</li><li>Bastos, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19:+systematic+review+and+meta-analysis.">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516 (2020).</li><li>Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa">https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa</a> (2021)</li><li>Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+bioluminescent+systems.">A brief review of bioluminescent systems.</a> Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion.">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening.">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP/TAZ-TEAD+biosensors.">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596 (2019).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis.">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li><li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide.">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion.">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).</li></ol>

El creciente número de personas infectadas con el SARS-CoV-2 y el esfuerzo continuo para la vacunación mundial requieren pruebas serológicas sensibles y rápidas que puedan usarse en seroencuestas a gran escala. Investigaciones recientes muestran que los bioreporteros basados en nanoluciferasa dividida se pueden utilizar para desarrollar tales ensayos. Recientemente desarrollamos el bioreportaje HiBiT-RBD para diseñar una prueba que se puede utilizar para detectar anticuerpos específicos del SARS-CoV-2 en el suero d...

La reciente aparición de un nuevo coronavirus, el SARS-CoV21, ha causado más de 2.800.000 muertes y 128 millones de infecciones hasta el 30 de marzo de 20212. Debido a la falta de un procedimiento de tratamiento confiable y bien establecido para las terapias clínicas del SARS-CoV-2, se han realizado muchos esfuerzos para restringir la transmisión viral adicional y, lo que es más importante, para desarrollar un tratamiento efectivo y robusto o una vacuna3. Hasta la fecha, hay más de 50 vacunas candidatas contra la COVID-19 en ensayos reportados por la Organización Mundial de la Salud4. La detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 es de suma importancia para determinar la estabilidad a largo plazo de la respuesta humoral tras la administración de la vacuna, así como en pacientes recuperados de COVID-195. Algunos estudios han demostrado que existe la posibilidad de que los pacientes recuperados con SARS-CoV-2 pierdan la mayoría de los anticuerpos de unión a RBD después de 1 año5,6,7,8,9. Se requiere más investigación para comprender mejor la inmunidad duradera, y las plataformas de detección de anticuerpos más sensibles pueden ayudar a avanzar en dicho trabajo. Los informes de inmunidad sostenida de infecciones leves por SARS-CoV-2, que sugieren respuestas de anticuerpos a largo plazo, también son un área de estudio interesante y valiosa. Un método rápido y preciso de detección es esencial para monitorear los anticuerpos en los sueros de los individuos para proporcionar más información sobre la inmunidad en la población.
Al igual que otros coronavirus, el SARS-CoV-2 utiliza glicoproteína de espiga que sobresale para unirse a la enzima convertidora de angiotensina-2 (ACE2) para iniciar una cascada de eventos que conducen a la fusión de las membranas viral y celular6,7. Varios estudios han demostrado recientemente que la RBD de la proteína Spike tiene un papel crucial en la obtención de una respuesta de anticuerpos potente y específica contra el SARS-CoV28,9,10,11. En particular, las correlaciones observadas por Premkumar et al. entre el título del anticuerpo de unión a RBD y la potencia de neutralización del SARS-CoV-2 del plasma de los pacientes son consistentes con rbD siendo un compartimento inmunogénico de la estructura del virus9. Con esto en mente, muchas pruebas de diagnóstico disponibles para la detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 requieren mucho tiempo y costo, requieren un largo procedimiento de incubación y lavado (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas [ELISA]) o carecen de sensibilidad y precisión (inmunoensayo de flujo lateral [LFIA])12. Por lo tanto, un método serológico complementario cuantitativo y rápido de detección de anticuerpos derivados de COVID-19 con alta sensibilidad, respuesta rápida y costo relativamente bajo serviría a la necesidad de una prueba serológica confiable para la vigilancia epidemiológica del SARS-CoV-2.
En conjunto, las limitaciones de los ensayos serológicos actuales impulsaron la investigación del sistema de notificación bioluminiscente como un posible agente de diagnóstico en futuras seroencuestas. La bioluminiscencia es una reacción enzimática/sustrato natural, con emisión de luz. La luciferasa nanolúcida es la más pequeña (19 kDa), pero el sistema más brillante en comparación con la luciferasa Renilla y la luciérnaga (36 kDa y 61 kDa, respectivamente)13,14. Además, Nanoluc tiene la relación señal/ruido más alta y la estabilidad entre los sistemas mencionados anteriormente. La alta intensidad de señal de Nanoluc permite la detección de cantidades incluso muy bajas de fusiones de reporteros15. La Tecnología Binaria Nanoluc (NanoBiT) es una versión dividida del sistema Nanoluc, que se compone de dos segmentos: BiT pequeño (11 aminoácidos; SmBiT) y BiT grande (LgBiT) con interacciones de afinidad relativamente baja (KD = 190 μM) para formar un complejo luminiscente16. NanoBiT se utiliza ampliamente en diversos estudios que implican la identificación de interacciones proteína-proteína15,17,18,19 y vías de señalización celular11,20,21.
Recientemente, se introdujo otro pequeño péptido con una afinidad claramente mayor con LgBiT (KD = 0.7 nM), a saber, el sistema HiBiT Nano-Glo, en lugar de SmBiT. La alta afinidad y la fuerte señal del ensayo Nano-Glo "add-mix-read" hacen de HiBiT una etiqueta peptídica luminiscente, cuantitativa y adecuada. En este enfoque, la etiqueta HiBiT se agrega a la proteína objetivo mediante el desarrollo de una construcción que impone una interferencia estructural mínima. La fusión de la proteína HiBiT se uniría activamente a la contraparte lgBiT, produciendo una enzima luciferasa altamente activa para generar bioluminiscencia detectable en presencia de reactivos de detección (Figura 1). Del mismo modo, desarrollamos un sistema basado en HiBiT Nano-Glo para medir fácilmente el título de anticuerpos neutralizantes en los sueros de individuos recuperados de SARS-CoV-2 y recientemente desarrollamos un RBD sarS-CoV-2 marcado con HiBiT. Este artículo describe el protocolo para producir el bioreportaje HiBiT-RBD utilizando procedimientos y equipos de laboratorio estándar, y muestra cómo este bioreportero se puede utilizar en un ensayo rápido y eficiente para detectar anticuerpos dirigidos al SARS-CoV-2 RBD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Passive Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E194A</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>171020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td>100 mL kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT-RBD Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt
				gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata
				gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg
				aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta
				agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa
				ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg
				cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc
				gttgacattgattattgactagttattaatagt
				aatcaattacggggtcattagttcatagcccat
				atatggagttccgcgttacataacttacggtaa
				atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc
				ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc
				atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc
				aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact
				tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta
				cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg
				cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat
				gggactttcctacttggcagtacatctacgtat
				tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt
				ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg
				actcacggggatttccaagtctccaccccattg
				acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc
				aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg
				ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta
				cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg
				ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg
				aaattaatacgactcactatagggagacccaa
				gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga
				gctcggatccgccaccATGGAGACAGA
				CACACTCCTGCTATGGGTACTGC
				TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC
				TGGTGACtctggctctagcggctctggctct
				agcggcggcATGGTGAGCGGCTG
				GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC
				tctagcggcGACTACAAGGACC
				ACGACGGTGACTACAAGGACCA
				CGACATCGACTACAAGGACGAC
				GACGACAAGggcagcggctccggca
				gcagcggaggaggaggctctggaggagga
				ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg
				cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat
				ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga
				atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct
				gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt
				gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac
				ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt
				gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc
				acctggacagacaggcaagatcgccgactac
				aactataagctgccagacgatttcaccggct
				gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt
				ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac
				cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt
				tgagcgggatatcagcacagagatctaccag
				gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg
				gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc
				ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca
				tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg
				cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc
				gagggccgccacatgctggagatgggccatc
				atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag
				cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac
				ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt
				gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg
				ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac
				tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat
				cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg
				ggtggggtggggcaggacagcaaggggga
				ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg
				gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa
				agaaccagctggggctctagggggtatcccca
				cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg
				ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
				acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg
				ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt
				tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta
				gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc
				ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta
				gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc
				ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg
				gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc
				ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt
				gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg
				atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt
				ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc
				caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag
				catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg
				aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt
				atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac
				catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc
				ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc
				ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc
				cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa
				gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg
				caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc
				ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt
				cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg
				ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc
				tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct
				gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg
				cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg
				tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg
				cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct
				tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg
				ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc
				ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg
				ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg
				cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc
				ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg
				agcgagcacgtactcggatggaagccggtct
				tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat
				caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca
				ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg
				atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg
				ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt
				ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt
				ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct
				acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg
				aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg
				tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc
				ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg
				ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag
				cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat
				tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt
				cggaatcgttttccgggacgccggctggatga
				tcctccagcgcggggatctcatgctggagt
				tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta
				taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa
				atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt
				ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat
				cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct
				agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc
				ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac
				aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag
				cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat
				taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
				gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa
				tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg
				tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc
				gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt
				atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc
				cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa
				catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag
				gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt
				tccataggctccgcccccctgacgagcatcac
				aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa
				acccgacaggactataaagataccaggcgtt
				tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt
				ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc
				tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat
				agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag
				gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa
				ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc
				ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag
				acacgacttatcgccactggcagcagccactg
				gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc
				ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact
				acggctacactagaagaacagtatttggtatc
				tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa
				aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa
				ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca
				agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat
				ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt
				ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa
				gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct
				tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt
				ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
				ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg
				cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca
				tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac
				gatacgggagggcttaccatctggccccagtg
				ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc
				ggctccagatttatcagcaataaaccagccag
				ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg
				caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt
				gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt
				aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag
				gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg
				cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc
				gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag
				cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca
				gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
				tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg
				ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta
				ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg
				gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg
				ggataataccgcgccacatagcagaactttaa
				aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc
				gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat
				ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact
				gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc
				tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc
				cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga
				aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat
				attattgaagcatttatcagggttattgtc
				tcatgagcggatacatatttgaatgtattt
				agaaaaataaacaaataggggttccgcgca
				catttccccgaaaagtgccacctgacgtc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein G Magnetic Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Mx Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>96-well plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2520056</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter

La aparición de la pandemia de COVID-19 ha aumentado la necesidad de mejores métodos de detección serológica para determinar el impacto epidemiológico del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2). El creciente número de infecciones por SARS-CoV-2 plantea la necesidad de mejores ensayos de detección de anticuerpos. Los métodos actuales de detección de anticuerpos comprometen la sensibilidad a la velocidad o son sensibles pero requieren mucho tiempo. Una gran proporción de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 se dirigen al dominio de unión al receptor (RBD), uno de los principales compartimentos inmunogénicos del SARS-CoV-2. Recientemente hemos diseñado y desarrollado un RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) altamente sensible y marcado como bioluminiscente para detectar anticuerpos contra el SARS-CoV-2. El siguiente texto describe el procedimiento para producir el complejo HiBiT-RBD y un ensayo rápido para evaluar la presencia de anticuerpos dirigidos a RBD utilizando esta herramienta. Debido a la durabilidad del producto de proteína HiBiT-RBD en un amplio rango de temperaturas y al procedimiento experimental más corto que se puede completar en 1 h, el protocolo puede considerarse como una alternativa más eficiente para detectar anticuerpos contra el SARS-CoV-2 en muestras de suero de pacientes.

Se registraron las señales tanto del lisado celular que contiene HiBit-RBD como del sobrenadante de las células transfectadas (Figura 2) para evaluar la fuente de proteína apropiada. HiBiT-RBD y LgBit se utilizaron por separado como controles, y los datos mostraron un fondo bajo en comparación con una señal fuerte cuando se combinaron ambas partes. Por lo tanto, la interacción HiBiT-RBD con LgBiT es necesaria para generar enzima activa para la digestión del sustrato y la actividad de ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

El protocolo descrito describe el procedimiento para producir el complejo de proteínas de dominio de unión al receptor HiBiT y su aplicación para la detección rápida y sensible de anticuerpos contra el SARS-CoV-2.

