Name: in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا فابيان بروامر وجان إيف رينكل وديفيد هوفمان ومونيك فرويند على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل الرابطة الأوروبية للتنمية الإقليمية والاتحاد الأوروبي من خلال الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية ومنظمة المنحة ANR-17-CE14-0001-01 إلى H.D.S.

وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمعايير الأوروبية 2010/63/EU ولجنة CREMEAS المعنية بأخلاقيات التجارب على الحيوانات التابعة لجامعة ستراسبورغ (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). يتم عرض البروتوكول تخطيطيا في الشكل 1.
1. جمع نخاع العظم والتثبيت ( <strong cla...

<ol>
	<li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey:+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation.">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li><li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+(HIV-1).">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+(DMS)+in+megakaryocytes.">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li><li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes.">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li><li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+megakaryocytes+to+platelets:+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream.">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment.">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li><li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels.">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids.">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).</li><li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand.">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li><li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+&#945;-Granules.">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet &#945;-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li><li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emperipolesis,+entosis+and+cell+cannibalism:+Demystifying+the+cloud.">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).</li><li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice.">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation.">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li></ol>

الفحص المباشر للخلايا الضخمة في بيئتها الأصلية أمر ضروري لفهم الخلايا الضخمة وتشكيل الصفائح الدموية. في هذه المخطوطة، نقدم طريقة المجهر الإلكتروني انتقال الجمع بين مسح نخاع العظم والتثبيت عن طريق الغمر، مما يسمح لتشريح في الموقع خصائص مورفولوجيا العملية برمتها من مورفوجينيسيس megakar...

Megakaryocytes هي خلايا متعددة الأضلاع كبيرة متخصصة ، مترجمة في نخاع العظام ، مسؤولة عن إنتاج الصفائح الدموية1. أنها تنشأ من الخلايا الجذعية الدموية من خلال عملية نضوج معقدة، خلالها السلائف megakaryocyte زيادة تدريجيا في الحجم، في حين تمر تغييرات مورفولوجية المصاحبة واسعة النطاق في السيتوبلازم والنواة2. أثناء النضج ، تطور الخلايا الضخمة عددا من العناصر الهيكلية المميزة بما في ذلك: نواة متعددة الأضلاع ، وثقب الغشاء السطحي الذي يشكل نظام غشاء الترسيم (DMS) ، ومنطقة محيطية خالية من العضيات محاطة بالشبكة الخلوية القائمة على actin ، والعديد من العضيات بما في ذلك حبيبات α ، والحبيبات الكثيفة ، والليسوسومات ، والعديد من مجمعات غولجي. على مستوى البنية الفائقة ، لوحظ تعديل كبير هو تقسيم السيتوبلازمية إلى مناطق منفصلة محددة بواسطة DMS3. هذا العرض الواسع من الأغشية سوف يغذي تمديد العمليات السيتوبلازمية الطويلة في المرحلة الأولية من إنتاج الصفائح الدموية ، والتي إعادة تشكيلها بعد ذلك إلى الصفائح الدموية داخل الدورة الدموية. أي عيب أثناء التمايز megakaryocyte والنضج يمكن أن تؤثر على إنتاج الصفائح الدموية من حيث عدد الصفائح الدموية و / أو وظيفة الصفائح الدموية. 
طبقة رقيقة انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) وقد تم نهج التصوير المفضل لعقود توفير ultrastructure عالية الجودة من megakaryocytes التي شكلت فهمنا لعلم وظائف الأعضاء من خثار4،5. تركز هذه الورقة على طريقة TEM موحدة تسمح بالتقاط عملية التكوين الحيوي للصفائح الدموية التي تحدث في الموقع داخل البيئة الدقيقة لنخاع العظم الأصلي ، والتي يمكن أن تكون أيضا بمثابة أساس لتحليل أي نوع من خلايا نخاع العظم. نحن نقدم أمثلة فائقة البنية لتطوير الخلايا الضخمة من غير ناضجة إلى ناضجة تماما ، والتي تمتد العمليات السيتوبلازمية في دوران الأوعية الدقيقة من الجيوبالأنفية 6. كما نقوم بوصف إجراء سهل لقياس مراحل نضوج الخلايا الضخمة المختلفة، مع إرشادك إلى قدرة إنتاج التجدد والصفائح الدموية لنخاع العظم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td>1670-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 Calcium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids 200 mesh thin-bar</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, England</td>
			<td>T200-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8.20670.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>EM-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolut</td>
			<td>VWR International, France</td>
			<td>20821296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, 90 mm diameter</td>
			<td>Whatman, England</td>
			<td>512-0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding silicone mould</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientific, England</td>
			<td>G3533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>16210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate Leica EMMP</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>705402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo Diamond Knife 45&#176;</td>
			<td>Diatome, Switzerland</td>
			<td>1044797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 2100 Plus TEM microscope</td>
			<td>JEOL, Japan</td>
			<td>EM-21001BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate - Ultrostain 2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>70 55 30 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX-112 resin</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>15320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nadic Methyl Anhydride (NMA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 2%</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>19172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide (1.2-epoxypropane)</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline injectable solution 0.9% NaCl</td>
			<td>C.D.M Lavoisier, France</td>
			<td>MA 575 420 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Surgical steel blade</td>
			<td>Swann-Morton, England</td>
			<td>.0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate - Borax</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>B-9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>84100-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td>Pall Corporation, USA</td>
			<td>514-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>N10-70975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer EM TRIM2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>702801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>656201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>23620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy

يحدث التمايز ونضوج الخلايا الضخمة في ارتباط وثيق مع المكونات الخلوية وخارج الخلية لنخاع العظام. وتتميز هذه العمليات بالمظهر التدريجي للهياكل الأساسية في السيتوبلازم megakaryocyte مثل نواة متعددة الأضلاع وتعدد الأضلاع، وشبكة غشاء داخلي تسمى نظام غشاء الترسيم (DMS) وحبيبات كثيفة وألفا التي سيتم العثور عليها في الصفائح الدموية المتداولة. في هذه المقالة، نقوم بوصف بروتوكول موحد للدراسة فوق الهيكلية في الموقع لخلايا مورين الضخمة باستخدام المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM)، مما يسمح بتحديد الخصائص الرئيسية التي تحدد مرحلة نضجها وكثافتها الخلوية في نخاع العظام. يتم مسح نخاع العظم، ثابتة، المجففة في الإيثانول، جزءا لا يتجزأ من الراتنج البلاستيك، وشنت لتوليد المقاطع العرضية. يتم إعداد أقسام شبه رقيقة ورقيقة لملاحظات الهسهولوجية وTEM، على التوالي. يمكن استخدام هذه الطريقة لأي خلية نخاع العظم، في أي مرفق EM ولها ميزة استخدام أحجام عينة صغيرة مما يسمح لمزيج من عدة نهج التصوير على نفس الماوس.

أنسجة نخاع العظم مراقبة النسيج الأزرق التولويدين نخاع العظم تحت المجهر الخفيف هو المفتاح لتحليل بسرعة بنية الأنسجة الشاملة من حيث مثل، ضغط الأنسجة، واستمرارية microvessel، وحجم وشكل megakaryocytes (الشكل 1D). يتم إجراؤه قبل أقسام فائقة لتحديد الحاجة إلى قطع أعمق في...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

هنا، نقدم بروتوكولا لتحليل البنية الفوقية للخلايا العملاقة في الموقع باستخدام المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM). يتم جمع نخاع عظم مورين، ثابتة، جزءا لا يتجزأ من راتنج الايبوكسي وقطع في أقسام ultrathin. بعد تلطيخ التباين ، لوحظ نخاع العظم تحت مجهر TEM عند 120 كيلو فولت.

