Name: in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

De auteurs willen Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund bedanken voor de technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), de Europese Unie via het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO) en door Subsidie ANR-17-CE14-0001-01 aan H.d.S.

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese normen 2010/63/EU en het CREMEAS Committee on the Ethics of Animal Experiments van de Universiteit van Straatsburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Het protocol is schematisch weergegeven in figuur 1.
1. Verzameling en fixatie van beenmerg ( Figuur 1A)
LET OP: Deze procedure omvat kankerverwek...

<ol>
	<li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey:+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation.">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li><li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+(HIV-1).">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+(DMS)+in+megakaryocytes.">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li><li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes.">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li><li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+megakaryocytes+to+platelets:+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream.">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment.">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li><li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels.">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids.">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).</li><li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand.">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li><li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+&#945;-Granules.">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet &#945;-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li><li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emperipolesis,+entosis+and+cell+cannibalism:+Demystifying+the+cloud.">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).</li><li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice.">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation.">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li></ol>

Direct onderzoek van megakaryocyten in hun oorspronkelijke omgeving is essentieel om megakaryopoiese en bloedplaatjesvorming te begrijpen. In dit manuscript bieden we een transmissie-elektronenmicroscopiemethode die beenmergspoeling en fixatie door onderdompeling combineert, waardoor in situ de morfologische kenmerken van het hele proces van megakaryocytenmorfogenese in het beenmerg kunnen worden ontleed.
Het spoelen van het beenmerg is een cruciale stap van deze methode, omdat het su...

Megakaryocyten zijn gespecialiseerde grote polyploïde cellen, gelokaliseerd in het beenmerg, verantwoordelijk voor de productie van bloedplaatjes1. Ze zijn afkomstig van hematopoëtische stamcellen door middel van een ingewikkeld rijpingsproces, waarbij megakaryocytvoorlopers geleidelijk in omvang toenemen, terwijl ze uitgebreide gelijktijdige morfologische veranderingen in het cytoplasma en kernondergaan 2. Tijdens de rijping ontwikkelen megakaryocyten een aantal te onderscheiden structurele elementen, waaronder: een polylobulated nucleus, invaginaties van het oppervlaktemembraan die het demarcatiemembraansysteem (DMS) vormen, een perifere zone zonder organellen omringd door het op actine gebaseerde cytoskeletale netwerk, en talrijke organellen waaronder α-korrels, dichte korrels, lysosomen en meerdere Golgi-complexen. Op ultrastructureel niveau is een belangrijke waargenomen wijziging de cytoplasmatische compartimentering in discrete gebieden begrensd door het DMS3. Deze uitgebreide toevoer van membranen zal de uitbreiding van lange cytoplasmatische processen in de beginfase van de bloedplaatjesproductie voeden, die vervolgens in de circulatie zullen worden omgevormd tot bloedplaatjes. Elk defect tijdens megakaryocytendifferentiatie en rijping kan de bloedplaatjesproductie beïnvloeden in termen van het aantal bloedplaatjes en / of de bloedplaatjesfunctie. 
Thin layer transmission electron microscopy (TEM) is al tientallen jaren de beeldvormingsbenadering bij uitstek en biedt hoogwaardige ultrastructuur van megakaryocyten die ons begrip van de fysiologie van trombopoiese hebben gevormd4,5. Dit artikel richt zich op een gestandaardiseerde TEM-methode die het mogelijk maakt om het proces van bloedplaatjesbiogenese vast te leggen dat in situ plaatsvindt in de inheemse beenmergmicro-omgeving, die ook als basis kan dienen om elk beenmergceltype te analyseren. We bieden ultrastructurele voorbeelden van de ontwikkeling van megakaryocyten van onvolwassen tot volledig volwassen, die cytoplasmatische processen uitbreiden naar de microcirculatie van sinusoïden6. We beschrijven ook een eenvoudige procedure om de verschillende rijpingsstadia van megakaryocyten te kwantificeren, waarbij we instructies geven over de regeneratie- en bloedplaatjesproductiecapaciteit van het beenmerg.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td>1670-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 Calcium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids 200 mesh thin-bar</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, England</td>
			<td>T200-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8.20670.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>EM-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolut</td>
			<td>VWR International, France</td>
			<td>20821296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, 90 mm diameter</td>
			<td>Whatman, England</td>
			<td>512-0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding silicone mould</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientific, England</td>
			<td>G3533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>16210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate Leica EMMP</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>705402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo Diamond Knife 45&#176;</td>
			<td>Diatome, Switzerland</td>
			<td>1044797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 2100 Plus TEM microscope</td>
			<td>JEOL, Japan</td>
			<td>EM-21001BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate - Ultrostain 2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>70 55 30 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX-112 resin</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>15320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nadic Methyl Anhydride (NMA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 2%</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>19172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide (1.2-epoxypropane)</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline injectable solution 0.9% NaCl</td>
			<td>C.D.M Lavoisier, France</td>
			<td>MA 575 420 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Surgical steel blade</td>
			<td>Swann-Morton, England</td>
			<td>.0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate - Borax</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>B-9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>84100-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td>Pall Corporation, USA</td>
			<td>514-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>N10-70975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer EM TRIM2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>702801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>656201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>23620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy

Differentiatie en rijping van megakaryocyten vinden plaats in nauwe associatie met de cellulaire en extracellulaire componenten van het beenmerg. Deze processen worden gekenmerkt door het geleidelijk verschijnen van essentiële structuren in het cytoplasma van megakaryocyten, zoals een polyploïde en polylobulated kern, een intern membraannetwerk genaamd demarcation membrane system (DMS) en de dichte en alfakorrels die zullen worden gevonden in circulerende bloedplaatjes. In dit artikel beschrijven we een gestandaardiseerd protocol voor de in situ ultrastructurele studie van muriene megakaryocyten met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), waardoor de belangrijkste kenmerken kunnen worden geïdentificeerd die hun rijpingsfase en cellulaire dichtheid in het beenmerg bepalen. Beenmerg wordt gespoeld, gefixeerd, gedehydrateerd in ethanol, ingebed in plastic hars en gemonteerd voor het genereren van doorsneden. Halfdunne en dunne secties worden voorbereid op respectievelijk histologische en TEM-waarnemingen. Deze methode kan worden gebruikt voor elke beenmergcel, in elke EM-faciliteit en heeft het voordeel dat kleine steekproefgroottes worden gebruikt die de combinatie van verschillende beeldvormingsbenaderingen op dezelfde muis mogelijk maken.

Beenmerg histologie Observatie van de beenmerg toluïsblauwe histologie onder een lichtmicroscoop is de sleutel tot het snel analyseren van de algehele weefselarchitectuur in termen van bijvoorbeeld weefselcompactheid, continuïteit van microvessel en de grootte en vorm van megakaryocyten (figuur 1D). Het wordt uitgevoerd vóór ultradunne secties om de noodzaak van dieper snijden in het beenmergblok te bepalen. Vanwege hun gigantische grootte en nucleair...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Hier presenteren we een protocol om de ultrastructuur van de megakaryocyten in situ te analyseren met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Murine beenmerg wordt verzameld, gefixeerd, ingebed in epoxyhars en gesneden in ultradunne secties. Na contrastkleuring wordt het beenmerg waargenomen onder een TEM-microscoop bij 120 kV.

In situ Exploratie van Murine Megakaryopoiesis met behulp van Transmissie ElektronenMicroscopie