Detección de anticuerpos de dominio de unión al receptor SARS-CoV-2 mediante un bioinformador basado en HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Mi laboratorio ha estado trabajando en la investigación de COVID-19, y recientemente hemos desarrollado un nuevo ensayo que nos permitió detectar de forma rápida y precisa los anticuerpos contra el SARS-CoV-2. Este protocolo describe un ensayo de alto rendimiento para detectar anticuerpos anti-SARS-CoV-2 en muestras de suero de pacientes, lo cual es crítico dada la pandemia actual. La mayoría de los ensayos serológicos actuales sacrifican la velocidad por la sensibilidad o viceversa.Nuestros datos muestran que nuestro ensayo es sensible y tiene un tiempo de respuesta rápido. Para producir una cantidad suficiente de bioreportaje hiBiT-RBD alto, comience por prepararse para el cultivo celular. Primero, prepare el medio de águila modificado completo de Dulbecco que contenga 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina y estreptomicina.Luego caliente los medios en un baño de agua de 37 grados centígrados. Encienda el gabinete de seguridad biológica y use etanol al 70% para esterilizar la superficie del gabinete. Para cultivar la línea celular, sáquela de menos 80 grados Celsius o nitrógeno líquido y descongele en un baño de agua de 37 grados Celsius.Mezcle las células descongeladas con al menos 10 mililitros de medio completo. Pipetear la suspensión de la celda en una placa de Petri de 15 centímetros y girar la placa para distribuir las células de manera uniforme. Coloque el plato en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 85 a 95% de humedad.Observe las células bajo el microscopio hasta que el nivel de confluencia alcance el 80 a 90% En alta confluencia, retire el medio, lave las células con PBS caliente y agregue de tres a cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0.25% para separar las células de la superficie. Después de aproximadamente cinco minutos, observe las células bajo un microscopio. Si todas las células están flotando, agregue al menos cuatro mililitros de medio y transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo estéril.Cuente las células usando un hemocitómetro y agregue un millón de células en cada pozo de una placa de seis pocillos para la transfección. Para realizar la transfección del plásmido HiBiT-RBD, utilice un microgramo del plásmido de expresión HiBiT-RBD con un reactivo de transfección adecuado. Incubar durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, luego agregar el volumen total a cada pocillo de la placa gota a gota.Al día siguiente, reemplace el medio que contiene la mezcla de transfección con un medio completo. Observe bien el control de la transfección 48 horas después de la transfección. Recoge el sobrenadante en microtubos de 1,5 mililitros.Agregue 500 microlitros de tampón de lisis pasiva 1X o PLB a las células, luego incube y agite la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente para la lisis celular. A continuación, para evaluar la señal de luminiscencia del bioreportero utilizando un ensayo de luciferasa, primero prepare los componentes de reacción y use el sobrenadante como fuente del bioreportero. Diluya el BiT grande y el sustrato a 1X antes de usarlo.Transfiera 50 microlitros del sobrenadante de cada pozo o tubo a una placa de 96 pocillos y agregue 50 microlitros de 1X BiT grande a cada pozo. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Abra el software del luminómetro, agregue 50 microlitros de sustrato 1X a cada pozo, coloque la placa en el luminómetro y ejecute el software.Para realizar el ensayo de detección de anticuerpos HiBiT-RBD, prepare el bioinformador HiBiT-RBD como se describió anteriormente y combine 50 microlitros del hiBiT-RBD que contienen sobrenadante con un microgramo del anticuerpo comercial SARS-CoV-2 RBD en un microtubo de 1,5 mililitros. Agregue 20 microlitros de proteína de unión a inmunoglobulina o proteína G a la solución. Lleve el volumen total a 300 microlitros agregando PBS.Incubar los tubos en un agitador o rotador de tubos durante 30 minutos. Centrifugar a 12.000 G durante 30 segundos. Luego deseche el sobrenadante y lávelo con PBS.Repita el proceso tres veces para eliminar HiBiT-RBD gratis. Resuspend las células en 50 microlitros de PBS y transfiéralo a una placa de 96 pocillos. Agregue 50 microlitros de BiT grande 1X y espere cinco minutos.Luego agregue 50 microlitros de sustrato 1X NanoLuc. Lea inmediatamente la señal de luminiscencia con un luminómetro. Prepare grandes cantidades del bioreportaje HiBiT-RBD para un ensayo de alto rendimiento y combine 20 microlitros de proteína G magnética con 50 microlitros del sobrenadante HiBiT-RBD en cada pocillo de una placa de 96 pocillos para cada muestra.Agregue 10 microlitros de la muestra de suero a cada pocillo y lleve el volumen total a 150 microlitros agregando PBS. Incubar durante 30 minutos en un agitador a temperatura ambiente. Luego coloque la placa en una lavadora magnética para precipitar el complejo de anticuerpos de proteína G.Deseche la solución en la sección central de cada pozo y agregue PBS para lavar. Repita el paso de lavado al menos tres veces para eliminar el exceso de HiBiT-RBD. Agregue 50 microlitros de 1X PBS y 50 microlitros de 1X BiT grande e incube durante al menos cinco minutos a temperatura ambiente.Prepare el software del luminómetro. Luego agregue 50 microlitros de sustrato 1X. Coloque la placa en la máquina, ejecute el software y registre las señales.Compare las señales de muestras de suero, muestras de control y señal de fondo de pozos vacíos. Las señales tanto del HiBiT-RBD que contiene lisado celular como del sobrenadante de las células transfectadas se registraron para evaluar la fuente de proteína apropiada. Los datos mostraron un fondo bajo en comparación con una señal fuerte cuando se combinaron ambas partes.La adición de proteína G ayuda a la precipitación de anticuerpos. El ensayo se utilizó para comparar la señal de un anticuerpo neutralizante comercial del SARS-CoV-2 con una IgG de control. La señal de anticuerpo específica era robusta, mientras que el anticuerpo de control tenía cerca del nivel de fondo luminiscente.Para vacunar ratones se utilizó el virus de la estomatitis vesicular oncolítica atenuada recombinante o VSV con una mutación en la posición 51 de la proteína M que expresa RBD exógena. El suero recolectado de ratones vacunados produjo una señal robusta en comparación con ninguna señal en ratones inyectados con VSV de control. Este protocolo se puede utilizar para la detección de los anticuerpos contra el SARS-CoV-2 en muestras de suero de pacientes.Los pasos de lavado después de la incubación con proteína G son críticos para reducir el fondo. Además, es importante agregar el sustrato lo más rápido posible para evitar la pérdida de señal. Con algunos pasos de optimización adicionales, el mismo ensayo se puede utilizar para analizar muestras de sangre y podría ser un método eficaz para determinar los anticuerpos anti-SARS-CoV-2 en muestras de sangre de pacientes.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualización Del SARS-CoV-2 Usando Inmuno ARN-Fluorescencia Hibridación In Situ

