Name: in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00
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著者らは、ファビエンヌ・プロアマー、ジャン=イヴ・リンケル、デビッド・ホフマン、モニーク・フロイントに技術支援を感謝したいと考えている。この研究は、ARMESA(メデシン・エ・サンテ・パブリケ協会)、欧州地域開発基金(ERDF)を通じた欧州連合(EU)、グラントANR-17-CE14-0001-01からH.d.S.に支援されました。

すべての動物実験は、ヨーロッパの基準2010/63/EUとストラスブール大学動物実験倫理に関するCREMEAS委員会(コンテテ・レジオナル・デティク・アン・マティエール・デ・エクスペリメンテーション・アニマル・ストラスブール)に従って行われました。プロトコルは図 1に概略的に示されています。
1. 骨髄の収集と固定 (図 1A)
<p...

<ol>
	<li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey:+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation.">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li><li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+(HIV-1).">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+(DMS)+in+megakaryocytes.">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li><li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes.">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li><li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+megakaryocytes+to+platelets:+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream.">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment.">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li><li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels.">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids.">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).</li><li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand.">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li><li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+&#945;-Granules.">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet &#945;-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li><li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emperipolesis,+entosis+and+cell+cannibalism:+Demystifying+the+cloud.">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).</li><li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice.">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation.">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li></ol>

巨核代の直接検査は、巨核球の形成や血小板形成を理解するために不可欠です。本稿では、骨髄紅潮と浸漬による固定を組み合わせた透過電子顕微鏡法を提供し、骨髄中で起こっている巨核球形態形成の全過程の形態特性を その場で 解剖することを可能にする。
骨髄の洗い流しは、高品質のフラッシングの成功はオペレータの練習とトレーニングに依存するので...

巨核球は、骨髄に局在する大型多倍数細胞を専門とし、血小板産生を担う1.それらは複雑な成熟プロセスを通して造血幹細胞に由来し、その間に巨核球前駆体は徐々にサイズが増加し、細胞質および核2の広範な付随的形態変化を受ける。成熟の間、巨核球は、多球状核、境界膜系(DMS)を形成する表面膜の内在、アクチン系細胞骨格網に囲まれた小器官の末梢領域、およびα-顆粒、高密度顆粒、リゾソーム、リゾソーム、および多重体を含む多数の顕著な構造要素を開発する。超構造レベルでは、観察される大きな変化は、DMS3で区切られた離散領域への細胞質区画化である。膜のこの広範な供給は、血小板生産の初期段階で長い細胞質プロセスの延長を促進し、その後、循環内の血小板に改造します。巨核球分化および成熟時の欠陥は、血小板数および/または血小板機能の用語で血小板産生に影響を与える可能性があります。 
薄層透過型電子顕微鏡(TEM)は、血栓形成4,5の生理学の理解を形作った巨核球の高品質な超構造を提供する何十年もの間、選択のイメージングアプローチであった。本論文は、骨髄細胞の種類を分析する基礎となる可能性のある、天然骨髄微小環境内で起こる血小板生物新生の過程を捉えることができる標準化されたTEM法に焦点を当てる。我々は、細胞質プロセスをサイヌソード6の微小循環に拡張する未熟から完全に成熟までの巨核球の開発の超構造的な例を提供する。また、骨髄の再生能力と血小板生産能力を説明する、異なる巨核球成熟段階を定量化する簡単な手順についても説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td>1670-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 Calcium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids 200 mesh thin-bar</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, England</td>
			<td>T200-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8.20670.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>EM-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolut</td>
			<td>VWR International, France</td>
			<td>20821296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, 90 mm diameter</td>
			<td>Whatman, England</td>
			<td>512-0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding silicone mould</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientific, England</td>
			<td>G3533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>16210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate Leica EMMP</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>705402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo Diamond Knife 45&#176;</td>
			<td>Diatome, Switzerland</td>
			<td>1044797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 2100 Plus TEM microscope</td>
			<td>JEOL, Japan</td>
			<td>EM-21001BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate - Ultrostain 2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>70 55 30 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX-112 resin</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>15320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nadic Methyl Anhydride (NMA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 2%</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>19172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide (1.2-epoxypropane)</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline injectable solution 0.9% NaCl</td>
			<td>C.D.M Lavoisier, France</td>
			<td>MA 575 420 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Surgical steel blade</td>
			<td>Swann-Morton, England</td>
			<td>.0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate - Borax</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>B-9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>84100-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td>Pall Corporation, USA</td>
			<td>514-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>N10-70975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer EM TRIM2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>702801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>656201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>23620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy

