Name: detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Vi uppskattar och tackar den tekniska hjälpen från Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin och Christiano Tanese De Souza. Vi tackar också Mina Ghahremani för grafisk design. Vi vill också tacka alla individer som deltog och donerade sina blodprover för denna studie. DWC stöds delvis av uOttawa-fakulteten och Institutionen för medicin.

OBS: Protokollet som beskrivs nedan följer alla etiska riktlinjer enligt protokollkod 20200371-01H.
1. Produktion och utvärdering av bioreportören för HiBiT-RBD
<ol><li>Producera en tillräcklig mängd HibT-RBD bioreporter<ol>
<li>Förbered dig för cellkultur<ol>
<li>Förbered komplett Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) som innehåller 10% fetala nötkreatur serum och 1% penicillin/streptomycin. Värm sedan media i ett vattenbad på 37 °C.</li>
			<li>Slå på det biologiska sä...

<ol>
	<li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+coronavirus+2019+(COVID-19)+pandemic+outbreak:+A+comprehensive+review+of+the+current+literature.">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li><li>Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: <a target="_blank" href="https://www.worldometers.info/coronavirus/">https://www.worldometers.info/coronavirus/</a> (2021)</li><li>Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+wave+COVID-19+pandemics+in+Europe:+a+temporal+playbook.">Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).</li><li>COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines">https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines</a> (2021)</li><li>Hueston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+response+to+SARS-CoV-2+infection.">The antibody response to SARS-CoV-2 infection.</a> Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).</li><li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor.">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology.">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li><li>Premkumar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor-binding+domain+of+the+viral+spike+protein+is+an+immunodominant+and+highly+specific+target+of+antibodies+in+SARS-CoV-2+patients.">The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients.</a> Science Immunology. 5 (48), (2020).</li><li>Walls, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elicitation+of+potent+neutralizing+antibody+responses+by+designed+protein+nanoparticle+vaccines+for+SARS-CoV-2.">Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2.</a> Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).</li><li>Azad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+reveals+the+importance+of+N-+linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Mol Ther. , 0074-0075 (2021).</li><li>Bastos, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19:+systematic+review+and+meta-analysis.">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516 (2020).</li><li>Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa">https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa</a> (2021)</li><li>Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+bioluminescent+systems.">A brief review of bioluminescent systems.</a> Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion.">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening.">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP/TAZ-TEAD+biosensors.">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596 (2019).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis.">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li><li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide.">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion.">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).</li></ol>

Det ökande antalet personer som smittats med SARS-CoV-2 och den pågående ansträngningen för global vaccination kräver känsliga och snabba serologiska tester som kan användas i storskaliga serosurveys. Ny forskning visar att split nanoluciferase-baserade biorapporter kan användas för att utveckla sådana analyser. Vi utvecklade nyligen HiBiT-RBD bioreporter för att utforma ett test som kan användas för att upptäcka SARS-CoV-2-specifika antikroppar i patientserum på ett snabbt och tillförlitligt sätt (<str...

