Name: in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00
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Gli autori desiderano ringraziare Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), dall'Unione Europea attraverso il Fondo Europeo di Sviluppo Regionale (FESR) e dalla Sovvenzione ANR-17-CE14-0001-01 a H.d.S.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme europee 2010/63/UE e il Comitato CREMEAS per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Strasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Il protocollo è schematicamente mostrato nella Figura 1.
1. Raccolta e fissazione del midollo osseo ( Figura 1A)
ATTENZIONE: Quest...

<ol>
	<li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey:+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation.">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li><li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+(HIV-1).">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+(DMS)+in+megakaryocytes.">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li><li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes.">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li><li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+megakaryocytes+to+platelets:+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream.">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment.">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li><li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels.">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids.">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).</li><li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand.">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li><li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+&#945;-Granules.">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet &#945;-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li><li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emperipolesis,+entosis+and+cell+cannibalism:+Demystifying+the+cloud.">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).</li><li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice.">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation.">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li></ol>

L'esame diretto dei megacariociti nel loro ambiente nativo è essenziale per comprendere la megacariopoiesi e la formazione piastrinica. In questo manoscritto, forniamo un metodo di microscopia elettronica a trasmissione che combina il lavaggio del midollo osseo e la fissazione per immersione, consentendo di sezionare in situ le caratteristiche morfologiche dell'intero processo di morfogenesi dei megacariociti che si svolge nel midollo osseo.
Il rossore del midollo osseo è un passagg...

I megacariociti sono cellule poliploidi specializzate di grandi dimensioni, localizzate nel midollo osseo, responsabili della produzione piastrinica1. Hanno origine da cellule staminali ematopoietiche attraverso un intricato processo di maturazione, durante il quale i precursori dei megacariociti aumentano progressivamente di dimensioni, mentre subiscono estesi cambiamenti morfologici concomitanti nel citoplasma e nel nucleo2. Durante la maturazione, i megacariociti sviluppano una serie di elementi strutturali distinguibili tra cui: un nucleo polilobulato, invaginazioni della membrana superficiale che formano il sistema di membrana di demarcazione (DMS), una zona periferica priva di organelli circondata dalla rete citoscheletrica a base di actina e numerosi organelli tra cui α-granuli, granuli densi, lisosomi e complessi multipli di Golgi. A livello ultrastrutturale, una modifica importante osservata è la compartimentazione citoplasmatica in regioni discrete delimitate dal DMS3. Questa vasta fornitura di membrane alimenterà l'estensione di lunghi processi citoplasmatici nella fase iniziale della produzione piastrinica, che poi si rimodellerà in piastrine all'interno della circolazione. Qualsiasi difetto durante la differenziazione e la maturazione dei megacariociti può influenzare la produzione piastrinica in termini di conta piastrinica e/o funzione piastrinica. 
La microscopia elettronica a trasmissione a strato sottile (TEM) è stata l'approccio di imaging di scelta per decenni fornendo un'ultrastruttura di alta qualità dei megacariociti che hanno plasmato la nostra comprensione della fisiologia della trombopoiesi4,5. Questo documento si concentra su un metodo TEM standardizzato che consente di catturare il processo di biogenesi piastrinica che si verifica in situ all'interno del microambiente del midollo osseo nativo, che potrebbe anche servire come base per analizzare qualsiasi tipo di cellula del midollo osseo. Forniamo esempi ultrastrutturali dello sviluppo di megacariociti da immaturi a completamente maturi, che estendono i processi citoplasmatici nella microcircolazione delle sinusoidi6. Descriviamo anche una procedura semplice per quantificare le diverse fasi di maturazione dei megacariociti, istruendo sulla rigenerazione e sulla capacità di produzione piastrinica del midollo osseo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td>1670-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 Calcium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids 200 mesh thin-bar</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, England</td>
			<td>T200-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8.20670.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>EM-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolut</td>
			<td>VWR International, France</td>
			<td>20821296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, 90 mm diameter</td>
			<td>Whatman, England</td>
			<td>512-0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding silicone mould</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientific, England</td>
			<td>G3533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>16210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate Leica EMMP</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>705402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo Diamond Knife 45&#176;</td>
			<td>Diatome, Switzerland</td>
			<td>1044797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 2100 Plus TEM microscope</td>
			<td>JEOL, Japan</td>
			<td>EM-21001BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate - Ultrostain 2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>70 55 30 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX-112 resin</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>15320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nadic Methyl Anhydride (NMA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 2%</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>19172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide (1.2-epoxypropane)</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline injectable solution 0.9% NaCl</td>
			<td>C.D.M Lavoisier, France</td>
			<td>MA 575 420 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Surgical steel blade</td>
			<td>Swann-Morton, England</td>
			<td>.0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate - Borax</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>B-9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>84100-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td>Pall Corporation, USA</td>
			<td>514-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>N10-70975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer EM TRIM2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>702801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>656201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>23620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy

