Name: in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00
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Os autores agradecem a Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), pela União Europeia através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (ERDF) e pelo Grant ANR-17-CE14-0001-01 ao H.d.S.

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as normas europeias 2010/63/UE e o Comitê de Ética dos Experimentos Animais da Universidade de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). O protocolo é mostrado esquematicamente na Figura 1.
1. Coleta e fixação da medula óssea (Figura 1A)
ATENÇÃO: Este procedimento inclui substâncias canc...

<ol>
	<li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey:+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation.">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li><li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+(HIV-1).">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+(DMS)+in+megakaryocytes.">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li><li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes.">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li><li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+megakaryocytes+to+platelets:+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream.">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment.">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li><li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels.">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids.">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).</li><li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand.">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li><li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+&#945;-Granules.">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet &#945;-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li><li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emperipolesis,+entosis+and+cell+cannibalism:+Demystifying+the+cloud.">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).</li><li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice.">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation.">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li></ol>

O exame direto dos megacaitos em seu ambiente nativo é essencial para entender a megacariopoiese e a formação de plaquetas. Neste manuscrito, fornecemos um método de microscopia eletrônica de transmissão combinando descarga e fixação da medula óssea por imersão, permitindo dissecar in situ as características de morfologia de todo o processo de morfogênese de megacaiócito ocorrendo na medula óssea.
A lavagem da medula óssea é um passo crítico desse método, pois o suce...

Os megacariócitos são grandes células poliploides especializadas, localizadas na medula óssea, responsáveis pela produção deplaquetas 1. Elas se originam de células-tronco hematopoiéticas através de um intrincado processo de maturação, durante o qual os precursores de megacaitos aumentam progressivamente de tamanho, enquanto passam por extensas alterações morfológicas concomitantes no citoplasma e núcleo2. Durante o amadurecimento, os megacaitos desenvolvem uma série de elementos estruturais distintos, incluindo: um núcleo polilobulado, invaginações da membrana superficial que formam o sistema de membrana de demarcação (DMS), uma zona periférica desprovida de organelas cercadas pela rede citoesqueletal baseada em actina, e inúmeras organelas, incluindo α-granulos, granulos densoss, lysosomes, e múltiplos complexos de Gol. No nível ultraestrutural, uma grande modificação observada é a compartimentação citoplasmática em regiões discretas delimitadas pelo DMS3. Esse extenso fornecimento de membranas alimentará a extensão de longos processos citoplasmados na fase inicial de produção de plaquetas, que depois se remodelará em plaquetas dentro da circulação. Qualquer defeito durante a diferenciação e maturação do megacaito pode afetar a produção de plaquetas em termos de contagem de plaquetas e/ou função plaqueta. 
A microscopia eletrônica de transmissão de camada fina (TEM) tem sido a abordagem de imagem escolhida há décadas fornecendo ultraestrutura de alta qualidade de megacaiócitos que moldaram nossa compreensão da fisiologia da trombopoiese4,5. Este artigo se concentra em um método TEM padronizado que permite capturar o processo de biogênese plaquetária que ocorre in situ dentro do microambiente nativo da medula óssea, que também poderia servir de base para analisar qualquer tipo de célula de medula óssea. Fornecemos exemplos ultraestruturais do desenvolvimento de megacaiócitos de imaturos a totalmente maduros, que estendem processos citoplasmicos à microcirculação dos sinusoides6. Descrevemos também um procedimento fácil para quantificar os diferentes estágios de maturação de megacariote, instruindo sobre a capacidade de regeneração e produção de plaquetas da medula óssea.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td>1670-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 Calcium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids 200 mesh thin-bar</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, England</td>
			<td>T200-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8.20670.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>EM-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolut</td>
			<td>VWR International, France</td>
			<td>20821296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, 90 mm diameter</td>
			<td>Whatman, England</td>
			<td>512-0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding silicone mould</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientific, England</td>
			<td>G3533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>16210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate Leica EMMP</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>705402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo Diamond Knife 45&#176;</td>
			<td>Diatome, Switzerland</td>
			<td>1044797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 2100 Plus TEM microscope</td>
			<td>JEOL, Japan</td>
			<td>EM-21001BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate - Ultrostain 2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>70 55 30 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX-112 resin</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>15320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nadic Methyl Anhydride (NMA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 2%</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>19172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide (1.2-epoxypropane)</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline injectable solution 0.9% NaCl</td>
			<td>C.D.M Lavoisier, France</td>
			<td>MA 575 420 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Surgical steel blade</td>
			<td>Swann-Morton, England</td>
			<td>.0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate - Borax</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>B-9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>84100-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td>Pall Corporation, USA</td>
			<td>514-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>N10-70975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer EM TRIM2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>702801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>656201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>23620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy

A diferenciação e a maturação dos megacaiócitos ocorrem em estreita associação com os componentes celulares e extracelulares da medula óssea. Esses processos são caracterizados pelo aparecimento gradual de estruturas essenciais no citoplasma de megacaitosto, como um núcleo poliploide e polilobulado, uma rede interna de membrana chamada sistema de membrana demarcação (DMS) e os grânulos densos e alfa que serão encontrados em plaquetas circulantes. Neste artigo, descrevemos um protocolo padronizado para o estudo ultraestrutural in situ de megacariócitos murinas utilizando microscopia eletrônica de transmissão (TEM), permitindo a identificação de características-chave que definem seu estágio de maturação e densidade celular na medula óssea. As medulas ósseas são lavadas, fixas, desidratadas no etanol, embutidas em resina plástica e montadas para geração de seções transversais. Seções semifinas e finas são preparadas para observações histológicas e TEM, respectivamente. Este método pode ser usado para qualquer célula de medula óssea, em qualquer instalação EM e tem a vantagem de usar pequenos tamanhos de amostra permitindo a combinação de várias abordagens de imagem no mesmo mouse.

Histologia da medula óssea A observação da histologia azul toluidina da medula óssea sob um microscópio leve é fundamental para analisar rapidamente a arquitetura geral do tecido em termos de, por exemplo, compactação tecidual, continuidade de microvasos e o tamanho e forma de megacaiócitos (Figura 1D). É realizado antes de seções ultrathin para determinar a necessidade de corte mais profundo no bloco de medula óssea. Devido ao seu tamanho gi...

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In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a ultraestrutura dos megacaiócitos in situ usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). As medulas ósseas murinas são coletadas, fixas, embutidas em resina epóxi e cortadas em seções ultrafinas. Após a coloração de contraste, a medula óssea é observada sob um microscópio TEM a 120 kV.

In situ Exploração de Murine Megacaryopoiesis usando Microscopia eletrônica de transmissão

