Name: in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לפביאן פרומר, ז'אן איב רינקל, דיוויד הופמן, מוניק פרוינד על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), האיחוד האירופי באמצעות הקרן האירופית לפיתוח אזורי (ERDF) ועל ידי גרנט ANR-17-CE14-0001-01 ל- H.d.S.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לסטנדרטים האירופיים 2010/63/EU וועדת CREMEAS לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת שטרסבורג (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). הפרוטוקול מוצג באופן סכמטי באיור 1.
1. איסוף מח עצם קיבעון ( איור 1A)
<p class=...

<ol>
	<li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey:+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation.">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li><li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+(HIV-1).">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+(DMS)+in+megakaryocytes.">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li><li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes.">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li><li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+megakaryocytes+to+platelets:+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream.">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment.">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li><li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels.">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids.">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).</li><li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand.">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li><li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+&#945;-Granules.">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet &#945;-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li><li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emperipolesis,+entosis+and+cell+cannibalism:+Demystifying+the+cloud.">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).</li><li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice.">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation.">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li></ol>

בדיקה ישירה של megakaryocytes בסביבתם הטבעית חיונית כדי להבין megakaryopoiesis היווצרות טסיות דם. בכתב יד זה, אנו מספקים שיטת מיקרוסקופיה אלקטרונית שידור המשלבת שטיפה של מח עצם קיבעון על ידי טבילה, ומאפשר לנתח במקום את המאפיינים המורפולוגיים של כל התהליך של מורפוגנזה מגהקריוציט המתרחש במח העצם.
<...

Megakaryocytes הם תאים פוליפלואידים גדולים מיוחדים, מקומי במח העצם, אחראי על ייצור טסיות דם1. מקורם בתאי גזע hematopoietic באמצעות תהליך התבגרות מורכב, שבמהלכו מבשרי megakaryocyte גדלים בהדרגה, תוך כדי שינויים מורפולוגיים בו זמנית נרחבים בציטופלסמה ובגרעין2. במהלך ההבשלה, megakaryocytes לפתח מספר אלמנטים מבניים בולטים כולל: גרעין polylobulated, פולשים של קרום פני השטח היוצרים את מערכת קרום התיחום (DMS), אזור היקפי נטול אברונים מוקף רשת cytos שלד מבוסס actin, אברונים רבים כולל α-גרגירים, גרגירים צפופים, ליזוזומים, ומתחמי Golgi מרובים. ברמה האולטרה-מבנית, שינוי משמעותי שנצפה הוא המידור הציטופלסמי לאזורים נפרדים המופרדים על ידי DMS3. אספקה נרחבת זו של ממברנות תדלק את הרחבת התהליכים הציטופלסמיים הארוכים בשלב הראשוני של ייצור טסיות הדם, אשר לאחר מכן לשפץ לתוך טסיות בתוך מחזור הדם. כל פגם במהלך בידול megakaryocyte והתבגרות יכול להשפיע על ייצור טסיות דם במונחים של ספירת טסיות דם ו /או פונקציית טסיות דם. 
מיקרוסקופיית אלקטרונים העברת שכבה דקה (TEM) הייתה גישת ההדמיה של בחירה במשך עשרות שנים ומספקת אולטרה-מבנה באיכות גבוהה של מגהקריוציטים שעיצבו את הבנתנו את הפיזיולוגיה של תרומבוזיס4,5. מאמר זה מתמקד בשיטת TEM מתוקננת המאפשרת ללכוד את תהליך ביוגנזה טסיות הדם המתרחשות במקום בתוך microenvironment מח העצם המקומי, אשר יכול לשמש גם כבסיס לנתח כל סוג תא מח עצם. אנו מספקים דוגמאות אולטרה-מבניות להתפתחות של מגהקריוציטים ממבוגרים עד בוגרים לחלוטין, המרחיבים תהליכים ציטופלסמיים לתוך מיקרו-סירקולציה שלסינוסים 6. אנו מתארים גם הליך קל לכימות שלבי ההתבגרות השונים של המגקריוציט, המלמדים על התחדשות ויכולת ייצור טסיות הדם של מח העצם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td>1670-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 Calcium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids 200 mesh thin-bar</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, England</td>
			<td>T200-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8.20670.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>EM-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolut</td>
			<td>VWR International, France</td>
			<td>20821296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, 90 mm diameter</td>
			<td>Whatman, England</td>
			<td>512-0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding silicone mould</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientific, England</td>
			<td>G3533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>16210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate Leica EMMP</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>705402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo Diamond Knife 45&#176;</td>
			<td>Diatome, Switzerland</td>
			<td>1044797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 2100 Plus TEM microscope</td>
			<td>JEOL, Japan</td>
			<td>EM-21001BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate - Ultrostain 2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>70 55 30 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX-112 resin</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>15320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nadic Methyl Anhydride (NMA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 2%</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>19172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide (1.2-epoxypropane)</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline injectable solution 0.9% NaCl</td>
			<td>C.D.M Lavoisier, France</td>
			<td>MA 575 420 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Surgical steel blade</td>
			<td>Swann-Morton, England</td>
			<td>.0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate - Borax</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>B-9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>84100-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td>Pall Corporation, USA</td>
			<td>514-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>N10-70975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer EM TRIM2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>702801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>656201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>23620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy

בידול והתבגרות של megakaryocytes להתרחש בשיתוף הדוק עם הרכיבים התאיים והחוץ תאיים של מח העצם. תהליכים אלה מאופיינים בהופעה הדרגתית של מבנים חיוניים בציטופלסמה של מגהקריוציטים כגון גרעין פוליפלואידי ופוליבולוס, רשת ממברנות פנימית הנקראת מערכת קרום תיחום (DMS) וגרגרי אלפא צפופים ואלפא שיימצאו בטסיות דם במחזור. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול סטנדרטי למחקר אולטרה-מבני של מקרונים מורין באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM), המאפשר זיהוי של מאפיינים מרכזיים המגדירים את שלב ההתבגרות שלהם ואת הצפיפות התאית במח העצם. מח העצם הוא סמוק, קבוע, מיובש באתנול, מוטבע שרף פלסטיק, ומותקן ליצירת חתך. חלקים דקים ודקים למחצה מוכנים לתצפיות היסתולוגיות ו- TEM, בהתאמה. שיטה זו יכולה לשמש עבור כל תא מח עצם, בכל מתקן EM ויש לו את היתרון של שימוש בגדלים מדגם קטן המאפשר שילוב של מספר גישות הדמיה על אותו עכבר.

היסתולוגיה של מח עצם התבוננות בהיסתולוגיה הכחולה של מח העצם תחת מיקרוסקופ אור היא המפתח לנתח במהירות את ארכיטקטורת הרקמות הכוללת במונחים של למשל, דחיסות רקמות, המשכיות מיקרו-בסל, וגודלם וצורה של מגה-קריוציטים (איור 1D). זה מבוצע לפני קטעים ultrathin כדי לקבוע...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח אולטרה מבנה של megakaryocytes במקום באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM). מח עצם מורין נאספים, קבועים, מוטבעים בשרף אפוקסי וחתוכים בחלקים אולטרה-דקים. לאחר כתמי ניגודיות, מוח העצם נצפה תחת מיקרוסקופ TEM ב 120 kV.

