Name: in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Yazarlar teknik yardım için Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund'a teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), Avrupa Birliği tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF) ve Grant ANR-17-CE14-0001-01 tarafından H.d.S.'ye desteklendi.

Tüm hayvan deneyleri Avrupa standartlarına uygun olarak gerçekleştirildi 2010/63/EU ve CREMEAS Strazburg Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). protokol şematik olarak Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Kemik iliği toplama ve sabitleme ( Şekil 1A)
DİkKAT: Bu prosedür kanserojen, mutajenik ve/veya toksik maddeleri iç...

<ol>
	<li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey:+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation.">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li><li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+(HIV-1).">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+(DMS)+in+megakaryocytes.">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li><li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes.">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li><li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+megakaryocytes+to+platelets:+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream.">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment.">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li><li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels.">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids.">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).</li><li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand.">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li><li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+&#945;-Granules.">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet &#945;-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li><li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emperipolesis,+entosis+and+cell+cannibalism:+Demystifying+the+cloud.">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).</li><li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice.">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation.">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li></ol>

Megakaryositlerin kendi ortamlarında doğrudan incelenmesi, megakaryopoez ve trombosit oluşumunu anlamak için gereklidir. Bu yazıda, kemik iliğinde gerçekleşen megakaryosit morfogenezinin tüm sürecinin morfoloji özelliklerini yerinde inceleyerek kemik iliği yıkama ve fiksasyonunu daldırma ile birleştiren bir iletim elektron mikroskopi yöntemi sunuyoruz.
Kemik iliğinin yıkanması bu yöntemin kritik bir adımıdır, çünkü yüksek kaliteli bir yıkamanın başarısı...

Megakaryositler, kemik iliğinde lokalize, trombosit üretiminden sorumlu özel büyük poliploid hücrelerdir1. Sitoplazma ve çekirdek2'dekapsamlı eşlik eden morfolojik değişikliklere uğrarken, megakaryosit öncüllerinin giderek arttığı karmaşık bir olgunlaşma süreci yoluyla hematopoetik kök hücrelerden kaynaklanırlar. Olgunlaşma sırasında, megakaryositler aşağıdakiler de dahil olmak üzere bir dizi ayırt edilebilir yapısal eleman geliştirir: polilobürlenmiş bir çekirdek, sınır membran sistemini (DMS) oluşturan yüzey zarının invaginasyonları, aktin bazlı sitoskeletal ağ ile çevrili organellerden yoksun bir periferik bölge ve α granüller, yoğun granüller, lizozomlar ve çoklu Golgi kompleksleri dahil olmak üzere çok sayıda organel. Ultrayapı düzeyinde, gözlenen önemli bir değişiklik, DMS3tarafından sınırlandırılan ayrık bölgelere sitoplazmik bölmelemedir. Bu geniş membran kaynağı, trombosit üretiminin ilk aşamasında uzun sitoplazmik süreçlerin uzatılmasını körükleyecek ve daha sonra sirkülasyonun içindeki trombositlere dönüşecektir. Megakaryosit farklılaşması ve olgunlaşması sırasındaki herhangi bir kusur trombosit sayısı ve/veya trombosit fonksiyonu açısından trombosit üretimini etkileyebilir. 
İnce tabaka iletim elektron mikroskopisi (TEM), trombopoezis4,5fizyolojisi anlayışımızı şekillendiren megakaryositlerin yüksek kaliteli ultrayapısını sağlayan onlarca yıldır tercih edilen görüntüleme yaklaşımıdır. Bu makale, herhangi bir kemik iliği hücre tipini analiz etmek için de temel teşkil edebilecek, yerli kemik iliği mikroçevriminde in situ meydana gelen trombosit biyogenez sürecini yakalamaya izin veren standartlaştırılmış bir TEM yöntemine odaklanmaktadır. Sitoplazmik süreçleri sinüzoidlerin mikrosirkülasyonuna genişleten olgunlaşmamışlıktan tamamen olgunluğa kadar megakaryositlerin gelişiminin ultrayapısal örneklerini sunuyoruz6. Ayrıca, kemik iliğinin rejenerasyon ve trombosit üretim kapasitesi konusunda talimat veren farklı megakaryosit olgunlaşma aşamalarını ölçmek için kolay bir prosedür açıklıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td>1670-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 Calcium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids 200 mesh thin-bar</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, England</td>
			<td>T200-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8.20670.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>EM-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolut</td>
			<td>VWR International, France</td>
			<td>20821296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, 90 mm diameter</td>
			<td>Whatman, England</td>
			<td>512-0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding silicone mould</td>
			<td>Oxford Instrument, Agar Scientific, England</td>
			<td>G3533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>16210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate Leica EMMP</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>705402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo Diamond Knife 45&#176;</td>
			<td>Diatome, Switzerland</td>
			<td>1044797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 2100 Plus TEM microscope</td>
			<td>JEOL, Japan</td>
			<td>EM-21001BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate - Ultrostain 2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>70 55 30 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX-112 resin</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td>
			<td>15320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nadic Methyl Anhydride (NMA)</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 2%</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>19172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide (1.2-epoxypropane)</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline injectable solution 0.9% NaCl</td>
			<td>C.D.M Lavoisier, France</td>
			<td>MA 575 420 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Surgical steel blade</td>
			<td>Swann-Morton, England</td>
			<td>.0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate - Borax</td>
			<td>Sigma, France</td>
			<td>B-9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>84100-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td>Pall Corporation, USA</td>
			<td>514-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>N10-70975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer EM TRIM2</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>702801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td>
			<td>656201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Ladd Research Industries, USA</td>
			<td>23620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ exploration of murine megakaryopoiesis using transmission electron microscopy

