Name: in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00
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Die Autoren danken Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), der Europäischen Union über den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) und durch den Zuschuss ANR-17-CE14-0001-01 an H.d.S. unterstützt.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Normen 2010/63/EU und dem CREMEAS-Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Straßburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg) durchgeführt. Das Protokoll ist in Abbildung 1schematisch dargestellt.
1. Knochenmarkentnahme und -fixierung ( Abbildung 1A)
VORSICHT: Dieses Verfahren umfasst...

<ol>
	<li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey:+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation.">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li><li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+(HIV-1).">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+(DMS)+in+megakaryocytes.">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li><li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes.">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li><li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+megakaryocytes+to+platelets:+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream.">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment.">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li><li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels.">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids.">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).</li><li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand.">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li><li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+&#945;-Granules.">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet &#945;-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li><li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emperipolesis,+entosis+and+cell+cannibalism:+Demystifying+the+cloud.">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).</li><li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice.">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation.">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li></ol>

Die direkte Untersuchung von Megakaryozyten in ihrer natürlichen Umgebung ist unerlässlich, um Megakaryopoese und Thrombozytenbildung zu verstehen. In diesem Manuskript stellen wir eine Transmissionselektronenmikroskopie-Methode zur Verfügung, die Knochenmarkspülung und Fixierung durch Eintauchen kombiniert und es ermöglicht, die morphologischen Eigenschaften des gesamten Prozesses der Megakaryozytenmorphogenese im Knochenmark in situ zu sezieren.
Die Spülung des Knochenmarks is...

Megakaryozyten sind spezialisierte große polyploide Zellen, die im Knochenmark lokalisiert sind und für die Thrombozytenproduktion verantwortlich sind1. Sie stammen aus hämatopoetischen Stammzellen durch einen komplizierten Reifungsprozess, bei dem Megakaryozytenvorläufer zunehmend an Größe zunehmen, während sie gleichzeitig umfangreiche morphologische Veränderungen im Zytoplasma und im Zellkern erfahren2. Während der Reifung entwickeln Megakaryozyten eine Reihe von unterscheidbaren Strukturelementen, darunter: ein polylobulierter Kern, Einfärbungen der Oberflächenmembran, die das Demarkationsmembransystem (DMS) bilden, eine periphere Zone ohne Organellen, die vom Aktin-basierten Zytoskelettnetzwerk umgeben ist, und zahlreiche Organellen, darunter α-Granula, dichte Granula, Lysosomen und mehrere Golgi-Komplexe. Auf der ultrastrukturellen Ebene ist eine wesentliche Beobachtete Modifikation die zytoplasmatische Kompartimentierung in diskrete Regionen, die durch das DMS3begrenzt werden. Diese umfangreiche Versorgung mit Membranen wird die Verlängerung langer zytoplasmatischer Prozesse in der Anfangsphase der Thrombozytenproduktion vorantreiben, die sich dann im Kreislauf in Blutplättchen umwandeln. Jeder Defekt während der Megakaryozytendifferenzierung und -reifung kann die Thrombozytenproduktion in Bezug auf die Thrombozytenzahl und / oder die Thrombozytenfunktion beeinflussen. 
Die Dünnschichttransmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist seit Jahrzehnten der bildgebende Ansatz der Wahl und bietet eine qualitativ hochwertige Ultrastruktur von Megakaryozyten, die unser Verständnis der Physiologie der Thrombopoese geprägt haben4,5. Diese Arbeit konzentriert sich auf eine standardisierte TEM-Methode, die es ermöglicht, den Prozess der Thrombozytenbiogenese in situ innerhalb der nativen Knochenmark-Mikroumgebung zu erfassen, die auch als Grundlage für die Analyse eines beliebigen Knochenmarkzelltyps dienen könnte. Wir liefern ultrastrukturelle Beispiele für die Entwicklung von Megakaryozyten von unreif bis voll ausgereift, die zytoplasmatische Prozesse in die Mikrozirkulation von Sinusoiden ausdehnen6. Wir beschreiben auch ein einfaches Verfahren zur Quantifizierung der verschiedenen Megakaryozyten-Reifungsstadien, das die Regenerations- und Thrombozytenproduktionskapazität des Knochenmarks anleitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td>1670-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 Calcium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids 200 mesh thin-bar</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, England</td>
			<td>T200-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8.20670.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>EM-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolut</td>
			<td>VWR International, France</td>
			<td>20821296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, 90 mm diameter</td>
			<td>Whatman, England</td>
			<td>512-0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding silicone mould</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientific, England</td>
			<td>G3533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>16210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate Leica EMMP</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>705402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo Diamond Knife 45&#176;</td>
			<td>Diatome, Switzerland</td>
			<td>1044797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 2100 Plus TEM microscope</td>
			<td>JEOL, Japan</td>
			<td>EM-21001BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate - Ultrostain 2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>70 55 30 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX-112 resin</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>15320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nadic Methyl Anhydride (NMA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 2%</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>19172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide (1.2-epoxypropane)</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline injectable solution 0.9% NaCl</td>
			<td>C.D.M Lavoisier, France</td>
			<td>MA 575 420 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Surgical steel blade</td>
			<td>Swann-Morton, England</td>
			<td>.0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate - Borax</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>B-9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>84100-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td>Pall Corporation, USA</td>
			<td>514-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>N10-70975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer EM TRIM2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>702801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>656201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>23620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy