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

Het algemene doel van deze procedure is om de ultrastructuur van megakaryocyten in het beenmerg van de muis te observeren en de verschillende rijpingsstadia te kwantificeren met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie met hoge resolutie. Het belangrijkste voordeel is het directe onderzoek van megakaryocyten in de inheemse omgeving, die verschilt van in vitro gekweekte megakaryocyten die zoals we weten niet het volledige rijpingsniveau bereiken. Na het oogsten van het scheenbeen en de dijbenen van 12 tot 18 weken oude C57BL / 6-muizen volgens standaardprotocollen, gebruikt u een scherp scheermesje om de epifysen van elk bot te verwijderen.Houd elk bot met een pincet vast, steek een naald van 21 gauge die is bevestigd aan een spuit van vijf milliliter gevuld met cacodylaatbuffer in het ene uiteinde van het bot en spoel het beenmerg in een verzamelbuis van 15 milliliter met twee milliliter verse cacodylaatbuffer. Gebruik onmiddellijk na het spoelen een plastic pipet om de beenmergcilinders over te brengen in één milliliter verse glutaaraldehyde fixerende oplossing voor een incubatie van 60 minuten bij kamertemperatuur. Voor het inbedden van het beenmerg in agarose, was de vaste monsters in verse cacodylaatbuffer en gebruik een plastic pipet om het beenmerg voorzichtig over te brengen naar een glasplaat.Breng met een warme pipet snel een druppel van 2% vloeibare agar aan op de beenmergcilinders en plaats de glijbaan onmiddellijk gedurende één tot twee minuten op ijs. Wanneer de agar is gestold, gebruikt u een stereomicroscoop en een scherp scheermesje om de uiteinden van elke beenmergcilinder weg te gooien en de bijgesneden mergblokken over te brengen naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met één milliliter cacodylaatbuffer. Voor harsbedding bevestigt u de blokken met 1% osmiumtetroxide in cacodylaatbuffer gedurende één uur bij vier graden Celsius in een chemische kap voordat u de blokken één keer wast met cacodylaatbuffer en één keer met gedestilleerd water.Na de waterwassing bevlekt u de blokken met 4% uranylacetaat in gedestilleerd water gedurende één uur, gevolgd door twee wasbeurten in gedestilleerd water zoals aangetoond. Na de laatste wasbeurt, de blokken uitdrogen door een oplopende reeks ethanol onderdompelingen en gedestilleerd water zoals aangegeven. Om een uniforme infiltratie en polymerisatie van de epoxyhars in het merg te verkrijgen, incubeer je de blokken in twee opeenvolgende baden van propyleenoxide gedurende 15 minuten voordat je de monsters incubeert in een één-op-één mengsel van 100% propyleenoxide en epoxyhars gedurende een uur op een langzame roterende shaker bij kamertemperatuur.Voeg aan het einde van de incubatie 100% epoxyhars toe aan de mergblokken voor een nachtelijke incubatie onder dezelfde omstandigheden en voeg vervolgens 100% epoxyhars toe voor nog een incubatie van twee uur. Gebruik aan het einde van de incubatie een microscoop om de mergblokken in platte siliconen mallen te oriënteren om hun daaropvolgende dwarsdoorsnede mogelijk te maken en vul de mallen met epoxyhars voordat u ze gedurende 48 uur op 60 graden Celsius plaatst. Voor ultradunne sectiemontage monteert u het monsterblok op een ultramicrotome-ondersteuning en monteert u de ondersteuning op de monsterhouder.Gebruik een diamantfrees om de monsters in een hoek van 45 graden te trimmen om de overtollige hars rond het weefsel te verwijderen voordat u een diamantmesblad gebruikt dat is uitgerust met een watertank om dwarse 500 en 100 nanometer dikke secties te snijden voor respectievelijk histologische en TEM-analyse, gebruik vervolgens een lus om de 500 nanometer dikke secties die op het wateroppervlak drijven op een glazen glijbaan over te brengen en de 100 nanometer dik te deponeren secties op 200 mesh dunne staaf koperen roosters met een papieren filter eronder. Voor toluïsblauwe kleuring, na het tekenen van de 500 nanometer dikke secties op een 60 graden hete plaat, voeg gefilterde 1% toluidineblauw in gedestilleerd water toe aan de secties voor een incubatie van één tot twee minuten. Was aan het einde van de incubatie de monsters met gedestilleerd water.Wanneer de dia's zijn opgedroogd, gebruikt u montagemedium om de monsters met een coverslip te monteren en bekijkt u de monsters met lichtmicroscopie. Voor contrastkleuring labelt u de secties van 100 nanometer met 4% uranylacetaat gedurende vijf minuten, gevolgd door drie wasbeurten van vijf minuten met gedestilleerd water. Na de laatste wasbeurt bevlekt u de secties gedurende drie minuten met loodcitraat, gevolgd door drie wasbeurten van vijf minuten in gedestilleerd water, zoals gedemonstreerd.Plaats na de laatste wasbeurt eerst de onderkant van elk rooster in contact met een stuk filtreerpapier, zodat de roosters op het filtreerpapier kunnen drogen. Om de secties per TEM te onderzoeken, selecteert u, wanneer de roosters zijn opgedroogd, een lage vergroting om de algemene kwaliteit van de preparaten te beoordelen. Om het aantal megakaryocyten uit elk stadium van rijping in elke dwarssectie te bepalen, selecteert u een hogere vergroting en kwantificeert u het aantal megakaryocyten van stadium I, II of III alleen in vierkanten die volledig door weefsel worden bedekt.In deze representatieve histologische analyse kan de compactheid microvatcontinuïteit en grootte en vorm van de megakaryocyten duidelijk worden waargenomen. Murine megakaryocyten zijn verdeeld in vier stadia van rijping. Stadium I megakaryocyten hebben een grote kern.De aanwezigheid van de vroegst detecteerbare fase van het demarcatiemembraansysteem is ook een belangrijk criterium voor deze fase. In fase II begint de korrelvorming en wordt de ontwikkeling van het demarcatiemembraansysteem geïnitieerd. Stadium III megakaryocyten zijn gigantische cellen met goed ontwikkelde afbakeningsmembraansystemen, duidelijk gedefinieerde cytoplasmatische gebieden en perifere zones zonder organellen en excentrisch gelegen kernen.Het pyrenocytenstadium van megakaryocytenrijping wordt gekenmerkt door een naakte kern. Zoals geïllustreerd, worden megakaryocyten vaak waargenomen in contact met endotheelcellen. Soms vormen de megakaryocyten korte invasieve uitsteeksels die het endotheel binnendringen of ze breiden proplatelets uit tot in het sinusoïdale lumen.TEM maakt ook de visualisatie van ultra structurele details mogelijk, evenals de aanwezigheid van hematopoëtische cellen die zijn overspoeld door de megakaryocyten. Beenmergspoeling moet zorgvuldig en onmiddellijk na botdissectie worden uitgevoerd. Om de weefselintegriteit te maximaliseren, wordt het merg omgeven door een gel van agar voordat het uitdroogt.Na deze procedure kunnen de beenmergblokken bij verschillende vergrotingen in beeld worden gebracht of kunnen ze worden gebruikt voor andere 3D-elektronenmicroscopie-analyse, zoals gerichte ionenbundelscanning-elektronenmicroscopie.

Research

JoVE Journal

Biology

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

In situ beeldvorming van de muis Thymus Met behulp van 2-Photon Microscopie

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

De voorbereiding van embryo&#39;s voor Elektronenmicroscopie van de Drosophila Embryonale hart buis

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...