Megakaryositlerin farklılaşması ve olgunlaşması, kemik iliğinin hücresel ve hücre dışı bileşenleri ile yakın ilişki içinde ortaya çıkar. Bu işlemler, poliploid ve polilobulat çekirdek gibi megakaryosit sitoplazmasındaki temel yapıların, sınır membran sistemi (DMS) adı verilen bir iç membran ağının ve dolaşımdaki trombositlerde bulunacak yoğun ve alfa granüllerinin kademeli olarak ortaya çıkması ile karakterize edilir. Bu yazıda, iletim elektron mikroskopisi (TEM) kullanılarak murine megakaryositlerin yerinde ultrayapısal çalışması için standartlaştırılmış bir protokol açıklanmış haline getirilmiş ve kemik iliğindeki olgunlaşma evrelerini ve hücresel yoğunluklarını tanımlayan temel özelliklerin tanımlanmasını sağlamaktır. Kemik ilikleri yıkanır, sabitlenir, etanolde susuzlur, plastik reçineye gömülür ve kesitler oluşturmak için monte edilir. Histolojik ve TEM gözlemleri için sırasıyla yarı ince ve ince bölümler hazırlanır. Bu yöntem herhangi bir kemik iliği hücresi için, herhangi bir EM tesisinde kullanılabilir ve aynı fare üzerinde birkaç görüntüleme yaklaşımının kombinasyonuna izin sağlayan küçük örnek boyutları kullanma avantajına sahiptir.

Kemik iliği histolojisi Kemik iliği toluidin mavi histolojisinin hafif bir mikroskop altında gözlemlenmesi, doku kompaktlığı, mikrovessel sürekliliği ve megakaryositlerin büyüklüğü ve şekli açısından genel doku mimarisini hızlı bir şekilde analiz etmek için anahtardır (Şekil 1D). Kemik iliği bloğunda daha derin kesme ihtiyacını belirlemek için ultra ince bölümlerden önce gerçekleştirilir. Dev boyutları ve nükleer lobül...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Burada, iletim elektron mikroskopisi (TEM) kullanılarak megakaryositlerin yerinde ultrayapısını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Murine kemik ilikleri toplanır, sabitlenir, epoksi reçineye gömülür ve ultra ince bölümlerde kesilir. Kontrast boyamadan sonra kemik iliği 120 kV'da TEM mikroskobu altında gözlenir.

