Name: detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin ve Christiano Tanese De Souza'nın teknik yardımlarını takdir ve teşekkür ederiz. Mina Ghahremani'ye grafik tasarım için de teşekkür ederiz. Bu çalışma için katılan ve kan örneklerini bağışlayan tüm bireylere de teşekkür ederiz. DWC kısmen uOttawa Fakültesi ve Tıp Bölümü tarafından desteklenmektedir.

NOT: Aşağıda açıklanan protokol, 20200371-01H protokol koduna göre tüm etik kurallara uyar.
1. HiBiT-RBD biyo-raporlayıcının üretimi ve değerlendirilmesi
<ol><li>Yeterli miktarda HiBiT-RBD biyoreporter üretmek<ol>
<li>Hücre kültürüne hazırlanın<ol>
<li>%10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin/streptomisin içeren tam Dulbecco modifiye Eagle ortasını (DMEM) hazırlayın. Ardından, medyayı 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.</li>
			<li>Biyolojik güvenlik kabinini ...

<ol>
	<li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+coronavirus+2019+(COVID-19)+pandemic+outbreak:+A+comprehensive+review+of+the+current+literature.">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li><li>Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: <a target="_blank" href="https://www.worldometers.info/coronavirus/">https://www.worldometers.info/coronavirus/</a> (2021)</li><li>Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+wave+COVID-19+pandemics+in+Europe:+a+temporal+playbook.">Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).</li><li>COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines">https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines</a> (2021)</li><li>Hueston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibody+response+to+SARS-CoV-2+infection.">The antibody response to SARS-CoV-2 infection.</a> Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).</li><li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor.">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology.">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li><li>Premkumar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor-binding+domain+of+the+viral+spike+protein+is+an+immunodominant+and+highly+specific+target+of+antibodies+in+SARS-CoV-2+patients.">The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients.</a> Science Immunology. 5 (48), (2020).</li><li>Walls, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elicitation+of+potent+neutralizing+antibody+responses+by+designed+protein+nanoparticle+vaccines+for+SARS-CoV-2.">Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2.</a> Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).</li><li>Azad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+reveals+the+importance+of+N-+linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Mol Ther. , 0074-0075 (2021).</li><li>Bastos, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19:+systematic+review+and+meta-analysis.">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516 (2020).</li><li>Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa">https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa</a> (2021)</li><li>Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+bioluminescent+systems.">A brief review of bioluminescent systems.</a> Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion.">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening.">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).</li><li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP/TAZ-TEAD+biosensors.">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596 (2019).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis.">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li><li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide.">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion.">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).</li></ol>

SARS-CoV-2 ile enfekte olan insan sayısının artması ve küresel aşılama için devam eden çaba, büyük ölçekli serosurveylerde kullanılabilecek hassas ve hızlı serolojik testler gerektirmektedir. Son araştırmalar, bölünmüş nanoluseferaz bazlı biyo-raporlayıcıların bu tür tahlilleri geliştirmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Yakın zamanda hasta serumunda SARS-CoV-2'ye özgü antikorları hızlı ve güvenilir bir şekilde tespit etmek için kullanılabilecek bir test tasarlamak için...