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Investigación

Inmunología e Infección

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Detección de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 mediante imágenes fluorescentes de alto rendimiento de la infección por pseudovirus

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Un ensayo de neutralización igG e IgM SARS-CoV-2 de doble multiplex multiplexing para un sistema de análisis de flujo multiplexado basado en perlas

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral en ratones transgénicos K18 hACE2 utilizando SARS-CoV-2 recombinante que expresa el reportero

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Estrategia eficiente de diagnóstico de saliva por PCR con transcriptasa inversa cuantitativa del SARS-CoV-2 utilizando robots pipeteadores de código abierto

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

Detección simultánea de diferentes clases de anticuerpos en una prueba serológica multiplexada

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Virus pseudotipados como herramienta molecular para monitorizar las respuestas inmunitarias humorales contra el SARS-CoV-2 mediante ensayo de neutralización

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Smartphone-Integrated Dengue NS1 Paper-Based Diagnostic Device

Portable Paper-Based Immunoassay Combined with Smartphone Application for Colorimetric and Quantitative Detection of Dengue NS1 Antigen

Author Spotlight: Development of a Smartphone-Enhanced Paper-Based Device for Rapid Dengue NS1 Detection

Inmunoensayo portátil en papel combinado con una aplicación para teléfonos inteligentes para la detección colorimétrica y cuantitativa del antígeno NS1 del dengue

Dengue virus (DENV) infection, which is transmitted by Aedes mosquitoes, is a major public health concern in tropical and subtropical countries. With an ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

Detección de anticuerpos IgG e IgM contra la rabia mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos contra la rabia

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...