Den senaste tidens uppkomst av ett nytt coronavirus, SARS-CoV21, har orsakat mer än 2 800 000 dödsfall och 128 miljoner infektioner per den 30 mars 20212. På grund av bristen på ett tillförlitligt och väletablerat behandlingsförfarande för sars-cov-2 kliniska terapier, många ansträngningar har gjorts för att begränsa ytterligare viral överföring och ännu viktigare, att utveckla en effektiv och robust behandling eller ett vaccin3. Hittills finns det mer än 50 COVID-19 vaccinkandidater i prövningar som rapporterats av Världshälsoorganisationen4. Påvisande av antikroppar mot SARS-CoV-2 är av största vikt för att fastställa den långsiktiga stabiliteten i humoral respons vid administrering av vaccinet samt hos tillfrisknade patienter med covid-195. Vissa studier har visat att det finns en möjlighet att tillfrisknade SARS- CoV-2-patienter förlorar de flesta av de RBD-bindande antikropparna efter 1 år5,6,7,8,9. Ytterligare undersökningar krävs för att bättre förstå varaktig immunitet, och känsligare antikroppsdetekteringsplattformar kan bidra till att främja sådant arbete. Rapporter om ihållande immunitet av milda SARS-CoV-2 infektioner, som tyder på långsiktiga antikroppssvar, är också ett intressant och värdefullt studieområde. En snabb och exakt detektionsmetod är avgörande för övervakning av antikroppar i individers serum för att ge mer information om immunitet i befolkningen.
Liksom andra coronavirus använder SARS-CoV-2 utskjutande spikglykoprotein för att binda till angiotensinkonverterande enzym-2 (ACE2) för att initiera en kaskad av händelser som leder till fusion av virus- och cellmembranen6,7. Flera studier har nyligen visat att SPIKE-proteinets RBD har en avgörande roll för att framkalla kraftfullt och specifikt antikroppssvar mot SARS-CoV28,9,10,11. I synnerhet överensstämmer korrelationer som observerats av Premkumar et al. mellan titer av RBD-bindande antikropp och SARS-CoV-2 neutraliseringsstyrka hos patienternas plasma med RBD som ett immunogent fack i virusstrukturen9. Med detta i åtanke är många diagnostiska tester tillgängliga för sars-cov-2 antikroppsdetektering tids- och kostnadsintensiva, kräver ett långt förfarande för inkubation och tvätt (enzymlänkad immunosorbentanalys [ELISA]), eller saknar känslighet och noggrannhet (lateralt flöde immunoassay [LFIA])12. Därför skulle en kvantitativ och snabb kompletterande serologisk metod för covid-19-härledd antikroppsdetektering med hög känslighet, snabb respons och relativt låg kostnad tjäna behovet av ett tillförlitligt serologiskt test för sars-cov-2 epidemiologisk övervakning.
Sammantaget föranledde begränsningarna i nuvarande serologiska analyser undersökningen av det bioluminescerande rapporteringssystemet som ett potentiellt diagnostiskt medel i framtida serosurveys. Bioluminescens är en naturligt förekommande enzym-/substratreaktion, med ljusemission. Nanoluc luciferas är det minsta (19 kDa), men ändå det ljusaste systemet jämfört med Renilla och firefly luciferas (36 kDa respektive 61 kDa)13,14. Dessutom har Nanoluc det högsta signal-till-brusförhållandet och stabiliteten bland de tidigare nämnda systemen. Nanolucs höga signalintensitet stöder upptäckten av även mycket låga mängder reporterfusioner15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) är en delad version av Nanoluc-systemet, som består av två segment: små BiT (11 aminosyror; SmBiT) och stor BiT (LgBiT) med relativt låg affinitet interaktioner (KD = 190 μM ) för att bilda ett självlysande komplex16. NanoBiT används i stor utsträckning i olika studier som involverar identifiering av protein-proteininteraktioner15,17,18,19 och cellulära signalvägar11,20,21.
Nyligen introducerades en annan liten peptid med en tydligt högre affinitet till LgBiT (KD = 0,7 nM ), nämligen HiBiT Nano-Glo-systemet, i stället för SmBiT. Nano-Glos analys av nano-glo "add-mix-read" gör HiBiT till en lämplig, kvantitativ, självlysande peptidtagg. I detta tillvägagångssätt läggs HiBiT-taggen till målproteinet genom att utveckla en konstruktion som medför minimal strukturell interferens. HibT-proteinfusion skulle aktivt binda till LgBiT-motsvarigheten och producera ett mycket aktivt luciferasenzym för att generera detekterbar bioluminescens i närvaro av detektionsreagenser (figur 1). På samma sätt utvecklade vi ett HiBiT Nano-Glo-baserat system för att enkelt mäta den neutraliserande antikroppstiter i serumet hos SARS-CoV-2 återvunna individer och utvecklade nyligen en HiBiT-märkt SARS-CoV-2 RBD. Detta dokument beskriver protokollet för att producera HiBiT-RBD bioreporter med hjälp av vanliga laboratorieprocedurer och utrustning, och visar hur denna bioreporter kan användas i en snabb och effektiv analys för att upptäcka SARS-CoV-2 RBD-mål antikroppar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Passive Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E194A</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>171020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td>100 mL kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT-RBD Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt
				gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata
				gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg
				aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta
				agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa
				ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg
				cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc
				gttgacattgattattgactagttattaatagt
				aatcaattacggggtcattagttcatagcccat
				atatggagttccgcgttacataacttacggtaa
				atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc
				ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc
				atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc
				aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact
				tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta
				cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg
				cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat
				gggactttcctacttggcagtacatctacgtat
				tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt
				ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg
				actcacggggatttccaagtctccaccccattg
				acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc
				aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg
				ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta
				cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg
				ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg
				aaattaatacgactcactatagggagacccaa
				gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga
				gctcggatccgccaccATGGAGACAGA
				CACACTCCTGCTATGGGTACTGC
				TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC
				TGGTGACtctggctctagcggctctggctct
				agcggcggcATGGTGAGCGGCTG
				GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC
				tctagcggcGACTACAAGGACC
				ACGACGGTGACTACAAGGACCA
				CGACATCGACTACAAGGACGAC
				GACGACAAGggcagcggctccggca
				gcagcggaggaggaggctctggaggagga
				ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg
				cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat
				ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga
				atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct
				gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt
				gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac
				ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt
				gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc
				acctggacagacaggcaagatcgccgactac
				aactataagctgccagacgatttcaccggct
				gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt
				ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac
				cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt
				tgagcgggatatcagcacagagatctaccag
				gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg
				gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc
				ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca
				tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg
				cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc
				gagggccgccacatgctggagatgggccatc
				atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag
				cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac
				ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt
				gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg
				ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac
				tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat
				cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg
				ggtggggtggggcaggacagcaaggggga
				ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg
				gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa
				agaaccagctggggctctagggggtatcccca
				cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg
				ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
				acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg
				ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt
				tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta
				gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc
				ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta
				gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc
				ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg
				gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc
				ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt
				gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg
				atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt
				ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc
				caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag
				catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg
				aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt
				atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac
				catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc
				ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc
				ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc
				cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa
				gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg
				caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc
				ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt
				cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg
				ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc
				tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct
				gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg
				cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg
				tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg
				cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct
				tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg
				ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc
				ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg
				ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg
				cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc
				ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg
				agcgagcacgtactcggatggaagccggtct
				tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat
				caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca
				ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg
				atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg
				ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt
				ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt
				ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct
				acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg
				aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg
				tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc
				ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg
				ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag
				cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat
				tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt
				cggaatcgttttccgggacgccggctggatga
				tcctccagcgcggggatctcatgctggagt
				tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta
				taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa
				atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt
				ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat
				cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct
				agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc
				ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac
				aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag
				cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat
				taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
				gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa
				tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg
				tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc
				gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt
				atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc
				cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa
				catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag
				gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt
				tccataggctccgcccccctgacgagcatcac
				aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa
				acccgacaggactataaagataccaggcgtt
				tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt
				ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc
				tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat
				agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag
				gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa
				ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc
				ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag
				acacgacttatcgccactggcagcagccactg
				gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc
				ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact
				acggctacactagaagaacagtatttggtatc
				tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa
				aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa
				ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca
				agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat
				ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt
				ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa
				gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct
				tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt
				ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
				ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg
				cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca
				tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac
				gatacgggagggcttaccatctggccccagtg
				ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc
				ggctccagatttatcagcaataaaccagccag
				ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg
				caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt
				gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt
				aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag
				gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg
				cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc
				gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag
				cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca
				gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
				tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg
				ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta
				ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg
				gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg
				ggataataccgcgccacatagcagaactttaa
				aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc
				gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat
				ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact
				gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc
				tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc
				cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga
				aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat
				attattgaagcatttatcagggttattgtc
				tcatgagcggatacatatttgaatgtattt
				agaaaaataaacaaataggggttccgcgca
				catttccccgaaaagtgccacctgacgtc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein G Magnetic Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Mx Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>96-well plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2520056</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter

Uppkomsten av COVID-19-pandemin har ökat behovet av bättre serologiska detektionsmetoder för att fastställa den epidemiologiska effekten av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Det ökande antalet SARS-CoV-2 infektioner ökar behovet av bättre antikroppsdetekteringsanalyser. Nuvarande antikroppsdetekteringsmetoder äventyrar känsligheten för hastighet eller är känsliga men tidskrävande. En stor andel sars-cov-2-neutraliserande antikroppar riktar sig mot det receptorbindande området (RBD), ett av de primära immunogena facken i SARS-CoV-2. Vi har nyligen designat och utvecklat en mycket känslig, bioluminescerande taggad RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) för att upptäcka SARS-CoV-2-antikroppar. I följande text beskrivs proceduren för att producera HiBiT-RBD-komplexet och en snabb analys för att utvärdera förekomsten av RBD-inriktade antikroppar med det här verktyget. På grund av hållbarheten hos HiBiT-RBD-proteinprodukten över ett brett spektrum av temperaturer och det kortare experimentella förfarandet som kan slutföras inom 1 h, kan protokollet betraktas som ett effektivare alternativ för att upptäcka SARS-CoV-2-antikroppar i patientserumprover.

Signalerna från både HiBit-RBD-innehållande cell lysate och supernatant av de transfected cellerna registrerades (figur 2) för att utvärdera lämplig proteinkälla. HiBiT-RBD och LgBit användes separat som kontroller, och data visade låg bakgrund jämfört med en stark signal när båda delarna kombinerades. Därför är HiBiT-RBD-interaktion med LgBiT nödvändig för att generera aktivt enzym för substratrötning och bioluminescensaktivitet (figur 1).<...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Det skisserade protokollet beskriver förfarandet för att producera HiBiT-receptor-bindande domänproteinkomplexet och dess tillämpning för snabb och känslig detektion av SARS-CoV-2 antikroppar.