Sars-CoV21 adlı yeni bir koronavirüsün ortaya çıkışı, 30 Mart 20212 itibarıyla 2 milyon 800 binden fazla can kaybına ve 128 milyon enfeksiyona neden oldu. SARS-CoV-2 klinik tedavileri için güvenilir ve köklü bir tedavi prosedürünün olmaması nedeniyle, daha fazla viral bulaşmayı kısıtlamak ve daha da önemlisi etkili ve sağlam bir tedavi veya aşı geliştirmek için birçok çaba yapılmıştır3. Bugüne kadar, Dünya Sağlık Örgütü tarafından bildirilen çalışmalarda 50'den fazla COVID-19 aşı adayı var4. SARS-CoV-2'ye karşı antikorların tespiti, aşının ve COVID-195'in iyileşmiş hastalarında, humoral yanıtın uzun vadeli stabilitesini belirlemek için son derece önemlidir. Bazı çalışmalar, iyileşen SARS-CoV-2 hastalarının 1 yıl sonra RBD bağlayıcı antikorların çoğunu kaybetme olasılığının olduğunu göstermiştir5,6,7,8,9. Kalıcı bağışıklığı daha iyi anlamak için daha fazla araştırma yapılması gerekir ve daha hassas antikor tespit platformları bu tür çalışmaların daha fazla yapılmasına yardımcı olabilir. Uzun süreli antikor yanıtları öneren hafif SARS-CoV-2 enfeksiyonlarının sürekli bağışıklığı raporları da ilginç ve değerli bir çalışma alanıdır. Popülasyondaki bağışıklık hakkında daha fazla bilgi sağlamak için bireylerin serasındaki antikorların izlenmesi için hızlı ve doğru bir tespit yöntemi gereklidir.
Diğer koronavirüsler gibi SARS-CoV-2 de viral ve hücre zarlarının füzyonuna yol açan olayların bir basamaklarını başlatmak için anjiyotensin dönüştürücü enzim-2'ye (ACE2) bağlanmak için çıkıntılı başak glikoproteini kullanır6,7. Son zamanlarda yapılan çeşitli çalışmalar, Spike proteininin RBD'sinin SARS-CoV28,9,10,11'e karşı güçlü ve spesifik antikor yanıtının ortaya çıkarırken çok önemli bir role sahip olduğunu kanıtlamaktadır. Özellikle, Premkumar ve ark. tarafından RBD bağlayıcı antikor titresi ile hastaların plazmasının SARS-CoV-2 nötralizasyon gücü arasında gözlenen korelasyonlar, RBD'nin virüs yapısının immünojenik bir bölmesi olmasıyla tutarlıdır9. Bunu göz önünde bulundurarak, SARS-CoV-2 antikor tespiti için mevcut birçok tanı testi zaman ve maliyet yoğundur, uzun bir kuluçka ve yıkama prosedürü gerektirir (enzime bağlı immünosorbent testi [ELISA]) veya hassasiyet ve doğruluktan yoksundur (lateral akış immünoassay [LFIA])12. Bu nedenle, YÜKSEK hassasiyet, hızlı yanıt ve nispeten düşük maliyetli COVID-19 türevi antikor tespitinin nicel ve hızlı bir tamamlayıcı serolojik yöntemi, SARS-CoV-2 epidemiyolojik gözetimi için güvenilir bir serolojik test ihtiyacına hizmet edecektir.
Toplu olarak, mevcut serolojik tahlillerin sınırlamaları, biyolüminesan raporlama sisteminin gelecekteki serosurveylerde potansiyel bir tanı ajanı olarak araştırılmasına neden oldu. Biyolüminesans, ışık emisyonu ile doğal olarak oluşan bir enzim / substrat reaksiyonudur. Nanoluc luciferaz en küçük (19 kDa), ancak Renilla ve firefly luciferase (sırasıyla 36 kDa ve 61 kDa) ile karşılaştırıldığında en parlak sistemdir 13,14. Ayrıca, Nanoluc daha önce bahsedilen sistemler arasında gürültü oranına ve stabilitesine en yüksek sinyale sahiptir. Nanoluc'un yüksek sinyal yoğunluğu, çok düşük miktarlarda muhabir füzyonlarının bile algılanmasını destekler15. Nanoluc İkili Teknolojisi (NanoBiT), nanoluc sisteminin iki segmenti olan bölünmüş bir versiyonudur: küçük BiT (11 amino asit; SmBiT) ve nispeten düşük benzeşimli etkileşimlere sahip büyük BiT (LgBiT) (KD = 190 μM) bir lüminesan kompleksi oluşturmak için16. NanoBiT, protein-protein etkileşimlerinin tanımlanmasını içeren çeşitli çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır15,17,18,19 ve hücresel sinyal yolları11,20,21.
Son zamanlarda, LGBiT'ye belirgin şekilde daha yüksek bir benzeğe sahip başka bir küçük peptit (KD = 0.7 nM), yani SmBiT yerine HiBiT Nano-Glo sistemi tanıtıldı. Nano-Glo "ekle-karıştır-oku" testinin yüksek benzeşimi ve güçlü sinyali, HiBiT'i uygun, nicel, parlak bir peptit etiketi yapar. Bu yaklaşımda, HiBiT etiketi minimum yapısal parazit uygulayan bir yapı geliştirilerek hedef proteine eklenir. HiBiT-protein füzyonu aktif olarak LgBiT muadili'ne bağlanacak ve algılama reaktiflerinin varlığında tespit edilebilir biyolüminesans üretmek için son derece aktif bir luciferaz enzimi üretecektir (Şekil 1). Benzer şekilde, SARS-CoV-2'nin kurtardığı bireylerin serasında nötralize edici antikor titresini kolayca ölçmek için HiBiT Nano-Glo tabanlı bir sistem geliştirdik ve yakın zamanda HiBiT etiketli bir SARS-CoV-2 RBD geliştirdik. Bu makalede, standart laboratuvar prosedürleri ve ekipmanları kullanılarak HiBiT-RBD biyoreporterinin üretilmesine ilişkin protokol açıklanmaktadır ve bu biyoreporterin SARS-CoV-2 RBD hedefleme antikorlarını tespit etmek için hızlı ve verimli bir testte nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Passive Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E194A</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Handheld Magnetic Washer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>171020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td>100 mL kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT-RBD Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt
				gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata
				gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg
				aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta
				agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa
				ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg
				cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc
				gttgacattgattattgactagttattaatagt
				aatcaattacggggtcattagttcatagcccat
				atatggagttccgcgttacataacttacggtaa
				atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc
				ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc
				atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc
				aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact
				tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta
				cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg
				cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat
				gggactttcctacttggcagtacatctacgtat
				tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt
				ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg
				actcacggggatttccaagtctccaccccattg
				acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc
				aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg
				ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta
				cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg
				ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg
				aaattaatacgactcactatagggagacccaa
				gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga
				gctcggatccgccaccATGGAGACAGA
				CACACTCCTGCTATGGGTACTGC
				TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC
				TGGTGACtctggctctagcggctctggctct
				agcggcggcATGGTGAGCGGCTG
				GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC
				tctagcggcGACTACAAGGACC
				ACGACGGTGACTACAAGGACCA
				CGACATCGACTACAAGGACGAC
				GACGACAAGggcagcggctccggca
				gcagcggaggaggaggctctggaggagga
				ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg
				cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat
				ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga
				atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct
				gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt
				gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac
				ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt
				gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc
				acctggacagacaggcaagatcgccgactac
				aactataagctgccagacgatttcaccggct
				gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt
				ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac
				cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt
				tgagcgggatatcagcacagagatctaccag
				gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg
				gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc
				ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca
				tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg
				cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc
				gagggccgccacatgctggagatgggccatc
				atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag
				cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac
				ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt
				gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg
				ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac
				tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat
				cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg
				ggtggggtggggcaggacagcaaggggga
				ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg
				gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa
				agaaccagctggggctctagggggtatcccca
				cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg
				ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
				acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg
				ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt
				tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta
				gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc
				ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta
				gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc
				ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg
				gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc
				ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt
				gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg
				atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt
				ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc
				caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag
				catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg
				aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt
				atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac
				catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc
				ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc
				ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc
				cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa
				gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg
				caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc
				ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt
				cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg
				ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc
				tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct
				gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg
				cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg
				tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg
				cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct
				tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg
				ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc
				ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg
				ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg
				cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc
				ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg
				agcgagcacgtactcggatggaagccggtct
				tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat
				caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca
				ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg
				atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg
				ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt
				ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt
				ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct
				acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg
				aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg
				tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc
				ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg
				ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag
				cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat
				tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt
				cggaatcgttttccgggacgccggctggatga
				tcctccagcgcggggatctcatgctggagt
				tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta
				taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa
				atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt
				ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat
				cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct
				agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc
				ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac
				aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag
				cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat
				taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
				gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa
				tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg
				tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc
				gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt
				atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc
				cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa
				catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag
				gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt
				tccataggctccgcccccctgacgagcatcac
				aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa
				acccgacaggactataaagataccaggcgtt
				tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt
				ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc
				tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat
				agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag
				gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa
				ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc
				ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag
				acacgacttatcgccactggcagcagccactg
				gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc
				ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact
				acggctacactagaagaacagtatttggtatc
				tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa
				aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa
				ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca
				agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat
				ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt
				ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa
				gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct
				tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt
				ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
				ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg
				cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca
				tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac
				gatacgggagggcttaccatctggccccagtg
				ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc
				ggctccagatttatcagcaataaaccagccag
				ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg
				caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt
				gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt
				aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag
				gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg
				cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc
				gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag
				cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca
				gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
				tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg
				ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta
				ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg
				gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg
				ggataataccgcgccacatagcagaactttaa
				aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc
				gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat
				ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact
				gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc
				tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc
				cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga
				aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat
				attattgaagcatttatcagggttattgtc
				tcatgagcggatacatatttgaatgtattt
				agaaaaataaacaaataggggttccgcgca
				catttccccgaaaagtgccacctgacgtc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein G Magnetic Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Mx Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>96-well plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2520056</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 receptor-binding domain antibody using a hibit-based bioreporter