La differenziazione e la maturazione dei megacariociti avvengono in stretta associazione con i componenti cellulari ed extracellulari del midollo osseo. Questi processi sono caratterizzati dalla graduale comparsa di strutture essenziali nel citoplasma dei megacariociti come un nucleo poliploide e polilobulato, una rete di membrana interna chiamata sistema di membrana di demarcazione (DMS) e i granuli densi e alfa che si troveranno nelle piastrine circolanti. In questo articolo, descriviamo un protocollo standardizzato per lo studio ultrastrutturale in situ dei megacariociti murini utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), consentendo l'identificazione delle caratteristiche chiave che definiscono il loro stadio di maturazione e la densità cellulare nel midollo osseo. I midollo osseo vengono lavati, fissati, disidratati in etanolo, incorporati in resina plastica e montati per generare sezioni trasversali. Sezioni semisottili e sottili sono preparate rispettivamente per osservazioni istologiche e TEM. Questo metodo può essere utilizzato per qualsiasi cellula del midollo osseo, in qualsiasi struttura EM e ha il vantaggio di utilizzare campioni di piccole dimensioni che consentono la combinazione di diversi approcci di imaging sullo stesso topo.

Istologia del midollo osseo L'osservazione dell'istologia blu toluidina del midollo osseo al microscopio ottico è la chiave per analizzare rapidamente l'architettura complessiva del tessuto in termini, ad esempio, di compattezza dei tessuti, continuità dei microvasi e dimensioni e forma dei megacariociti (Figura 1D). Viene eseguito prima di sezioni ultrassanteli per determinare la necessità di tagliare più in profondità nel blocco del midollo osseo. ...

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In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Qui presentiamo un protocollo per analizzare l'ultrastruttura dei megacariociti in situ utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). I midolli ossei murini vengono raccolti, fissati, incorporati in resina epossidica e tagliati in sezioni ultrassteste. Dopo la colorazione di contrasto, il midollo osseo viene osservato al microscopio TEM a 120 kV.

Sul posto Esplorazione della megacariopoiesi murina usando la microscopia elettronica a trasmissione

