Name: in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00
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Los autores desean agradecer a Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), la Unión Europea a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y por la Subvención ANR-17-CE14-0001-01 a H.d.S.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas europeas 2010/63/EU y el Comité CREMEAS sobre la Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). El protocolo se muestra esquemáticamente en la Figura 1.
1. Recolección y fijación de médula ósea ( Figura 1A)
PRECAUCIÓN: Est...

<ol>
	<li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey:+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation.">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li><li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+(HIV-1).">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+(DMS)+in+megakaryocytes.">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li><li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes.">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li><li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+megakaryocytes+to+platelets:+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream.">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment.">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li><li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels.">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids.">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).</li><li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand.">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li><li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+&#945;-Granules.">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet &#945;-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li><li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emperipolesis,+entosis+and+cell+cannibalism:+Demystifying+the+cloud.">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).</li><li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice.">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation.">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li></ol>

El examen directo de los megacariocitos en su entorno nativo es esencial para comprender la megacaripoyesis y la formación de plaquetas. En este manuscrito, proporcionamos un método de microscopía electrónica de transmisión que combina el lavado de la médula ósea y la fijación por inmersión, lo que permite diseccionar in situ las características morfológicas de todo el proceso de morfogénesis de megacariocitos que tiene lugar en la médula ósea.
El lavado de la médula ó...

Los megacariocitos son células poliploides grandes especializadas, localizadas en la médula ósea, responsables de la producciónplaquetaria 1. Se originan a partir de células madre hematopoyéticas a través de un intrincado proceso de maduración, durante el cual los precursores de megacariocitos aumentan progresivamente de tamaño, mientras sufren extensos cambios morfológicos concomitantes en el citoplasma y el núcleo2. Durante la maduración, los megacariocitos desarrollan una serie de elementos estructurales distinguibles que incluyen: un núcleo polilobulado, invaginaciones de la membrana superficial que forman el sistema de membrana de demarcación (DMS), una zona periférica desprovista de orgánulos rodeada por la red citoesquelética basada en actina y numerosos orgánulos que incluyen gránulos α, gránulos densos, lisosomas y múltiples complejos de Golgi. A nivel ultraestructural, una modificación importante observada es la compartimentación citoplasmática en regiones discretas delimitadas por el DMS3. Este extenso suministro de membranas alimentará la extensión de largos procesos citoplasmáticos en la fase inicial de la producción de plaquetas, que luego se remodelarán en plaquetas dentro de la circulación. Cualquier defecto durante la diferenciación y maduración de megacariocitos puede afectar la producción de plaquetas en términos de recuento de plaquetas y / o función plaquetaria. 
La microscopía electrónica de transmisión de capa delgada (TEM) ha sido el enfoque de imagen de elección durante décadas proporcionando una ultraestructura de alta calidad de megacariocitos que han dado forma a nuestra comprensión de la fisiología de la trombopoyesis4,5. Este artículo se centra en un método TEM estandarizado que permite capturar el proceso de biogénesis plaquetaria que ocurre in situ dentro del microambiente de la médula ósea nativa, que también podría servir como base para analizar cualquier tipo de célula de la médula ósea. Proporcionamos ejemplos ultraestructurales del desarrollo de megacariocitos desde inmaduros hasta completamente maduros, que extienden los procesos citoplasmáticos en la microcirculación de sinusoides6. También describimos un procedimiento fácil para cuantificar las diferentes etapas de maduración de los megacariocitos, instruyendo sobre la regeneración y la capacidad de producción de plaquetas de la médula ósea.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td>1670-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 Calcium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids 200 mesh thin-bar</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, England</td>
			<td>T200-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8.20670.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>EM-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolut</td>
			<td>VWR International, France</td>
			<td>20821296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, 90 mm diameter</td>
			<td>Whatman, England</td>
			<td>512-0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding silicone mould</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientific, England</td>
			<td>G3533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>16210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate Leica EMMP</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>705402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo Diamond Knife 45&#176;</td>
			<td>Diatome, Switzerland</td>
			<td>1044797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 2100 Plus TEM microscope</td>
			<td>JEOL, Japan</td>
			<td>EM-21001BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate - Ultrostain 2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>70 55 30 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX-112 resin</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>15320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nadic Methyl Anhydride (NMA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 2%</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>19172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide (1.2-epoxypropane)</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline injectable solution 0.9% NaCl</td>
			<td>C.D.M Lavoisier, France</td>
			<td>MA 575 420 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Surgical steel blade</td>
			<td>Swann-Morton, England</td>
			<td>.0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate - Borax</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>B-9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>84100-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td>Pall Corporation, USA</td>
			<td>514-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>N10-70975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer EM TRIM2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>702801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>656201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>23620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy

La diferenciación y maduración de los megacariocitos se producen en estrecha asociación con los componentes celulares y extracelulares de la médula ósea. Estos procesos se caracterizan por la aparición gradual de estructuras esenciales en el citoplasma de megacariocitos, como un núcleo poliploide y polilobulado, una red de membrana interna llamada sistema de membrana de demarcación (DMS) y los gránulos densos y alfa que se encontrarán en las plaquetas circulantes. En este artículo, describimos un protocolo estandarizado para el estudio ultraestructural in situ de megacariocitos murinos utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM), que permite la identificación de características clave que definen su etapa de maduración y densidad celular en la médula ósea. Las médulas óseas se enjuagan, se fijan, se deshidratan en etanol, se incrustan en resina plástica y se montan para generar secciones transversales. Las secciones semidelgado y delgado se preparan para observaciones histológicas y TEM, respectivamente. Este método se puede utilizar para cualquier célula de la médula ósea, en cualquier instalación de EM y tiene la ventaja de utilizar tamaños de muestra pequeños que permiten la combinación de varios enfoques de imagen en el mismo ratón.

Histología de la médula ósea La observación de la histología azul de toluidina de la médula ósea bajo un microscopio de luz es clave para analizar rápidamente la arquitectura general del tejido en términos de, por ejemplo, la compacidad del tejido, la continuidad del microvaso y el tamaño y la forma de los megacariocitos (Figura 1D). Se realiza antes de secciones ultrafinas para determinar la necesidad de cortar más profundamente en el bloqueo ...

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In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la ultraestructura de los megacariocitos in situ utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las médulas óseas murinas se recogen, se fijan, se incrustan en resina epoxi y se cortan en secciones ultrafinas. Después de la tinción por contraste, la médula ósea se observa bajo un microscopio TEM a 120 kV.

In situ Exploración de la megacariopoyesis murina mediante microscopía electrónica de transmisión