COVID-19 pandemisinin ortaya çıkması, şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2'nin (SARS-CoV-2) epidemiyolojik etkisini belirlemek için daha iyi serolojik tespit yöntemlerine olan ihtiyacı artırmıştır. SARS-CoV-2 enfeksiyonlarının sayısının artması, daha iyi antikor tespiti testlerine olan ihtiyacı artırmaktadır. Mevcut antikor algılama yöntemleri hız için hassasiyeti tehlikeye atmaktadır veya hassastır ancak zaman alıcıdır. SARS-CoV-2 nötralize edici antikorların büyük bir kısmı SARS-CoV-2'nin birincil immünojenik bölmelerinden biri olan reseptör bağlayıcı etki alanını (RBD) hedef alıyor. Sars-CoV-2 antikorlarını tespit etmek için son derece hassas, biyolüminesan etiketli bir RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) tasarladık ve geliştirdik. Aşağıdaki metinde HiBiT-RBD kompleksini üretme prosedürü ve bu aracı kullanarak RBD hedefleme antikorlarının varlığını değerlendirmek için hızlı bir test açıklanmaktadır. HiBiT-RBD protein ürününün çok çeşitli sıcaklıklar üzerindeki dayanıklılığı ve 1 saat içinde tamamlanabilen daha kısa deneysel prosedür nedeniyle, protokol hasta serum örneklerinde SARS-CoV-2 antikorlarını tespit etmek için daha verimli bir alternatif olarak düşünülebilir.