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare l'ultra struttura dei megacariociti situati all'interno del midollo osseo del topo e quantificare le diverse fasi di maturazione utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione ad alta risoluzione. Il vantaggio principale è l'esame diretto dei megacariociti nell'ambiente nativo, che si differenzia dai megacariociti coltivati in vitro che come sappiamo non raggiungono il livello completo di maturazione. Dopo aver raccolto la tibia e i femori da topi C57BL/6 di 12-18 settimane secondo i protocolli standard, utilizzare una lama di rasoio affilata per rimuovere le epifisi da ciascun osso.Tenendo ogni osso con una pinzetta, inserire un ago calibro 21 attaccato a una siringa da cinque millilitri riempita con tampone di cacodilato in un'estremità dell'osso e lavare il midollo osseo in un tubo di raccolta da 15 millilitri contenente due millilitri di tampone di cacodilato fresco. Immediatamente dopo il lavaggio, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire i cilindri del midollo osseo in un millilitro di soluzione fissativa di glutaraldeide fresca per un'incubazione di 60 minuti a temperatura ambiente. Per incorporare il midollo osseo nell'agarose, lavare i campioni fissi in un tampone di cacodilato fresco e utilizzare una pipetta di plastica per trasferire con cura il midollo osseo in un vetrino.Usando una pipetta calda, applicare rapidamente una goccia di agar liquido al 2% sui cilindri del midollo osseo e posizionare immediatamente il vetrino sul ghiaccio per uno o due minuti. Quando l'agar si è solidificato, utilizzare uno stereomicroscopio e una lama di rasoio affilata per scartare le estremità di ciascun cilindro del midollo osseo e trasferire i blocchi di midollo tagliati in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro contenente un millilitro di tampone cacodilato. Per l'incorporamento della resina, fissare i blocchi con tetroxide di osmio all'1% in tampone di cacodilato in una cappa chimica per un'ora a quattro gradi Celsius prima di lavare i blocchi una volta con tampone di cacodilato e una volta con acqua distillata.Dopo il lavaggio con acqua, colorare i blocchi con acetato di uranile al 4% in acqua distillata per un'ora seguita da due lavaggi in acqua distillata come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, disidratare i blocchi attraverso una serie ascendente di immersioni di etanolo e acqua distillata come indicato. Per ottenere un'infiltrazione e polimerizzazione uniforme della resina epossidica all'interno del midollo, incubare i blocchi in due bagni successivi di ossido di propilene per 15 minuti prima di incubare i campioni in una miscela one-to-one di ossido di propilene al 100% e resina epossidica per un'ora su uno shaker rotativo lento a temperatura ambiente.Alla fine dell'incubazione, aggiungere resina epossidica al 100% ai blocchi di midollo per un'incubazione notturna nelle stesse condizioni, quindi aggiungere resina epossidica al 100% per un'altra incubazione di due ore. Alla fine dell'incubazione, utilizzare un microscopio per orientare i blocchi di midollo in stampi in silicone piatti per consentire il loro successivo sezionamento trasversale e riempire gli stampi con resina epossidica prima di posizionarli a 60 gradi Celsius per 48 ore. Per il sezionamento ultra sottile, montare il blocco del campione su un supporto ultra microtome e montare il supporto sul supporto del campione.Utilizzare una fresa diamantata per tagliare i campioni con un angolo di 45 gradi per rimuovere la resina in eccesso attorno al tessuto prima di utilizzare una lama diamantato dotata di un serbatoio dell'acqua per tagliare sezioni trasversali di 500 e 100 nanometri di spessore rispettivamente per l'analisi istologica e TEM, quindi utilizzare un anello per trasferire le sezioni spesse 500 nanometri che galleggiano sulla superficie dell'acqua su un vetrino e per depositare lo spessore di 100 nanometri sezioni su 200 griglie di rame a barra sottile a rete con un filtro di carta sotto. Per la colorazione blu toluidina, dopo aver disegnato le sezioni spesse 500 nanometri su una piastra calda a 60 gradi, aggiungere l'1% di toluidina blu filtrato in acqua distillata alle sezioni per un'incubazione da uno a due minuti. Alla fine dell'incubazione, lavare i campioni con acqua distillata.Quando i vetrini si sono asciugati, utilizzare il mezzo di montaggio per montare i campioni con un coperchio e visualizzare i campioni al microscopio ottico. Per la colorazione a contrasto, etichettare le sezioni da 100 nanometri con acetato di uranile al 4% per cinque minuti, seguito da tre lavaggi di cinque minuti con acqua distillata. Dopo l'ultimo lavaggio, colorare le sezioni con citrato di piombo per tre minuti, seguiti da tre lavaggi di cinque minuti in acqua distillata come dimostrato.Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare prima il lato inferiore di ogni griglia a contatto con un pezzo di carta da filtro per consentire alle griglie di essere posizionate sulla carta da filtro per asciugare. Per esaminare le sezioni di TEM, quando le griglie si sono asciugate, selezionare un basso ingrandimento per valutare la qualità generale dei preparati. Per determinare il numero di megacariociti da ogni stadio di maturazione in ogni sezione trasversale, selezionare un ingrandimento più elevato e quantificare il numero di megacariociti di stadio I, II o III solo in quadrati completamente coperti da tessuto.In questa analisi istologica rappresentativa, la compattezza della continuità dei micro-vasi e le dimensioni e la forma dei megacariociti possono essere chiaramente osservate. I megacariociti murini sono divisi in quattro fasi di maturazione. I megacariociti di stadio I hanno un grande nucleo.Anche la presenza del primo stadio rilevabile del sistema a membrana di demarcazione è un criterio chiave di questa fase. Nella fase II, inizia la formazione di granuli e viene avviato lo sviluppo del sistema di membrana di demarcazione. I megacariociti allo stadio III sono cellule giganti con sistemi di membrana di demarcazione ben sviluppati, territori citoplasmatici chiaramente definiti e zone periferiche prive di organelli e nuclei eccentricamente posizionati.Lo stadio dei pirenociti della maturazione dei megacariociti è caratterizzato da un nucleo nudo. Come illustrato, i megacariociti sono frequentemente osservati a contatto con le cellule endoteliali. A volte, i megacariociti formano brevi sporgenze invasive che penetrano nell'endotelio o estendono i proplati nel lume sinusoidale.TEM permette anche la visualizzazione di dettagli ultra strutturali, così come la presenza di cellule ematopoietiche che sono state inghiottite dai megacariociti. Il rossore del midollo osseo deve essere eseguito con attenzione e immediatamente dopo la dissezione ossea. Per massimizzare l'integrità dei tessuti, il midollo è circondato da un gel di agar prima della disidratazione.Seguendo questa procedura, i blocchi di midollo osseo possono essere ripresi a diversi ingrandimenti o possono essere utilizzati per altre analisi di microscopia elettronica 3D, come la microscopia elettronica a scansione a fascio ionica focalizzato.

Research

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