Differenzierung und Reifung von Megakaryozyten erfolgen in enger Verbindung mit den zellulären und extrazellulären Komponenten des Knochenmarks. Diese Prozesse sind durch das allmähliche Auftreten essentieller Strukturen im Megakaryozytenzytoplasma wie einem polyploiden und polylobulierten Kern, einem internen Membrannetzwerk namens Demarkationsmembransystem (DMS) und den dichten und Alpha-Granula, die in zirkulierenden Blutplättchen gefunden werden, gekennzeichnet. In diesem Artikel beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll für die in situ ultrastrukturelle Untersuchung von murinen Megakaryozyten mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), das die Identifizierung von Schlüsselmerkmalen ermöglicht, die ihr Reifestadium und ihre Zelldichte im Knochenmark definieren. Knochenmark wird gespült, fixiert, in Ethanol dehydriert, in Kunststoffharz eingebettet und zur Erzeugung von Querschnitten montiert. Halbdünne und dünne Schnitte werden für histologische bzw. TEM-Beobachtungen hergestellt. Diese Methode kann für jede Knochenmarkzelle in jeder EM-Einrichtung verwendet werden und hat den Vorteil, dass kleine Stichprobengrößen verwendet werden, die die Kombination mehrerer Bildgebungsansätze auf derselben Maus ermöglichen.

Histologie des Knochenmarks Die Beobachtung der Knochenmark-Toluidin-Blau-Histologie unter einem Lichtmikroskop ist der Schlüssel zur schnellen Analyse der gesamten Gewebearchitektur in Bezug auf z.B. Gewebekompaktheit, Mikrogefäßkontinuität und die Größe und Form von Megakaryozyten (Abbildung 1D). Es wird vor ultradünnen Abschnitten durchgeführt, um die Notwendigkeit zu bestimmen, tiefer in den Knochenmarkblock zu schneiden. Aufgrund ihrer riesig...

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In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der Ultrastruktur der Megakaryozyten in situ mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) vor. Murine Knochenmarke werden gesammelt, fixiert, in Epoxidharz eingebettet und in ultradünnen Abschnitten geschnitten. Nach der Kontrastfärbung wird das Knochenmark unter einem TEM-Mikroskop bei 120 kV beobachtet.