Uygun protein kaynağını değerlendirmek için hem HiBit-RBD içeren hücre lysate hem de transfected hücrelerin süpernatantından gelen sinyaller kaydedildi (Şekil 2). HiBiT-RBD ve LgBit ayrı ayrı kontrol olarak kullanıldı ve veriler her iki parça birleştirildiğinde güçlü bir sinyale kıyasla düşük arka plan gösterdi. Bu nedenle, Substrat sindirimi ve biyolüminesans aktivitesi için aktif enzim üretmek için LgBiT ile HiBiT-RBD etkileşimi gereklidir (<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Özetlenen protokol, HiBiT-reseptör bağlayıcı etki alanı protein kompleksinin üretilmesi prosedürünü ve SARS-CoV-2 antikorlarının hızlı ve hassas tespiti için uygulanmasını açıklar.

HiBiT Tabanlı Bir Biyoreporter Kullanılarak SARS-CoV-2 Reseptör Bağlayıcı Etki Alanı Antikorunun Tespiti

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Laboratuvarım COVID-19 araştırmalarında çalışıyor ve yakın zamanda SARS-CoV-2 antikorlarını hızlı ve doğru bir şekilde tespit etmemizi sağlayan yeni bir test geliştirdik. Bu protokol, mevcut pandemi göz önüne alındığında kritik öneme sahip olan hasta serum örneklerinde anti-SARS-CoV-2 antikorlarının tespiti için yüksek verim testini özetlemektedir. Mevcut serolojik testlerin çoğu hassasiyet için hızı feda eder veya tam tersi.Verilerimiz, testimizin hem hassas olduğunu hem de hızlı bir yanıt süresine sahip olduğunu göstermektedir. Yeterli miktarda yüksek HiBiT-RBD biyoreporter üretmek için hücre kültürüne hazırlanarak başlayın. İlk olarak, Dulbecco'nun %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin ve streptomisin içeren modifiye kartal ortamını hazırlayın.Sonra medyayı 37 santigrat derecelik bir su banyosunda ısıtın. Biyolojik güvenlik kabinini açın ve kabin yüzeyini sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. Hücre hattını kültüre etmek için eksi 80 santigrat dereceden veya sıvı azottan çıkarıp 37 santigrat derecelik bir su banyosunda çözün.Çözülmüş hücreleri en az 10 mililitre tam orta ile karıştırın. Hücre süspansiyonunu 15 santimetrelik bir Petri kabına pipetlayın ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı döndürün. Yemeği 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %85 ila %95 nemde bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Yüksek izdiahta konfluens seviyesi % 80 ila 90'a ulaşana kadar mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin, ortamı çıkarın, hücreleri ılık PBS ile yıkayın ve hücreleri yüzeyden ayırmak için% 0.25 tripsin-EDTA'nın üç ila beş mililitresini ekleyin. Yaklaşık beş dakika sonra, mikroskop altındaki hücrelere bakın. Tüm hücreler yüzüyorsa, en az dört mililitre orta ekleyin ve hücre süspansiyonu yeni bir steril tüpe aktarın.Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve transfeksiyon için altı kuyulu bir plakanın her kuyusuna bir milyon hücre ekleyin. HiBiT-RBD plazmidinin transfeksiyonunu gerçekleştirmek için, uygun bir transfeksiyon reaktifi ile HiBiT-RBD ekspresyon plazmidinin bir mikrogramını kullanın. Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika kuluçkaya yaslayın, ardından plakanın her kuyusuna damla yönünde toplam hacmi ekleyin.Ertesi gün, transfeksiyon karışımını içeren ortamı tam ortamla değiştirin. Transfeksiyondan 48 saat sonra transfeksiyon kontrolünü iyi gözlemleyin. Süpernatant 1,5 mililitre mikrotüpte toplayın.Hücrelere 500 mikrolitre 1X pasif liziz tamponu veya PLB ekleyin, ardından hücre lizisi için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca tabağı kuluçkaya yatırın ve sallayın. Daha sonra, bir luciferaz tahlil kullanarak biyo-raporlayıcıdan gelen lüminesans sinyalini değerlendirmek için, önce reaksiyon bileşenlerini hazırlayın ve süpernatantı biyo-raporlayıcının kaynağı olarak kullanın. Kullanmadan önce büyük BiT'yi seyreltin ve 1X'e kadar substratı seyreltin.Süpernatantın 50 mikrolitresini her kuyudan veya tüpten 96 kuyulu bir tabağa aktarın ve her kuyuya 50 mikrolitre 1X büyük BiT ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yaslanın. Luminometre yazılımını açın, her kuyuya 50 mikrolitre 1X substrat ekleyin, plakayı luminometreye yerleştirin ve yazılımı çalıştırın.HiBiT-RBD antikor tespit testini gerçekleştirmek için, hibit-RBD biyoreporterini daha önce açıklandığı gibi hazırlayın ve süpernatant içeren HiBiT-RBD'nin 50 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir mikrotubeda ticari SARS-CoV-2 RBD antikorunun bir mikrogramı ile birleştirin. Çözeltiye 20 mikrolitre immünoglobulin bağlayıcı protein veya Protein G ekleyin. PBS ekleyerek toplam hacmi 300 mikrolitreye getirin.Tüpleri bir tüp çalkalayıcı veya rotator üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın. 30 saniyeliğine 12.000 G'de santrifüj. Ardından üstnatant atın ve PBS ile yıkayın.Ücretsiz HiBiT-RBD'yi kaldırmak için işlemi üç kez tekrarlayın. Hücreleri 50 mikrolitre PBS'de yeniden biriktirin ve 96 kuyu plakasına aktarın. 50 mikrolitre 1X büyük BiT ekleyin ve beş dakika bekleyin.Daha sonra 50 mikrolitre 1X NanoLuc substrat ekleyin. Luminscence sinyalini hemen bir luminometre ile okuyun. Yüksek verim tahlilleri için daha büyük miktarlarda HiBiT-RBD biyo-raporlayıcı hazırlayın ve her örnek için 96 kuyulu bir plakanın her kuyusunda 20 mikrolitre manyetik Protein G ile HiBiT-RBD süpernatantının 50 mikrolitresini birleştirin.Her kuyuya serum örneğinden 10 mikrolitre ekleyin ve PBS ekleyerek toplam hacmi 150 mikrolitreye getirin. Oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 30 dakika kuluçkaya yatır. Daha sonra protein G antikor kompleksini çökeltmek için plakayı manyetik bir yıkayıcıya yerleştirin.Çözeltiyi her kuyunun orta bölümüne atın ve yıkama için PBS ekleyin. Fazla HiBiT-RBD'yi çıkarmak için yıkama adımını en az üç kez tekrarlayın. 50 mikrolitre 1X PBS ve 50 mikrolitre 1X büyük BiT ekleyin ve oda sıcaklığında en az beş dakika kuluçkaya yatırın.Armatürer yazılımını hazırlayın. Daha sonra 50 mikrolitre 1X substrat ekleyin. Plakayı makineye yerleştirin, yazılımı çalıştırın ve sinyalleri kaydedin.Serum örneklerinden gelen sinyalleri, kontrol örneklerini ve boş kuyulardan gelen arka plan sinyallerini karşılaştırın. Hem hücre lisatını içeren HiBiT-RBD'den hem de transfected hücrelerin süpernatantından gelen sinyaller, uygun protein kaynağını değerlendirmek için kaydedildi. Veriler, her iki parça birleştirildiğinde güçlü bir sinyale kıyasla düşük arka plan gösterdi.Protein G ilavesi antikor çökeltmelerine yardımcı olur. Test, ticari bir SARS-CoV-2 nötralize edici antikorun sinyalini kontrol igg ile karşılaştırmak için kullanıldı. Spesifik antikor sinyali sağlamken, kontrol antikorları parlak arka plan seviyesine yakındı.Fareleri aşılamak için eksojen RBD'yi ifade eden M proteininin 51 pozisyonunda mutasyona sahip rekombinant zayıflatılmış onkolitik veziküler stomatit virüsü veya VSV kullanıldı. Aşılanmış farelerden toplanan serum, kontrol VSV ile enjekte edilen farelerde sinyal olmamasına kıyasla sağlam bir sinyal üretti. Bu protokol hasta serum örneklerinde SARS-CoV-2 antikorlarının tespiti için kullanılabilir.Protein G ile inkübasyonu takip eden yıkama adımları arka planı azaltmak için kritik öneme sahiptir. Buna ek olarak, sinyal kaybını önlemek için substratı mümkün olduğunca çabuk eklemek önemlidir. Birkaç ek optimizasyon adımı ile aynı test kan örneklerini analiz etmek için kullanılabilir ve hasta kan örneklerinde anti-SARS-CoV-2 antikorlarının belirlenmesinde etkili bir yöntem olabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Immuno RNA-Floresan In Situ Hibridizasyonu Kullanılarak SARS-CoV-2'nin Görselleştirilmesi