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

El objetivo general de este procedimiento es observar la ultraestructura de los megacariocitos ubicados dentro de la médula ósea del ratón y cuantificar las diferentes etapas de maduración utilizando microscopía electrónica de transmisión de alta resolución. La principal ventaja es el examen directo de los megacariocitos en el medio nativo, que difiere de los megacariocitos cultivados in vitro que como sabemos no alcanzan el nivel completo de maduración. Después de cosechar la tibia y los fémures de ratones C57BL / 6 de 12 a 18 semanas de edad de acuerdo con los protocolos estándar, use una cuchilla de afeitar afilada para eliminar las epífisis de cada hueso.Sosteniendo cada hueso con pinzas, inserte una aguja de calibre 21 conectada a una jeringa de cinco mililitros llena de tampón de cacodilato en un extremo del hueso y enjuague la médula ósea en un tubo de recolección de 15 mililitros que contenga dos mililitros de tampón de cacodilato fresco. Inmediatamente después del lavado, use una pipeta de plástico para transferir los cilindros de médula ósea en un mililitro de solución fijadora de glutaraldehído fresco para una incubación de 60 minutos a temperatura ambiente. Para incrustar la médula ósea en agarosa, lave las muestras fijas en tampón de cacodilato fresco y use una pipeta de plástico para transferir cuidadosamente la médula ósea a un portaobjetos de vidrio.Usando una pipeta tibia, aplique rápidamente una gota de agar líquido al 2% a los cilindros de médula ósea e inmediatamente coloque el portaobjetos sobre hielo durante uno o dos minutos. Cuando el agar se haya solidificado, use un microscopio estereoscópico y una cuchilla de afeitar afilada para descartar las extremidades de cada cilindro de médula ósea y transferir los bloques de médula recortados a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de tampón de cacodilato. Para la incrustación de resina, fije los bloques con tetróxido de osmio al 1% en tampón de cacodilato en una campana química durante una hora a cuatro grados centígrados antes de lavar los bloques una vez con tampón de cacodilato y una vez con agua destilada.Después del lavado con agua, manche los bloques con acetato de uranilo al 4% en agua destilada durante una hora, seguido de dos lavados en agua destilada como se ha demostrado. Después del último lavado, deshidratar los bloques a través de una serie ascendente de inmersiones de etanol y agua destilada según lo indicado. Para obtener una infiltración y polimerización uniformes de la resina epoxi dentro de la médula, incube los bloques en dos baños sucesivos de óxido de propileno durante 15 minutos antes de incubar las muestras en una mezcla uno a uno de óxido 100% propileno y resina epoxi durante una hora en un agitador rotativo lento a temperatura ambiente.Al final de la incubación, agregue resina epoxi 100% a los bloques de médula para una incubación nocturna en las mismas condiciones, luego agregue resina epoxi 100% durante otra incubación de dos horas. Al final de la incubación, use un microscopio para orientar los bloques de médula en moldes planos de silicona para permitir su posterior sección transversal y llene los moldes con resina epoxi antes de colocarlos a 60 grados centígrados durante 48 horas. Para una sección ultrafina, monte el bloque de muestra en un soporte de ultra microtomo y monte el soporte en el soporte de muestra.Use un cortador de fresado de diamante para recortar las muestras en un ángulo de 45 grados para eliminar el exceso de resina alrededor del tejido antes de usar una hoja de cuchillo de diamante equipada con un tanque de agua para cortar secciones transversales de 500 y 100 nanómetros de espesor para el análisis histológico y TEM respectivamente, luego use un bucle para transferir las secciones de 500 nanómetros de espesor que flotan en la superficie del agua en un portaobjetos de vidrio y depositar el espesor de 100 nanómetros secciones en rejillas de cobre de 200 barras delgadas de malla con un filtro de papel debajo. Para la tinción de azul toluidina, después de dibujar las secciones de 500 nanómetros de espesor en una placa caliente de 60 grados, agregue azul de toluidina filtrado al 1% en agua destilada a las secciones para una incubación de uno a dos minutos. Al final de la incubación, lave las muestras con agua destilada.Cuando las diapositivas se hayan secado, utilice el medio de montaje para montar las muestras con un cubrebosques y ver las muestras mediante microscopía de luz. Para la tinción de contraste, etiquete las secciones de 100 nanómetros con acetato de uranilo al 4% durante cinco minutos, seguido de tres lavados de cinco minutos con agua destilada. Después del último lavado, manche las secciones con citrato de plomo durante tres minutos, seguido de tres lavados de cinco minutos en agua destilada como se ha demostrado.Después del último lavado, coloque primero el lado inferior de cada rejilla en contacto con un trozo de papel de filtro para permitir que las rejillas se coloquen sobre el papel de filtro para que se sequen. Para examinar las secciones por TEM, cuando las rejillas se hayan secado, seleccione un aumento bajo para evaluar la calidad general de las preparaciones. Para determinar el número de megacariocitos de cada etapa de maduración en cada sección transversal, seleccione un aumento más alto y cuantifique el número de megacariocitos de etapa I, II o III solo en cuadrados que estén completamente cubiertos por tejido.En este análisis histológico representativo, se puede observar claramente la continuidad de los microagósticos de compacidad y el tamaño y la forma de los megacariocitos. Los megacariocitos murinos se dividen en cuatro etapas de maduración. Los megacariocitos en estadio I tienen un núcleo grande.La presencia de la etapa detectable más temprana del sistema de membrana de demarcación es también un criterio clave de esta etapa. En la etapa II, comienza la formación de gránulos y se inicia el desarrollo del sistema de membrana de demarcación. Los megacariocitos en estadio III son células gigantes con sistemas de membrana de demarcación bien desarrollados, territorios citoplasmáticos claramente definidos y zonas periféricas desprovistas de orgánulos y núcleos localizados excéntricamente.La etapa de pirenocitos de maduración de megacariocitos se caracteriza por un núcleo desnudo. Como se ilustra, los megacariocitos se observan con frecuencia en contacto con las células endoteliales. En ocasiones, los megacariocitos forman protuberancias invasivas cortas que penetran en el endotelio o extienden los proplatlets hacia la luz sinusoidal.TEM también permite la visualización de detalles ultra estructurales, así como la presencia de células hematopoyéticas que han sido engullidas por los megacariocitos. El enrojecimiento de la médula ósea debe realizarse con cuidado e inmediatamente después de la disección ósea. Para maximizar la integridad del tejido, la médula se rodea con un gel de agar antes de la deshidratación.Después de este procedimiento, los bloques de médula ósea se pueden obtener imágenes a diferentes aumentos o se pueden usar para otros análisis de microscopía electrónica 3D, como la microscopía electrónica de barrido de haz de iones enfocado.

Research

JoVE Journal

Biology

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