في سيتو استكشاف مورين ميغاكاريوبويز باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

الهدف العام لهذا الإجراء هو مراقبة البنية الفائقة للخلايا العملاقة الموجودة داخل نخاع عظم الفأر ، وتحديد مراحل النضج المختلفة باستخدام المجهر الإلكتروني عالي الدقة. الميزة الرئيسية هي الفحص المباشر للخلايا العملاقة في البيئة الأصلية ، والتي تختلف عن الخلايا العملاقة المستزرعة في المختبر التي كما نعلم لا تصل إلى المستوى الكامل للنضج. بعد حصاد الساق وعظم الفخذ من 12 إلى 18 أسبوعا C57BL/6 الفئران وفقا للبروتوكولات القياسية، واستخدام شفرة حلاقة حادة لإزالة epiphyses من كل العظام.عقد كل العظام مع ملاقط، إدراج إبرة قياس 21 تعلق على حقنة خمسة ملليلتر مليئة العازلة cacodylate في نهاية واحدة من العظام وتدفق نخاع العظام في أنبوب جمع 15 ملليلتر تحتوي على اثنين من ملليلتر من العازلة cacodylate الطازجة. مباشرة بعد التنظيف، استخدم ماصة بلاستيكية لنقل اسطوانات نخاع العظم إلى ملليلتر واحد من محلول تثبيت الغلوتارالدهيد الطازج لاحتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لتضمين نخاع العظم في الآغروز، اغسل العينات الثابتة في المخزن المؤقت الصبار الطازج واستخدم ماصة بلاستيكية لنقل نخاع العظم بعناية إلى شريحة زجاجية.باستخدام ماصة دافئة، وتطبيق بسرعة قطرة من 2٪ أجار السائل إلى اسطوانات نخاع العظام، وعلى الفور وضع الشريحة على الجليد لمدة دقيقة إلى دقيقتين. عندما يتوطد أغار، استخدم مجهر ستيريو وشفرة حلاقة حادة لتجاهل أطراف كل أسطوانة نخاع عظمي ونقل كتل النخاع المشذبة إلى أنبوب طرد دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من العازلة الصبارية. لتضمين الراتنج، إصلاح كتل مع 1٪ osmium tetroxide في العازلة cacodylate في غطاء محرك السيارة الكيميائية لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية قبل غسل كتل مرة واحدة مع العازلة cacodylate ومرة واحدة مع الماء المقطر.بعد غسل الماء، وصمة عار الكتل مع خلات أورانيل 4٪ في الماء المقطر لمدة ساعة واحدة تليها اثنين من يغسل في الماء المقطر كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير ، يجفف الكتل من خلال سلسلة تصاعدية من غمر الإيثانول والماء المقطر على النحو المشار إليه. للحصول على تسلل موحد وبلمرة من راتنج الايبوكسي داخل النخاع، واحتضان كتل في اثنين من الحمامات المتعاقبة من أكسيد البروبيلين لمدة 15 دقيقة قبل احتضان العينات في خليط واحد إلى واحد من أكسيد البروبيلين 100٪ وراتنج الايبوكسي لمدة ساعة واحدة على شاكر دوارة بطيئة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة، أضف راتنج الايبوكسي بنسبة 100٪ إلى كتل النخاع لاحتضانه بين عشية وضحاها في نفس الظروف، ثم أضف راتنج الايبوكسي بنسبة 100٪ لاحتضان آخر لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة، استخدم المجهر لتوجيه كتل النخاع في قوالب السيليكون المسطحة للسماح بقسمها العرضي اللاحق وملء القوالب راتنج الايبوكسي قبل وضعها عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بالنسبة للقسم الرقيق جدا، قم بتركيب كتلة العينة على دعم microtome فائقة و تركيب الدعم على حامل العينة.