巨核球の分化および成熟は、骨髄の細胞および細胞外成分と密接に関連して起こる。これらのプロセスは、多倍体および多球状核などの巨核球細胞質の必須構造の徐々に出現することを特徴とし、境界膜系(DMS)と呼ばれる内部膜ネットワークおよび循環血小板に見られる緻密およびアルファ顆粒である。本稿では、トランスミッション電子顕微鏡(TEM)を用いたマウス巨核球のin situ 超構造研究における標準化プロトコルについて述べ、骨髄における成熟段階および細胞密度を定義する主要な特性を同定することを可能にする。骨髄は、フラッシュ、固定、エタノール中の脱水、プラスチック樹脂に埋め込まれ、そして、断面を生成するために取り付けられる。半薄いセクションと薄いセクションは、それぞれ組織学的およびTEMの観察のために準備されています。この方法は、任意のEM施設で、任意の骨髄細胞に使用することができ、同じマウス上のいくつかのイメージングアプローチの組み合わせを可能にする小さなサンプルサイズを使用する利点を有する。

骨髄の神学 軽顕微鏡下での骨髄トルイジンブルー組織学の観察は、例えば組織のコンパクトさ、微小血管の連続性、および巨核球の大きさと形状の点で組織体系全体を迅速に分析する鍵である(図1D)。それは、骨髄ブロック内の深い切断の必要性を決定するために、超薄いセクションの前に行われます。巨大な大きさと核の凝縮のために、よ?...

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In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

ここでは、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、その 場で 巨核球の超構造を解析するプロトコルを紹介する。マウス骨マロウは、収集され、固定され、エポキシ樹脂に埋め込まれ、超薄切片で切断される。コントラスト染色後、骨髄は120kVのTEM顕微鏡下で観察される。

