Name: in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00
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作者要感谢Fabienne Proamer，Jean-Yves Rinckel，David Hoffmann，Monique Freund的技术援助。这项工作得到了ARMESA（医学和公共发展协会）、欧洲联盟通过欧洲区域发展基金（ERDF）和赠款ANR-17-CE14-0001-01向H.d.S.的支持。

所有动物实验均按照欧洲标准2010/63 / EU和斯特拉斯堡大学动物实验伦理委员会（斯特拉斯堡动物实验管理局）进行。该协议原理图如图 1所示。
1. 骨髓采集和固定（图1A）
注意：此过程包括致癌、致突变和/或有毒物质，并在化学提取罩下进行。穿戴适当的防护装备，如手套和防护眼镜。
<ol><li>在二甲丁二酸?...

<ol>
	<li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey:+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation.">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li><li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+(HIV-1).">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+(DMS)+in+megakaryocytes.">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li><li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes.">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li><li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+megakaryocytes+to+platelets:+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream.">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment.">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li><li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels.">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids.">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).</li><li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand.">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li><li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+&#945;-Granules.">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet &#945;-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li><li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emperipolesis,+entosis+and+cell+cannibalism:+Demystifying+the+cloud.">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).</li><li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice.">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation.">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li></ol>

直接检查巨核细胞在其原生环境中对于了解巨核细胞和血小板形成至关重要。在本文中，我们提供了一种透射电子显微镜方法，将骨髓冲洗和浸入固定相结合，允许 原位 解剖骨髓中巨核细胞形态发生整个过程的形态特征。
骨髓冲洗是这种方法的关键步骤，因为高质量冲洗的成功取决于操作员的实践和培训。虽然细腻，但冲洗骨髓是避免去除矿化骨的最佳方法，这通常...

巨核细胞是专门的大多倍体细胞，定位于骨髓中，负责血小板的产生1。它们起源于造血干细胞，通过复杂的成熟过程，在此期间，巨核细胞前体逐渐增加大小，同时在细胞质和细胞核2中经历广泛的伴随形态学变化。在成熟过程中，巨核细胞形成许多可区分的结构元素，包括：多叶细胞核，形成分界膜系统（DMS）的表面膜的内陷，没有细胞器的外围区域被基于肌动蛋白的细胞骨架网络包围，以及许多细胞器，包括α颗粒，致密颗粒，溶酶体和多个高尔基复合物。在超微结构水平上，观察到的主要修饰是细胞质区室化为由DMS3分隔的离散区域。这种广泛的膜供应将推动在血小板生产的初始阶段延长长细胞质过程，然后将在循环中重塑为血小板。巨核细胞分化和成熟过程中的任何缺陷都会在血小板计数和/或血小板功能方面影响血小板的产生。 
几十年来，薄层透射电子显微镜（TEM）一直是首选的成像方法，可提供高质量的巨核细胞超微结构，这些超微结构塑造了我们对血栓形成生理学的理解4，5。本文重点介绍了一种标准化的TEM方法，该方法允许捕获天然骨髓微环境中原位发生的血小板生物发生过程，这也可以作为分析任何骨髓细胞类型的基础。我们提供巨核细胞从未成熟到完全成熟的发育的超微结构示例，这些超微结构示例将细胞质过程扩展到正弦6的微循环中。我们还描述了一种量化不同巨核细胞成熟阶段的简单程序，指导骨髓的再生和血小板生产能力。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td>1670-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 Calcium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids 200 mesh thin-bar</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, England</td>
			<td>T200-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8.20670.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>EM-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolut</td>
			<td>VWR International, France</td>
			<td>20821296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, 90 mm diameter</td>
			<td>Whatman, England</td>
			<td>512-0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding silicone mould</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientific, England</td>
			<td>G3533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>16210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate Leica EMMP</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>705402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo Diamond Knife 45&#176;</td>
			<td>Diatome, Switzerland</td>
			<td>1044797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 2100 Plus TEM microscope</td>
			<td>JEOL, Japan</td>
			<td>EM-21001BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate - Ultrostain 2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>70 55 30 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX-112 resin</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>15320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nadic Methyl Anhydride (NMA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 2%</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>19172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide (1.2-epoxypropane)</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline injectable solution 0.9% NaCl</td>
			<td>C.D.M Lavoisier, France</td>
			<td>MA 575 420 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Surgical steel blade</td>
			<td>Swann-Morton, England</td>
			<td>.0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate - Borax</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>B-9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>84100-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td>Pall Corporation, USA</td>
			<td>514-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>N10-70975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer EM TRIM2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>702801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>656201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>23620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy

巨核细胞的分化和成熟与骨髓的细胞和细胞外成分密切相关。这些过程的特点是巨核细胞质中必需结构的逐渐出现，例如多倍体和多叶细胞核，称为分界膜系统（DMS）的内部膜网络以及循环血小板中将发现的致密和α颗粒。在本文中，我们描述了使用透射电子显微镜（TEM）对小鼠巨核细胞进行 原位 超微结构研究的标准化方案，从而可以识别定义其成熟阶段和骨髓中细胞密度的关键特征。骨髓被冲洗，固定，在乙醇中脱水，嵌入塑料树脂中，并安装以产生横截面。分别制备用于组织学和TEM观察的半薄片和薄切片。该方法可用于任何EM设施中的任何骨髓细胞，并且具有使用小样本量的优点，允许在同一小鼠上组合多种成像方法。

骨髓组织学 在光学显微镜下观察骨髓甲苯胺蓝组织学是快速分析整体组织结构的关键，例如组织致密性，微血管连续性以及巨核细胞的大小和形状（图1D）。在超薄切片之前进行，以确定是否需要在骨髓块中更深地切割。由于它们的巨型尺寸和核叶，更成熟的巨核细胞可以很容易地用40倍的目标可视化。这为组织中成熟巨核细胞的密度及其对微血?...