Detektion av SARS-CoV-2 receptorbindande domänantikropp med hjälp av en Hibit-baserad bioreportör

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Mitt labb har arbetat med COVID-19-forskning, och vi har nyligen utvecklat en ny analys som gjorde det möjligt för oss att snabbt och exakt upptäcka SARS-CoV-2-antikroppar. Detta protokoll beskriver en hög genomströmningsanalys för att upptäcka anti-SARS-CoV-2 antikroppar i patientens serum prover, vilket är kritiskt med tanke på den nuvarande pandemin. Majoriteten av nuvarande serologiska analyser offrar hastighet för känslighet eller vice versa.Våra data visar att vår analys är både känslig och har en snabb svarstid. För att producera en tillräcklig mängd hög HiBiT-RBD bioreporter, börja med att förbereda sig för cellkultur. Förbered först komplett Dulbeccos modifierade örnmedium som innehåller 10% fetala nötkreatur serum och 1%penicillin och streptomycin.Värm sedan media i ett 37 grader Celsius vattenbad. Slå på det biologiska säkerhetsskåpet och använd 70% etanol för sterilisering av skåpytan. För att odla cellinjen, ta ut den från minus 80 grader Celsius eller flytande kväve och tina den i ett 37 grader Celsius vattenbad.Blanda de tinade cellerna med minst 10 ml komplett medium. Pipettera cellupphängningen i en 15 centimeter Petriskål och snurra plattan för att fördela cellerna jämnt. Placera skålen i en cellodlingsinkubator vid 37 grader Celsius, 5% koldioxid och 85 till 95% luftfuktighet.Observera cellerna under mikroskopet tills sammanflödet når 80 till 90%Vid hög sammanflöde, ta bort mediet, tvätta cellerna med varm PBS och tillsätt tre till fem milliliter 0,25% trypsin-EDTA för att lossa cellerna från ytan. Efter ungefär fem minuter, titta på cellerna under ett mikroskop. Om alla celler flyter, tillsätt minst fyra milliliter medium och överför cellupphängningen till ett nytt sterilt rör.Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och tillsätt en miljon celler i varje brunn på en sex-brunnsplatta för transfektering. För att utföra transfektion av HiBiT-RBD-plasmiden, använd ett mikrogram av HiBiT-RBD-uttrycksplasmiden med ett lämpligt transfekteringsreagens. Inkubera i 10 till 15 minuter vid rumstemperatur och tillsätt sedan den totala volymen till varje brunn på plattan droppvis.På nästa dag, byt ut mediet som innehåller transfektblandningen med komplett medium. Observera transfekteringskontrollen väl 48 timmar efter transfektion. Samla supernatanten i 1,5 milliliter mikrorör.Tillsätt 500 mikroliter 1X passiv lysbuffert eller PLB till cellerna, inkubera och skaka sedan plattan i 15 minuter vid rumstemperatur för celllys. Därefter, för att utvärdera luminiscenssignalen från biorapporteraren med hjälp av en luciferasanalys, förbered först reaktionskomponenterna och använd supernatanten som källa till biorapporteringen. Späd den stora BiT och substratet till 1X före användning.Överför 50 mikroliter av supernatanten från varje brunn eller rör till en 96-brunnsplatta och tillsätt 50 mikroliter 1X stor BiT till varje brunn. Inkubera i fem minuter vid rumstemperatur. Öppna luminometerprogramvaran, tillsätt 50 mikroliter 1X substrat till varje brunn, placera plattan i luminometern och kör programvaran.För att utföra HibT-RBD antikroppsdetekteringsanalys, förbered HiBiT-RBD bioreporter som tidigare beskrivits och kombinera 50 mikroliter av HiBiT-RBD som innehåller supernatant med ett mikrogram av den kommersiella SARS-CoV-2 RBD-antikroppen i ett 1,5 milliliter mikrorör. Tillsätt 20 mikroliter immunglobulinbindande protein eller protein G till lösningen. Öka den totala volymen till 300 mikroliter genom att lägga till PBS.Inkubera rören på en rörskakapparat eller rotator i 30 minuter. Centrifugera vid 12 000 G i 30 sekunder. Kassera sedan supernatanten och tvätta med PBS.Upprepa processen tre gånger för att ta bort gratis HiBiT-RBD. Återanvänd cellerna i 50 mikroliter PBS och överför dem till en 96-välplatta. Tillsätt 50 mikroliter av 1X stor BiT och vänta i fem minuter.Tillsätt sedan 50 mikroliter 1X NanoLuc-substrat. Läs omedelbart av luminiscenssignalen med en luminometer. Förbered större mängder av HiBiT-RBD bioreporter för en hög genomströmningsanalys och kombinera 20 mikroliter magnetiskt protein G med 50 mikroliter av HiBiT-RBD-supernatanten i varje brunn på en 96-välplatta för varje prov.Tillsätt 10 mikroliter av serumprovet till varje brunn och för den totala volymen till 150 mikroliter genom att tillsätta PBS. Inkubera i 30 minuter på en shaker vid rumstemperatur. Placera sedan plattan på en magnetisk bricka för att fälla ut protein G-antikroppskomplexet.Kassera lösningen i mitten av varje brunn och tillsätt PBS för tvätt. Upprepa tvättsteget minst tre gånger för att ta bort överflödigt HiBiT-RBD. Tillsätt 50 mikroliter 1X PBS och 50 mikroliter med 1X stor BiT och inkubera i minst fem minuter vid rumstemperatur.Förbered luminometerprogramvaran. Tillsätt sedan 50 mikroliter 1X substrat. Placera plattan i maskinen, kör programvara och registrera signalerna.Jämför signalerna från serumprover, kontrollprover och bakgrundssignal från tomma brunnar. Signalerna från både HiBiT-RBD som innehåller cell lysate och supernatant av de transfected cellerna registrerades för att utvärdera lämplig proteinkälla. Datan visade låg bakgrund jämfört med en stark signal när båda delarna kombinerades.Tillsatsen av Protein G hjälper antikroppsutfällning. Analysen användes för att jämföra signalen från en kommersiell SARS-CoV-2 neutraliserande antikropp med en kontroll IgG. Den specifika antikroppssignalen var robust, medan kontrollantikroppen hade nära den självlysande bakgrundsnivån.Rekombinant försvagade oncolytic vesicular stomatitis virus eller VSV med en mutation vid position 51 av M proteinet uttrycker exogena RBD användes för att vaccinera möss. Serumet som samlats in från vaccinerade möss gav en robust signal jämfört med ingen signal hos möss som injicerats med kontroll VSV. Detta protokoll kan användas för påvisande av SARS-CoV-2 antikroppar i patientens serumprover.Tvättstegen efter inkubation med protein G är avgörande för att minska bakgrunden. Dessutom är det viktigt att tillsätta substratet så snabbt som möjligt för att undvika signalförlust. Med några ytterligare optimeringssteg kan samma analys användas för att analysera blodprover och kan vara en effektiv metod för att bestämma anti-SARS-CoV-2-antikroppar i patientens blodprover.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering av SARS-CoV-2 med immun RNA-fluorescens i Situ hybridisering