イン・シトゥ 透過電子顕微鏡を用いたネズミ巨核生物の探索

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

この手順の全体的な目的は、マウス骨髄内に位置する巨核球の超構造を観察し、高解像度の透過電子顕微鏡を用いて異なる成熟段階を定量化することです。主な利点は、我々が知っているように成熟の完全なレベルに達していない体外培養巨核球とは異なるネイティブ環境で巨核球の直接検査です。標準的なプロトコルに従って12〜18週齢のC57BL/6マウスから脛骨および大腿骨を収穫した後、鋭いカミソリの刃を使用して各骨から骨端を除去する。ピンセットで各骨を保持し、カコジレートバッファーで満たされた5ミリリットルの注射器に取り付けられた21ゲージ針を骨の一端に挿入し、骨髄を2ミリリットルの新鮮なカコジレートバッファーを含む15ミリリットルのコレクションチューブに洗い流します。洗い流した直後に、プラスチックピペットを使用して骨髄シリンダーを1ミリリットルの新鮮なグルタルアルデヒド固定液に移し、室温で60分間インキュベーションします。アガロースに骨髄を埋め込む場合は、固定サンプルを新鮮なカコダイレートバッファーで洗浄し、プラスチックピペットを使用して慎重に骨髄をガラススライドに移します。暖かいピペットを使用して、骨髄シリンダーに2%液体寒天の低下を素早く適用し、すぐに1〜2分間氷の上にスライドを置きます。寒天が固まったら、ステレオ顕微鏡と鋭いカミソリの刃を使用して各骨髄シリンダーの四肢を捨て、トリミングされた骨髄ブロックを1ミリリットルのカコジレートバッファーを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。樹脂埋め込みの場合は、カコジレートバッファーで1%オスミウム四酸化物質を化学フードに1時間、4°Cで1時間固定してから、カコダイレートバッファーで1回、蒸留水で1回洗浄します。水洗い後、4%の酢酸を蒸留水で1時間染色し、続いて蒸留水で2回洗浄します。最後の洗浄後、示されているように、エタノール浸漬と蒸留水の上昇シリーズを通してブロックを脱水します。骨髄の中のエポキシ樹脂の均一な浸潤と重合を得るために、プロピレンオキシドの2つの連続した浴でブロックを15分間インキュベートしてから、室温でゆっくりとした回転式シェーカーで100%プロピレンオキシドとエポキシ樹脂の1対1の混合物でサンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、同じ条件下で一晩インキュベーションのために骨髄ブロックに100%エポキシ樹脂を加え、2時間の別のインキュベーションのために100%エポキシ樹脂を加える。インキュベーションの最後に、顕微鏡を使用して平らなシリコーン型の骨髄ブロックを向け、その後の横断断断面を可能にし、金型をエポキシ樹脂で満たし、48時間摂氏60度にします。超薄型断面の場合は、サンプルブロックを超ミクロトームサポートに取り付け、サポートをサンプルホルダーに取り付けます。ダイヤモンドフライスカッターを使用してサンプルを45度の角度でトリミングし、水タンクを装備したダイヤモンドナイフブレードを使用して横断500と100ナノメートルの厚いセクションをそれぞれ切断し、ループを使用して水面に浮かぶ500ナノメートルのセクションをガラススライドに移し、100ナノメートル厚いナノメートルを堆積させます200メッシュの薄いバーの銅格子に、下に紙のフィルターを持つセクション。トルイジンブルー染色の場合、60度のホットプレートに500ナノメートルの厚いセクションを描いた後、蒸留水に1%トルイジンブルーを1〜2分間のインキュベーション用に加えます。インキュベーションの終わりに、蒸留水でサンプルを洗浄します。スライドが乾燥したら、取り付け媒体を使用してカバースリップでサンプルを取り付け、光顕微鏡でサンプルを見ます。コントラスト染色の場合は、100ナノメートルの切片に4%ウラニル酢酸を5分間ラベルし、その後蒸留水で5分間の3回の水を流します。最後の洗浄の後、リードクエン酸で3分間部分を汚し、続いて示すように蒸留水に5分間洗浄します。最後の洗浄の後、各グリッドの下側をフィルターペーパーの部分に接触させて、グリッドをフィルター用紙に置いて乾燥させます。TEMによってセクションを調べるには、グリッドが乾燥したら、低倍率を選択して製剤の一般的な品質を評価します。各横断部の成熟の各段階から巨核球の数を決定するには、より高い倍率を選択し、完全に組織で覆われている正方形のステージI、II、またはIII巨核球の数を定量化します。本代表組織学的解析では、巨大核球の小型血管の連続性と大きさおよび形状が明確に観察される。マウス巨核球は、成熟の4つの段階に分かれています。ステージI巨核球は大きな核を持っています。境界膜系の最も初期の検出可能な段階の存在もこの段階の重要な基準である。ステージIIでは、顆粒形成が始まり、境界膜系の発達が開始される。ステージIII巨核球は、よく発達した境界膜系、細胞質領域と卵性子を欠いた末梢領域、および偏心的に位置する核を有する巨大な細胞である。巨核球成熟のピレノサイトステージは、裸の核によって特徴付けられる。図示するように、巨核球は内皮細胞と接触して頻繁に観察される。時には、巨核球は、内皮に浸透する短い侵襲的な突起を形成するか、または彼らは、鼻腔内にプロ血小板を拡張する。TEMはまた、超構造的な詳細の視覚化だけでなく、巨核球に巻き込まれた造血細胞の存在を可能にする。骨髄の洗い流しは、骨解剖後、すぐに慎重に行われなければなりません。組織の完全性を最大化するために、骨髄は脱水前に寒天のゲルで囲まれている。この手順に従って、骨髄ブロックは異なる倍率で画像化することも、焦点を当てたイオンビーム走査電子顕微鏡などの他の3D電子顕微鏡分析に使用することもできます。

Research

JoVE Journal

Biology

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