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In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

在这里，我们提出了一种使用透射电子显微镜（TEM） 原位 分析巨核细胞超微结构的方案。收集，固定，嵌入环氧树脂中并切割成超薄切片的小鼠骨髓。造影剂染色后，在120 kV的TEM显微镜下观察骨髓。

原位 使用透射电子显微镜探索小鼠巨核细胞生成

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

该程序的总体目标是观察位于小鼠骨髓内的巨核细胞的超结构，并使用高分辨率透射电子显微镜量化不同的成熟阶段。主要优点是在天然环境中直接检查巨核细胞，这与体外培养的巨核细胞不同，我们知道巨核细胞没有达到完全成熟水平。根据标准方案从12至18周龄的C57BL / 6小鼠收获胫骨和股骨后，使用锋利的剃须刀片去除每块骨头上的骨骺。用镊子固定每块骨头，将21号针头连接到装满二甲丁酸盐缓冲液的5毫升注射器插入骨头的一端，并将骨髓冲洗到含有两毫升新鲜卡可啶酯缓冲液的15毫升收集管中。冲洗后立即使用塑料移液管将骨髓圆柱体转移到一毫升新鲜的戊二醛固定溶液中，在室温下孵育60分钟。为了将骨髓嵌入琼脂糖中，在新鲜的卡地啶盐缓冲液中洗涤固定样品，并使用塑料移液管小心地将骨髓转移到载玻片上。使用温热的移液器，快速将一滴2%的液体琼脂滴在骨髓圆柱体上，并立即将载玻片放在冰上一到两分钟。当琼脂凝固时，使用体视显微镜和锋利的剃须刀片丢弃每个骨髓圆柱体的四肢，并将修剪过的骨髓块转移到含有一毫升二甲丁酸盐缓冲液的1.5毫升微量离心管中。对于树脂包埋，用1%四氧化锇将块固定在化学罩中的二甲钒酸盐缓冲液中，在4摄氏度下放置一小时，然后用肼二酸缓冲液洗涤块一次，用蒸馏水清洗一次。水洗后，在蒸馏水中用4%乙酸铀酰染色块一小时，然后在蒸馏水中洗涤两次，如图所示。在最后一次洗涤后，通过一系列上升的乙醇浸泡和蒸馏水对块进行脱水。为了获得骨髓内环氧树脂的均匀浸润和聚合，将块体在两个连续的环氧丙烷浴中孵育15分钟，然后将样品在室温下在100%环氧丙烷和环氧树脂的一对一混合物中孵育一小时。在孵育结束时，向骨髓块中加入100%环氧树脂，在相同条件下孵育过夜，然后加入100%环氧树脂进行另一次孵育两小时。在孵育结束时，使用显微镜将骨髓块定向到扁平硅胶模具中，以允许其随后的横向切片，并在将其置于60摄氏度下48小时之前用环氧树脂填充模具。对于超薄切片，将样品块安装到超切片机支架上，然后将支架安装到样品架上。使用金刚石铣刀以45度角修剪样品，以除去组织周围的多余树脂，然后使用装有水箱的金刚石刀刀片分别切割500和100纳米厚的横向切片以进行组织学和TEM分析，然后使用环将漂浮在水面上的500纳米厚切片转移到载玻片上，并将100纳米厚的切片沉积在载玻片上截面到200目薄条铜格栅上，下面有一个纸过滤器。对于甲苯胺蓝染色，在60度热板上绘制500纳米厚的切片后，将蒸馏水中过滤的1%甲苯胺蓝加入切片中，进行一到两分钟的孵育。在孵育结束时，用蒸馏水洗涤样品。当载玻片干燥后，使用安装介质用盖玻片安装样品，并通过光学显微镜观察样品。对于对比染色，用4%醋酸铀酰标记100纳米切片5分钟，然后用蒸馏水洗涤三次5分钟。在最后一次洗涤后，用柠檬酸铅染色切片三分钟，然后在蒸馏水中洗涤三次五分钟，如图所示。最后一次洗涤后，首先将每个网格的下侧与一张滤纸接触，以便将网格放置在滤纸上以干燥。要通过TEM检查切片，当网格干燥时，选择低放大倍率以评估制剂的一般质量。为了确定每个横截面中每个成熟阶段的巨核细胞数量，请选择更高的放大倍率并仅在完全被组织覆盖的正方形中量化I期，II期或III期巨核细胞的数量。在这种具有代表性的组织学分析中，可以清楚地观察到巨核细胞的紧凑性微血管连续性以及大小和形状。小鼠巨核细胞分为四个成熟阶段。I期巨核细胞具有大细胞核。分界膜系统最早可检测阶段的存在也是该阶段的关键标准。在第二阶段，开始形成颗粒，并开始开发分界膜系统。III期巨核细胞是具有发达的分界膜系统，明确定义的细胞质区域和没有细胞器的外围区域以及偏心定位的细胞核的巨型细胞。巨核细胞成熟的热细胞阶段的特征是裸核。如图所示，巨核细胞经常观察到与内皮细胞接触。有时，巨核细胞形成穿透内皮的短侵袭性突起，或者它们将丙酸盐延伸到正弦腔中。TEM还允许可视化超结构细节，以及被巨核细胞吞没的造血细胞的存在。骨髓冲洗必须在骨片解剖后立即仔细进行。为了最大限度地提高组织完整性，在脱水前用琼脂凝胶包围骨髓。按照这一程序，骨髓块可以在不同的放大倍率下成像，或者可用于其他3D电子显微镜分析，例如聚焦离子束扫描电子显微镜。

Research

JoVE Journal

Biology

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