In situ Erforschung der murinen Megakaryopoese mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Ultrastruktur von Megakaryozyten im Knochenmark der Maus zu beobachten und die verschiedenen Reifestadien mittels hochauflösender Transmissionselektronenmikroskopie zu quantifizieren. Der Hauptvorteil ist die direkte Untersuchung von Megakaryozyten in der nativen Umgebung, die sich von in vitro kultivierten Megakaryozyten unterscheidet, die, wie wir wissen, nicht den vollständigen Reifegrad erreichen. Nachdem Sie die Tibia und die Femuren von 12 bis 18 Wochen alten C57BL / 6-Mäusen gemäß Standardprotokollen geerntet haben, verwenden Sie eine scharfe Rasierklinge, um die Epiphysen von jedem Knochen zu entfernen.Halten Sie jeden Knochen mit einer Pinzette, führen Sie eine 21-Gauge-Nadel, die an einer mit Cacodylatpuffer gefüllten Fünf-Milliliter-Spritze befestigt ist, in ein Ende des Knochens ein und spülen Sie das Knochenmark in ein 15-Milliliter-Auffangröhrchen mit zwei Millilitern frischem Cacodylatpuffer. Verwenden Sie unmittelbar nach dem Spülen eine Kunststoffpipette, um die Knochenmarkzylinder für eine 60-minütige Inkubation bei Raumtemperatur in einen Milliliter frischer Glutaraldehyd-Fixierlösung zu überführen. Um das Knochenmark in Agarose einzubetten, waschen Sie die fixierten Proben in frischem Cacodylatpuffer und verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um das Knochenmark vorsichtig auf einen Glasobjektträger zu übertragen.Tragen Sie mit einer warmen Pipette schnell einen Tropfen 2% flüssiges Agar auf die Knochenmarkzylinder auf und legen Sie den Objektträger sofort für ein bis zwei Minuten auf Eis. Wenn das Agar erstarrt ist, verwenden Sie ein Stereomikroskop und eine scharfe Rasierklinge, um die Extremitäten jedes Knochenmarkzylinders zu verwerfen und die getrimmten Markblöcke in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter Cacodylatpuffer zu übertragen. Für die Harzeinbettung fixieren Sie die Blöcke mit 1% Osmiumtetroxid in Cacodylatpuffer in einer chemischen Haube für eine Stunde bei vier Grad Celsius, bevor Sie die Blöcke einmal mit Cacodylatpuffer und einmal mit destilliertem Wasser waschen.Nach der Wasserwäsche färben Sie die Blöcke mit 4% Uranylacetat in destilliertem Wasser für eine Stunde, gefolgt von zwei Wäschen in destilliertem Wasser, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche dehydrieren Sie die Blöcke durch eine aufsteigende Reihe von Ethanol-Immersionen und destilliertem Wasser wie angegeben. Um eine gleichmäßige Infiltration und Polymerisation des Epoxidharzes im Mark zu erhalten, inkubieren Sie die Blöcke in zwei aufeinanderfolgenden Propylenoxidbädern für 15 Minuten, bevor Sie die Proben in einer Eins-zu-Eins-Mischung aus 100% Propylenoxid und Epoxidharz für eine Stunde auf einem langsamen Rotationsschüttler bei Raumtemperatur inkubieren.Am Ende der Inkubation fügen Sie 100% Epoxidharz zu den Markblöcken für eine nächtliche Inkubation unter den gleichen Bedingungen hinzu und fügen Sie dann 100% Epoxidharz für eine weitere Inkubation von zwei Stunden hinzu. Am Ende der Inkubation richten Sie die Markblöcke mit einem Mikroskop in flachen Silikonformen aus, um ihren anschließenden Querschnitt zu ermöglichen, und füllen Sie die Formen mit Epoxidharz, bevor Sie sie für 48 Stunden bei 60 Grad Celsius platzieren. Für ultradünne Schnitte montieren Sie den Probenblock auf einer Ultramikrotomstütze und montieren Sie die Halterung auf dem Probenhalter.Verwenden Sie einen Diamantfräser, um die Proben in einem Winkel von 45 Grad zu trimmen, um das überschüssige Harz um das Gewebe zu entfernen, bevor Sie eine Diamantmesserklinge mit einem Wassertank verwenden, um quer verlaufende 500 bzw. 