In Situ İletim Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Murine Megakaryopoez Keşfi

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

Bu prosedürün genel amacı, fare kemik iliği içinde bulunan megakaryositlerin ultra yapısını gözlemlemek ve yüksek çözünürlüklü iletim elektron mikroskopisi kullanarak farklı olgunlaşma aşamalarını ölçmektir. Ana avantaj, bildiğimiz gibi tam olgunlaşma seviyesine ulaşmayan in vitro kültürlü megakaryositlerden farklı olan megakaryositlerin doğal ortamda doğrudan incelenmesidir. Tibia ve uyluk kemiğini standart protokollere göre 12 ila 18 haftalık C57BL/ 6 fareleri hasat ettikten sonra, her kemikteki epifizleri çıkarmak için keskin bir jilet kullanın.Her kemiği cımbızla tutarak, kemiğin bir ucuna kakodylat tamponu ile doldurulmuş beş mililitrelik bir şırıngaya bağlı 21 kalibrelik bir iğne yerleştirin ve kemik iliğini iki mililitre taze kakadit tamponu içeren 15 mililitrelik bir toplama tüpüne yıkayın. Yıkamadan hemen sonra, kemik iliği silindirlerini oda sıcaklığında 60 dakikalık bir inkübasyon için bir mililitre taze glutaraldehit fiksatif çözeltisine aktarmak için plastik bir pipet kullanın. Kemik iliğinin agarose'a gömülmesi için, sabit örnekleri taze kakadodylate tamponunda yıkayın ve kemik iliğini dikkatlice cam bir kaydırağa aktarmak için plastik bir pipet kullanın.Sıcak bir pipet kullanarak, kemik iliği silindirlerine hızlı bir şekilde% 2 sıvı agar damla uygulayın ve kaydırağı hemen bir ila iki dakika boyunca buza yerleştirin. Agar katılaştığında, her kemik iliği silindirinin ekstremitelerini atmak ve kesilmiş ilik bloklarını bir mililitre kaodikül tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir stereo mikroskop ve keskin bir jilet kullanın. Reçine gömme için, blokları bir kez kaktüs tamponuyla ve bir kez damıtılmış suyla yıkamadan önce, blokları dört santigrat derecede bir saat boyunca kimyasal bir başlıkta kakadodylate tamponunda% 1 osmiyum tetroksit ile sabitlayın.Su yıkamadan sonra, blokları bir saat boyunca damıtılmış suda% 4 uranil asetat ile lekelendirin ve ardından gösterildiği gibi damıtılmış suda iki yıkama. Son yıkamadan sonra, blokları, belirtildiği gibi artan bir dizi etanol daldırma ve damıtılmış su ile susuz bırakın. İliğin içindeki epoksi reçinesinin düzgün bir infiltrasyonunu ve polimerizasyonunu elde etmek için, numuneleri oda sıcaklığında yavaş bir döner çalkalayıcıda bir saat boyunca% 100 propilen oksit ve epoksi reçine karışımında kuluçkaya yatırmadan önce blokları 15 dakika boyunca iki ardışık propilen oksit banyosunda kuluçkaya yatırın.Kuluçkanın sonunda, aynı koşullar altında bir gecelik inkübasyon için ilik bloklarına% 100 epoksi reçinesi ekleyin, ardından iki saatlik başka bir inkübasyon için% 100 epoksi reçine ekleyin. Kuluçkanın sonunda, ilik bloklarını düz silikon kalıplarda yönlendirmek için bir mikroskop kullanın ve sonraki enine kesitlerine izin verin ve kalıpları 48 saat boyunca 60 santigrat dereceye yerleştirmeden önce epoksi reçine ile doldurun. Ultra ince kesitleme için, numune bloğunu ultra mikrotom desteğine monte edin ve desteği numune tutucuya monte edin.Sırasıyla histolojik ve TEM analizi için enine 500 ve 100 nanometre kalınlığında bölümleri kesmek için su tankı ile donatılmış bir elmas bıçak bıçağı kullanmadan önce