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

O objetivo geral deste procedimento é observar a ultra estrutura de megacaiócitos localizados dentro da medula óssea do rato, e quantificar os diferentes estágios de maturação usando microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução. A principal vantagem é o exame direto dos megacaiócitos no ambiente nativo, que difere dos megacariócitos in vitro cultivados que, como sabemos, não atingem o nível completo de maturação. Depois de colher a tíbia e os fêmures de 12 a 18 semanas de idade C57BL/6 camundongos de acordo com os protocolos padrão, use uma lâmina afiada para remover as epífitas de cada osso.Segurando cada osso com pinças, insira uma agulha de calibre 21 presa a uma seringa de cinco mililitros preenchida com tampão de cacodilato em uma extremidade do osso e coloque a medula óssea em um tubo de coleta de 15 mililitros contendo dois mililitros de tampão de cacodilato fresco. Imediatamente após a descarga, use uma pipeta de plástico para transferir os cilindros de medula óssea em um mililitro de solução fixativa de glutaraldeído fresco para uma incubação de 60 minutos à temperatura ambiente. Para incorporar a medula óssea em agarose, lave as amostras fixas em tampão de cacodilato fresco e use uma pipeta plástica para transferir cuidadosamente a medula óssea para um slide de vidro.Usando uma pipeta quente, aplique rapidamente uma gota de ágar líquido de 2% nos cilindros de medula óssea e coloque imediatamente o deslizamento no gelo por um a dois minutos. Quando o ágar se solidificar, use um microscópio estéreo e uma lâmina afiada para descartar as extremidades de cada cilindro de medula óssea e transfira os blocos de medula aparados para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro contendo um mililitro de tampão de cacodilato. Para a incorporação de resina, fixar os blocos com 1%de tetroxida de ósmio em tampão de cacodilato em uma capa química por uma hora a quatro graus Celsius antes de lavar os blocos uma vez com tampão de cacodilato e uma vez com água destilada.Após a lavagem da água, manche os blocos com acetato de 4%uranyl em água destilada por uma hora seguido de duas lavagens em água destilada como demonstrado. Após a última lavagem, desidrate os blocos através de uma série ascendente de imersões de etanol e água destilada como indicado. Para obter uma infiltração uniforme e polimerização da resina epóxi dentro da medula, incubar os blocos em dois banhos sucessivos de óxido de propileno por 15 minutos antes de incubar as amostras em uma mistura de óxido de propileno 100% e resina epóxi por uma hora em um agitador rotativo lento à temperatura ambiente.Ao final da incubação, adicione resina 100% epóxi aos blocos de medula para uma incubação durante a noite sob as mesmas condições e adicione resina de 100% epóxi para outra incubação de duas horas. No final da incubação, use um microscópio para orientar os blocos de medula em moldes planos de silicone para permitir sua secção transversal subsequente e encher os moldes com resina epóxi antes de colocá-los a 60 graus Celsius por 48 horas. Para seção ultra fina, monte o bloco de amostra em um suporte de ultra microtome e monte o suporte no suporte da amostra.Use um cortador de fresagem de diamante para cortar as amostras em um ângulo de 45 graus para remover o excesso de resina ao redor do tecido antes de usar uma lâmina de faca de diamante equipada com um tanque de água para cortar seções transversais de 500 e 100 nanômetros de espessura para análise histológica e TEM, respectivamente, use um laço para transferir as seções de 500 nanômetros de espessura flutuando na superfície da água em um toboágua de vidro e para depositar os 100 nanômetros de espessura. seções em 200 grades de cobre de barra fina de malha com um filtro de papel por baixo. Para coloração azul toluidina, depois de desenhar as seções de 500 nanômetros de espessura em uma placa quente de 60 graus, adicione 1% de azul toluidina filtrado em água destilada às seções para uma incubação de um a dois minutos. No final da incubação, lave as amostras com água destilada.Quando os slides secarem, use o meio de montagem para montar as amostras com um deslizamento de cobertura e visualizar as amostras por microscopia leve. Para coloração de contraste, rotule as seções de 100 nanômetros com acetato de 4% de urânyl por cinco minutos seguido de três lavagens de cinco minutos com água destilada. Após a última lavagem, manche as seções com citrato de chumbo por três minutos, seguidas por três lavagens de cinco minutos em água destilada como demonstrado.Após a última lavagem, coloque o lado inferior de cada grade em contato com um pedaço de papel filtro primeiro para permitir que as grades sejam colocadas no papel do filtro para secar. Para examinar as seções por TEM, quando as grades secarem, selecione uma baixa ampliação para avaliar a qualidade geral dos preparos. Para determinar o número de megacaiócitos de cada estágio de maturação em cada seção transversal, selecione uma ampliação maior e quantifique o número de megacaiócitos estágio I, II ou III apenas em quadrados totalmente cobertos por tecido.Nesta análise histológica representativa, a continuidade da microápcula de compactação e tamanho e forma dos megacaiócitos podem ser claramente observados. Os megacaitos murinos são divididos em quatro estágios de maturação. Os megacaiócitos estágio I têm um grande núcleo.A presença do estágio detectável mais antigo do sistema de membrana de demarcação também é um critério fundamental desta etapa. No estágio II, começa a formação do grânulo e iniciado o desenvolvimento do sistema de membrana de demarcação. Os megacaitos estágio III são células gigantes com sistemas de membrana de demarcação bem desenvolvidos, territórios citoplasmados claramente definidos e zonas periféricas desprovidas de organelas, e núcleos excêntricos localizados.O estágio pirenocito da maturação do megacaito é caracterizado por um núcleo nu. Como ilustrado, megacariócitos são frequentemente observados em contato com células endoteliais. Na ocasião, os megacaitos formam breves saliências invasivas que penetram no endotélio ou estendem proplatelets para o lúmen sinusoidal.O TEM também permite a visualização de detalhes ultraestruturais, bem como a presença de células hematopoiéticas que foram engolidas pelos megacaiócitos. A lavagem da medula óssea deve ser realizada com cuidado e imediatamente após a dissecação óssea. Para maximizar a integridade do tecido, a medula é cercada com um gel de ágar antes da desidratação.Após este procedimento, os blocos de medula óssea podem ser imagens em diferentes ampliações ou podem ser usados para outras análises de microscopia eletrônica 3D, como microscopia eletrônica de feixe de íons focalizado.

Research

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Biology

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