استخدم قاطع طحن الماس لتقليم العينات بزاوية 45 درجة لإزالة الراتنج الزائد حول الأنسجة قبل استخدام شفرة سكين ماسية مجهزة بخزان مياه لقطع المقاطع العرضية السميكة 500 و 100 نانومتر للتحليل النسيجي وTEM على التوالي ، ثم استخدم حلقة لنقل الأجزاء السميكة 500 نانومتر العائمة على سطح الماء على شريحة زجاجية وإيداع 100 نانومتر سميكة أقسام على 200 شبكة رقيقة شريط شبكات النحاس مع مرشح ورقة تحتها. لتلطيخ الأزرق toluidine، بعد رسم أقسام سميكة 500 نانومتر على لوحة ساخنة 60 درجة، إضافة تصفية 1٪ toluidine الأزرق في الماء المقطر إلى أقسام لاحتضان لمدة دقيقة إلى دقيقتين. في نهاية الحضانة، اغسل العينات بالماء المقطر.عندما تكون الشرائح قد جفت، استخدم تركيب المتوسطة لتركيب العينات مع coverlip وعرض العينات عن طريق المجهر الخفيفة. لتلطيخ التباين، قم بتسمية أقسام 100 نانومتر مع خلات أورانيل 4٪ لمدة خمس دقائق تليها ثلاث يغسل لمدة خمس دقائق بالماء المقطر. بعد الغسيل الأخير، قم بتلطيخ الأقسام بسيترات الرصاص لمدة ثلاث دقائق، تليها ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في الماء المقطر كما هو موضح.بعد الغسيل الأخير، ضع الجانب السفلي من كل شبكة على اتصال بقطعة من ورق الفلتر أولا للسماح بوضع الشبكات على ورق التصفية لتجف. لفحص المقاطع بواسطة TEM ، عندما تجف الشبكات ، حدد تكبيرا منخفضا لتقييم الجودة العامة للاستعدادات. لتحديد عدد الخلايا الضخمة من كل مرحلة من مراحل النضج في كل قسم عرضي، حدد تكبيرا أعلى وحدد عدد الخلايا الضخمة للمرحلة الأولى أو الثانية أو الثالثة فقط في المربعات التي تغطيها الأنسجة بالكامل.في هذا التحليل النسيجي التمثيلي ، يمكن ملاحظة استمرارية الأوعية الدقيقة وحجم وشكل الخلايا الضخمة بوضوح. وتنقسم الخلايا العملاقة مورين إلى أربع مراحل من النضج. المرحلة الأولى من الخلايا العملاقة لها نواة كبيرة.كما أن وجود المرحلة الأولى القابلة للكشف من نظام غشاء الترسيم هو معيار رئيسي لهذه المرحلة. وفي المرحلة الثانية، يبدأ تكوين الحبيبات ويبدأ تطوير نظام غشاء الترسيم. المرحلة الثالثة megakaryocytes هي خلايا عملاقة مع أنظمة غشاء ترسيم متطورة، والأراضي السيتوبلازمية محددة بوضوح والمناطق الطرفية خالية من العضيات، والنوى الموجودة بشكل غريب الأطوار.تتميز مرحلة الخلايا النارية من نضوج الخلايا العملاقة بنوة عارية. كما هو موضح، لوحظت الخلايا الضخمة في كثير من الأحيان في اتصال مع الخلايا البطانية. في بعض الأحيان ، تشكل الخلايا الضخمة نتوءات غازية قصيرة تخترق البطانة أو أنها تمتد البروبليتات إلى التجويف الجيوب الأنفية.TEM يسمح أيضا تصور التفاصيل الهيكلية فائقة، فضلا عن وجود خلايا الدم التي اجتاحتها الخلايا الضخمة. يجب إجراء مسح نخاع العظم بعناية وفور تشريح العظام. لتحقيق أقصى قدر من سلامة الأنسجة، ويحيط النخاع مع هلام من أجار قبل الجفاف.بعد هذا الإجراء، يمكن تصوير كتل نخاع العظم في تكبيرات مختلفة أو يمكن استخدامها لتحليل المجهر الإلكتروني ثلاثي الأبعاد الآخر، مثل المجهر الإلكتروني المركز للشعاع الأيوني.

Research

JoVE Journal

Biology

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

التصوير في الموقع من الغدة الصعترية ماوس باستخدام الميكروسكوب 2 فوتون

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

نانو FEM: تعريب البروتين عن طريق الصور التي تنشط المجهر التعريب والمجهر الإلكتروني

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

جنبا إلى جنب تجميد الضغط العالي والسريع تجميد استبدال الأنسجة النباتية للنقل المجهر الإلكتروني

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

نموذج إعداد وتصوير اكسوسوميس مجهر إلكتروني

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...