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Psödovirüs Enfeksiyonunun Yüksek Verimli Floresan Görüntülemesi Kullanılarak SARS-CoV-2 Nötralize Edici Antikorların Tespiti

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Çok Katlı Boncuk Tabanlı Akış Analiz Sistemi için Hızlı, Çok Katlı Çift Muhabir IgG ve IgM SARS-CoV-2 Nötralizasyon Tahlil

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

K18 hACE2 Transgenik Farelerde Viral Enfeksiyonun Canlı Görüntülenmesi ve Raporlayıcı İfade Eden Rekombinant SARS-CoV-2 Kullanılarak Ölçülmesi

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Açık Kaynak Pipetleme Robotlarını Kullanan Verimli SARS-CoV-2 Kantitatif Ters Transkriptaz PCR Tükürük Teşhis Stratejisi

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Serumda Borrelia-Spesifik IgG ve IgM için Multipleks İmmünoassay

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Yazar Spotlight: Lyme Borreliosis Teşhisi ve Patojen Araştırmaları için Multipleks İmmünoanalizlerin Kapsamının Genişletilmesi 

Çoğullanmış Serolojik Testte Farklı Antikor Sınıflarının Eş Zamanlı Tespiti

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

SARS-CoV-2 Varyantlarında Aşı Kaynaklı Nötralize Edici Antikorların Miktarının Belirlenmesi

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Yazar Spotlight: SARS-CoV-2 Araştırmalarında Omicron Alt Varyantlarını Değerlendirmek ve Antikorları Nötralize Etmek için Sahte Tip Bir Virüs Sistemi

SARS-CoV-2 Varyantlarının Hızlı Miktar Tayini ve Nötralize Edici Antikorlar için Ha-CoV-2 Psödovirüsünün Uygulanması

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...