בסיטו חקר מורין Megakaryopoiesis באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן במבנה האולטרה של מגהקריוציטים הממוקמים בתוך מח העצם של העכבר, ולכומת את שלבי ההתבגרות השונים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור ברזולוציה גבוהה. היתרון העיקרי הוא בחינה ישירה של megakaryocytes בסביבה המקומית, אשר שונה מ מותחקריוציטים מתורבתים במבחנה כי כפי שאנו יודעים לא להגיע לרמה המלאה של ההתבגרות. לאחר קצירת השוקה ועצם הירך מ 12 עד 18 שבועות C57BL/ 6 עכברים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, להשתמש בסכין גילוח חד כדי להסיר את epiphyses מכל עצם.מחזיקים כל עצם עם פינצטה, מכניסים מחט 21 מד מחובר מזרק חמישה מיליליטר מלא חוצץ קקודילאט לקצה אחד של העצם לשטוף את מח העצם לתוך צינור אוסף 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של חוצץ קקודילאט טרי. מיד לאחר השטיפה, השתמש פיפטה פלסטיק להעביר את גלילי מח העצם לתוך מיליליטר אחד של פתרון קיבוע גלוטרלדהיד טרי עבור דגירה של 60 דקות בטמפרטורת החדר. להטמעת מח העצם באגרוז, יש לשטוף את הדגימות הקבועות במאגר קקודילט טרי ולהשתמש בפיפטה מפלסטיק כדי להעביר בזהירות את מח העצם למגלשת זכוכית.באמצעות פיפטה חמה, להחיל במהירות טיפה של 2% אגר נוזלי על גלילי מח העצם, ומיד למקם את השקופית על קרח במשך 1 עד 2 דקות. כאשר האגר התגבש, השתמש במיקרוסקופ סטריאו ובסכין גילוח חד כדי להשליך את הגפיים של כל גליל מח עצם ולהעביר את גושי מח העצם הקצוצים לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של חוצץ קקודילאט. עבור הטבעת שרף, לתקן את הבלוקים עם 1% osmium tetroxide במאגר קקודילאט במכסה המנוע הכימי במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס לפני שטיפת הבלוקים פעם אחת עם חוצץ קקודילאט ופעם אחת עם מים מזוקקים.לאחר שטיפת המים, מכתימים את הבלוקים עם 4% אורניל אצטט במים מזוקקים במשך שעה ואחריו שתי שטיפות במים מזוקקים כפי שהוכח. לאחר הכביסה האחרונה, ייבשו את הבלוקים דרך סדרה עולה של טבילות אתנול ומים מזוקקים כפי שצוין. כדי להשיג חדירה אחידה פילמור של שרף אפוקסי בתוך מח העצם, לדגור על בלוקים בשתי אמבטיות רצופות של תחמוצת פרופילן במשך 15 דקות לפני הדגירה של הדגימות בתערובת של אחד לאחד של תחמוצת פרופילן 100% תחמוצת פרופילן ושרף אפוקסי במשך שעה אחת על שייקר סיבובי איטי בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, להוסיף 100%שרף אפוקסי לחסימות מח העצם עבור דגירה לילה באותם תנאים, ולאחר מכן להוסיף 100%שרף אפוקסי עבור דגירה נוספת של שעתיים. בסוף הדגירה, השתמש במיקרוסקופ כדי לכוון את גושי מח העצם בתבניות סיליקון שטוחות כדי לאפשר את החלקה הרוחבת הבאה שלהם ולמלא את התבניות עם שרף אפוקסי לפני הצבתם ב 60 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. לחיתוך דק במיוחד, הוערס על בלוק הדגימה על תמיכה במיקרוטומיה אולטרה והעלה את התמיכה על מחזיק הדגימה.השתמש בחותך כרסום יהלום כדי לקצץ את הדגימות בזווית של 45 מעלות כדי להסיר את השרף העודף סביב הרקמה לפני השימוש בסכין יהלום המצויד במיכל מים כדי לחתוך קטעים עבים רוחביים 500 ו -100 ננומטר לניתוח היסתולוגי ו- TEM בהתאמה, ואז השתמש בלולאה כדי להעביר את החלקים העבים של 500 ננומטר הצפים על פני המים על משטח המים על מגלשת זכוכית ולהפקיד את עובי 100 ננומטר מקטעים על רשת נחושת דקה של 200 רשת עם מסנן נייר מתחת. עבור תכתמים כחולים טולואידין, לאחר ציור החלקים בעובי 500 ננומטר על צלחת חמה של 60 מעלות, הוסיפו 1% טולואידין כחול במים מזוקקים למקטעים לדגירה של דקה עד שתי דקות. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות עם מים מזוקקים.כאשר השקופיות התייבשו, השתמש באמצעי הרכבה כדי להרכיב את הדגימות עם כיסוי ולהציג את הדגימות באמצעות מיקרוסקופיה קלה. עבור כתמי ניגודיות, סמן את מקטעי 100 ננומטר עם 4% אצטט אורניל במשך חמש דקות ואחריו שלוש שטיפות של חמש דקות עם מים מזוקקים. לאחר הכביסה האחרונה, מכתימים את החלקים עם ציטוט עופרת במשך שלוש דקות, ואחריו שלוש שטיפות של חמש דקות במים מזוקקים כפי שהודגם.לאחר הכביסה האחרונה, מניחים את הצד התחתון של כל רשת במגע עם פיסת נייר סינון תחילה כדי לאפשר את הצבת הרשתות על נייר המסנן להתייבש. כדי לבחון את המקטעים על ידי TEM, כאשר הרשתות התייבשו, בחר הגדלה נמוכה כדי להעריך את האיכות הכללית של ההכנות. כדי לקבוע את מספר המגקריוציטים מכל שלב של התבגרות בכל מקטע רוחבי, בחר הגדלה גבוהה יותר וכמת את מספר המגקריוציטים של שלב I, II או III רק בריבועים המכוסים במלואם ברקמה.בניתוח היסתולוגי מייצג זה, ניתן לראות בבירור את המשכיות המיקרו-כלי הקומפקטיות ואת הגודל והצורה של המגקריוציטים. מקרוציטים מורינים מחולקים לארבעה שלבים של התבגרות. בשלב הראשון למגקריוציטים יש גרעין גדול.נוכחותו של השלב המוקדם ביותר לגילוי של מערכת קרום התיחום היא גם קריטריון מרכזי של שלב זה. בשלב II, היווצרות גרגר מתחילה ופיתוח מערכת קרום התיחום הוא יזם. מגקריוציטים בשלב III הם תאים ענקיים עם מערכות קרום תיחום מפותחות, שטחים ציטופלסמיים מוגדרים בבירור ואזורים היקפיים נטולי אברונים, ונגרעינים הממוקמים באופן אקסצנטרי.שלב הפינוציטים של התבגרות מגה-קריוצייט מאופיין בגרעין עירום. כפי שמודגם, megakaryocytes נצפים לעתים קרובות במגע עם תאי אנדותל. לעתים, megakaryocytes ליצור בליטות פולשניות קצרות לחדור את אנדותל או שהם להרחיב את הנפיחות לתוך לומן הסינוסואידי.TEM מאפשר גם הדמיה של פרטים מבניים אולטרה, כמו גם את נוכחותם של תאים hematopoietic כי כבר בלע על ידי megakaryocytes. שטיפה מח עצם צריך להתבצע בזהירות ומיד לאחר ניתוח העצם. כדי למקסם את שלמות הרקמה, מח העצם מוקף בג'ל אגר לפני התייבשות.בעקבות הליך זה, ניתן לדמיין את בלוקי מח העצם בהגדלות שונות או לשמש לניתוח מיקרוסקופיה תלת-ממדית אחרת של אלקטרונים, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים ממוקדת של קרן יונים.

Research

JoVE Journal

Biology

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

בתחום ההדמיה באתרו של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...