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Påvisande av SARS-CoV-2 neutraliserande antikroppar med hjälp av fluorescerande avbildning med hög genomströmning av pseudovirusinfektion

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

En snabb, Multiplex Dual Reporter IgG och IgM SARS-CoV-2 neutraliseringsanalys för ett multiplexerat pärlbaserat flödesanalyssystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Levande avbildning och kvantifiering av virusinfektion i K18 hACE2 transgena möss med reporteruttryckande rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Effektiv SARS-CoV-2 Kvantitativ omvänd transkriptas PCR Saliva Diagnostisk strategi med hjälp av öppen källkod pipettering robotar

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

Samtidig påvising av olika antikroppsklasser i ett multiplexerat serologiskt test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Pseudotypade virus som ett molekylärt verktyg för att övervaka humana immunsvar mot SARS-CoV-2 via neutralisationsanalys

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Smartphone-Integrated Dengue NS1 Paper-Based Diagnostic Device

Portable Paper-Based Immunoassay Combined with Smartphone Application for Colorimetric and Quantitative Detection of Dengue NS1 Antigen

Author Spotlight: Development of a Smartphone-Enhanced Paper-Based Device for Rapid Dengue NS1 Detection

Bärbar pappersbaserad immunanalys i kombination med smartphone-applikation för kolorimetrisk och kvantitativ detektion av dengue NS1-antigen

Dengue virus (DENV) infection, which is transmitted by Aedes mosquitoes, is a major public health concern in tropical and subtropical countries. With an ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

Påvisande av rabies-, IgG- och IgM-antikroppar med hjälp av det indirekta fluorescerande rabiesantikroppstestet

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...