doku etrafındaki fazla reçineyi çıkarmak için numuneleri 45 derecelik bir açıyla kırpmak için bir elmas frezeleme kesici kullanın, ardından su yüzeyinde yüzen 500 nanometre kalınlığındaki bölümleri bir cam kaydırağa aktarmak ve 100 nanometre kalınlığında birikmiş parçaları biriktirmek için bir döngü kullanın altında kağıt filtre bulunan 200 örgü ince çubuk bakır ızgara üzerine kesitler. Toluidin mavisi boyama için, 500 nanometre kalınlığındaki bölümleri 60 derecelik bir sıcak plakaya çizdikten sonra, bir ila iki dakikalık bir kuluçka için bölümlere damıtılmış suda filtrelenmiş% 1 toluidin mavisi ekleyin. Kuluçkanın sonunda, numuneleri damıtılmış suyla yıkayın.Slaytlar kuruduğunda, numuneleri bir kapakla monte etmek ve numuneleri hafif mikroskopi ile görüntülemek için montaj ortamını kullanın. Kontrast boyama için, 100 nanometre bölümünü beş dakika boyunca% 4 uranil asetat ve ardından damıtılmış su ile üç beş dakikalık yıkama ile etiketleyin. Son yıkamadan sonra, bölümleri üç dakika boyunca kurşun sitratla lekeleyin, ardından gösterildiği gibi damıtılmış suda üç beş dakikalık yıkama.Son yıkamadan sonra, ızgaraların filtre kağıdına yerleştirilmesini sağlamak için önce her ızgaranın alt tarafını bir filtre kağıdı parçasıyla temas halinde yerleştirin. Bölümleri TEM'e göre incelemek için, ızgaralar kuruduğunda, preparatların genel kalitesini değerlendirmek için düşük bir büyütme seçin. Her enine bölümde olgunlaşmanın her aşamasından megakaryosit sayısını belirlemek için, daha yüksek bir büyütme seçin ve aşama I, II veya III megakaryositlerin sayısını yalnızca tamamen doku tarafından kaplanmış karelerde ölçün.Bu temsili histolojik analizde, kompaktlık mikro kap sürekliliği ve megakaryositlerin büyüklüğü ve şekli açıkça gözlemlenebilir. Murine megakaryositleri olgunlaşmanın dört aşamasına ayrılır. Aşama I megakaryositlerin büyük bir çekirdeği vardır.Sınır membran sisteminin en erken tespit edilebilir aşamasının varlığı da bu aşamanın önemli bir kriteridir. Evre II'de granül oluşumu başlar ve sınır membran sisteminin geliştirilmesine başlanır. Evre III megakaryositler, iyi gelişmiş sınır membran sistemlerine, açıkça tanımlanmış sitoplazmik bölgelere ve organellerden yoksun çevre bölgelerine ve eksantrik olarak yerleştirilmiş çekirdeklere sahip dev hücrelerdir.Megakaryosit olgunlaşmasının pirenite aşaması çıplak bir çekirdek ile karakterizedir. Gösterildiği gibi, megakaryositler endotel hücreleri ile temas halinde sıklıkla gözlenir. Bazen, megakaryositler endotellere nüfuz eden kısa invaziv çıkıntılar oluştururlar veya proplateletleri sinüzoidal lümene uzatırlar.TEM ayrıca ultra yapısal detayların görselleştirilmesine ve megakaryositler tarafından yutulan hematopoetik hücrelerin varlığına izin vermektedir. Kemik iliği kızarması dikkatli ve kemik diseksiyonu sonrası yapılmalıdır. Doku bütünlüğünü en üst düzeye çıkarmak için, ilik dehidratasyondan önce bir agar jeli ile çevrilidir.Bu işlemden sonra kemik iliği blokları farklı büyütmelerde görüntülenebilir veya odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskopisi gibi diğer 3D elektron mikroskopisi için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

2-Foton Mikroskop kullanarak Fare Thymus in situ Görüntüleme

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...