100 Nanometer dicke Abschnitte für histologische bzw. TEM-Analysen zu schneiden, dann verwenden Sie eine Schleife, um die 500 Nanometer dicken Abschnitte, die auf der Wasseroberfläche schwimmen, auf einen Glasobjektträger zu übertragen und die 100 Nanometer dicken 100 Nanometer dicken Abschnitte abzuscheiden Schnitte auf 200 Mesh dünne Stabkupfergitter mit einem Papierfilter darunter. Für die Toluidinblaufärbung, nachdem Sie die 500 Nanometer dicken Abschnitte auf einer 60-Grad-Heizplatte gezogen haben, fügen Sie gefiltertes 1% Toluidinblau in destilliertem Wasser zu den Abschnitten für eine ein- bis zweiminütige Inkubation hinzu. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Proben mit destilliertem Wasser.Wenn die Objektträger getrocknet sind, verwenden Sie ein Montagemedium, um die Proben mit einem Deckglas zu befestigen und die Proben durch Lichtmikroskopie zu betrachten. Für die Kontrastfärbung beschriften Sie die 100-Nanometer-Abschnitte fünf Minuten lang mit 4% Uranylacetat, gefolgt von drei fünfminütigen Waschungen mit destilliertem Wasser. Nach der letzten Wäsche die Abschnitte drei Minuten lang mit Bleicitrat einfärben, gefolgt von drei fünfminütigen Waschungen in destilliertem Wasser, wie gezeigt.Legen Sie nach dem letzten Waschen die Unterseite jedes Gitters zuerst mit einem Blatt Filterpapier in Kontakt, damit die Gitter zum Trocknen auf das Filterpapier gelegt werden können. Um die Abschnitte nach TEM zu untersuchen, wählen Sie nach dem Trocknen der Gitter eine geringe Vergrößerung, um die allgemeine Qualität der Zubereitungen zu beurteilen. Um die Anzahl der Megakaryozyten aus jedem Stadium der Reifung in jedem Querschnitt zu bestimmen, wählen Sie eine höhere Vergrößerung und quantifizieren Sie die Anzahl der Megakaryozyten der Stufen I, II oder III nur in Quadraten, die vollständig von Gewebe bedeckt sind.In dieser repräsentativen histologischen Analyse kann die Kompaktheit der Mikrogefäßkontinuität sowie größe und form der Megakaryozyten deutlich beobachtet werden. Murine Megakaryozyten sind in vier Stadien der Reifung unterteilt. Megakaryozyten im Stadium I haben einen großen Kern.Das Vorhandensein des frühesten nachweisbaren Stadiums des Abgrenzungsmembransystems ist ebenfalls ein Schlüsselkriterium dieses Stadiums. Im Stadium II beginnt die Granulatbildung und die Entwicklung des Demarkationsmembransystems wird eingeleitet. Megakaryozyten im Stadium III sind Riesenzellen mit gut entwickelten Abgrenzungsmembransystemen, klar definierten zytoplasmatischen Territorien und peripheren Zonen ohne Organellen und exzentrisch angeordneten Kernen.Das Pyrenozytenstadium der Megakaryozytenreifung ist durch einen nackten Kern gekennzeichnet. Wie dargestellt, werden Megakaryozyten häufig in Kontakt mit Endothelzellen beobachtet. Gelegentlich bilden die Megakaryozyten kurze invasive Vorsprünge, die in das Endothel eindringen, oder sie erstrecken sich in das sinusförmige Lumen.TEM ermöglicht auch die Visualisierung ultrastruktureller Details sowie das Vorhandensein hämatopoetischer Zellen, die von den Megakaryozyten verschlungen wurden. Die Knochenmarkspülung muss sorgfältig und unmittelbar nach der Knochendissektion durchgeführt werden. Um die Integrität des Gewebes zu maximieren, wird das Mark vor der Austrocknung mit einem Agargel umgeben.Nach diesem Verfahren können die Knochenmarkblöcke mit unterschiedlichen Vergrößerungen abgebildet oder für andere 3D-elektronenmikroskopische Analysen, wie z.B. die fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie, verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Biology

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

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