Name: leukodepletion filters-derived cd34+ cells as a cell source to study megakaryocyte differentiation and platelet formation
Uploaded: 2021-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation at JoVE.com

Dette arbejde er blevet støttet af ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.

Kontrol humane prøver blev fremstillet fra volonteer bloddonorer, der gav skriftligt informeret samtykke rekrutteret af blodtransfusion center, hvor forskningen blev udført (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Alle procedurer blev registreret og godkendt af det franske uddannelses- og forskningsministerium og registreret under nummeret AC_2015_2371.Donorerne gav deres godkendelse i CODHECO-nummeret AC- 2008 - 562 samtykkeformularen, for at prøverne kunne anvendes til forskningsformål. Humane undersøgelser bl...

<ol>
	<li>Deutsch, V. R., Tomer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+development+and+platelet+production.">Megakaryocyte development and platelet production.</a> British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).</li><li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors.">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li><li>de Sauvage, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+megakaryocytopoiesis+and+thrombopoiesis+by+the+c-Mpl+ligand.">Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand.</a> Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).</li><li>Almomani, M. H., Mangla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+mice+lacking+the+GPIb-V-IX+complex+question+the+role+of+this+receptor+in+atherosclerosis.">Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).</li><li>Delalat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34++stem+cells+and+their+cotransplantation+with+or+without+mesenchymal+stem+cells.">Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells.</a> Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).</li><li>Yin, T., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+niches+in+bone.">The stem cell niches in bone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).</li><li>Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Guti&#233;rrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+megakaryocytes+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells.</a> Bio-protocol. 5 (21), 1639 (2015).</li><li>Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discarded+leukoreduction+filters:+a+new+source+of+stem+cells+for+research,+cell+engineering+and+therapy.">Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy.</a> Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).</li><li>Lapostolle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulating+hematopoietic+stem+cells+from+steady-state+blood+before+and+after+ex+vivo+culture+are+enriched+in+the+CD34(+)CD133(+)CXCR4(low)+fraction.">Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction.</a> Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).</li><li>Ivanovic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-blood+leuko-depletion+filters+as+a+source+of+CD+34++progenitors+potentially+usable+in+cell+therapy.">Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy.</a> Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor-dependent+enrichment+of+a+megakaryocytic+precursor+with+a+high+potential+to+produce+proplatelets.">Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets.</a> Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).</li><li>Do Sacramento, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+human+platelets+derived+in+vitro+from+CD34(+)+cells.">Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 914 (2020).</li><li>Blin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+model+of+the+platelet-generating+organ:+beyond+bone+marrow+biomimetics.">Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics.</a> Scientific Reports. 6, 21700 (2016).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turbulence+activates+platelet+biogenesis+to+enable+clinical+scale+ex+vivo+production.">Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production.</a> Cell. 174 (3), 636-648 (2018).</li><li>Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+system+for+the+in+vitro+study+of+megakaryocytes+and+functional+platelet+production+using+silk-based+vascular+tubes.">Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).</li></ol>

Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af MK, der er i stand til at udsende proplatelets fra blodafledt HP og til at frigive blodplader fra kulturmediet. HP er fremstillet af LRF, et biprodukt af blodbankerne, der anvendes til at fjerne forurenende leukocytter fra cellulære blodprodukter og undgå bivirkninger. Selv om denne metode er relativt enkel, fortjener et par punkter særlig opmærksomhed.
Aflejring af celleaffjedringen på tæthedensgradientmediet (trin 1.3.1) skal udfø...

Blodplader kommer fra specialiserede store polyploidceller, megakaryocytterne (MK), der stammer fra en konstant og finjusteret produktionsproces kendt som megakaryopoiesis (MKP). På toppen af denne proces er hæmatoopoietic stamceller, som i kontakt med knoglemarvsmiljøet (cytokiner, transskription faktorer, hæmatopoietic niche), vil være i stand til at formere sig og differentiere sig til hæmatopoietic forfædre (HP) i stand til at forpligte sig mod megakaryocytisk vej, hvilket giver anledning til umodne MKs1. Under indflydelse af forskellige cytokiner, og især thrombopoietin (TPO), som er den største cytokin af MKP; MK vil derefter gennemgå to store stadier af modning: endomitose og udvikling af afgrænsningsmembraner (DMS). Denne fuldt modne MK vises derefter tæt på et sinusoidt fartøj, hvor det kan udsende cytoplasmaiske udvidelser, proplatelets, som vil blive frigivet under blodgennemstrømningen og efterfølgende ombygget til funktionelle blodplader2. Kloning af TPO i 19943 gav et løft i undersøgelsen af MKP ved at fremskynde udviklingen af in vitro kultur teknikker, der tillader HP differentiering og MK modning.
Der er mange patologier, der påvirker blodplader, både med hensyn til blodpladenummer (stigning eller fald) og funktion4,5. At være i stand til at generobre MKP in vitro fra human HP kunne forbedre forståelsen af de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for denne proces og i sidste ende den terapeutiske behandling af patienter.
Forskellige kilder til human HP er egnede: navlestrengsblod, knoglemarv og perifert blod6,7,8. Høst af HP fra perifert blod giver færre logistiske og etiske problemer end deres genfinding fra navlestrengsblod eller knoglemarven. HP kan genvindes fra leukaferese eller buffy frakke, men disse kilder er dyre og ikke altid tilgængelige i blodcentre. Andre protokoller, billigere og lettere at udføre, tillader direkte inddrivelse af humane perifere blod mononukleare celler (PBMCs) uden behov for forudgående CD34 drevet isolation4,8. Renheden af megakaryocytter er dog ikke tilfredsstillende med denne metode, og et udvalg af CD34+ celler fra PBMC anbefales til optimal differentiering i MK. Dette førte os til at gennemføre en HP rensning fra leukoreduction filtre (LRF), rutinemæssigt anvendes i blodbanker til at fjerne hvide blodlegemer og dermed undgå bivirkninger immunologiske reaktioner9. Siden 1998 er blodpladekoncentrater blevet automatisk leukodepleted i Frankrig. Ved afslutningen af denne proces kasseres LRF, og alle de celler, der opbevares i LRF, ødelægges. Celler i LRF'er er derfor let tilgængelige uden ekstra omkostninger. LRFs har et cellulært indhold tæt på det, der opnås ved leukferferese eller i buffy frakker, især i deres sammensætning af CD34 + HP gør dem til en bemærkelsesværdig attraktiv kilde10. LRF som en menneskelig HP-kilde har allerede vist sig at give celler intakt funktionel kapacitet11. Denne kilde har den fordel, at den er rigelig og overkommelig for laboratorieforskning. I denne sammenhæng beskrives successivt: i) udvinding og udvælgelse af CD34+ HP fra LRF'er; ii) en tofaset optimeret kultur, som generobrer HP's engagement i den megakarycytiske vej og modningen af MK, der er i stand til at udsende proplatelets iii) en metode til effektiv frigivelse af blodplader fra disse MK; og iv) en procedure for phenotyping MK og kultiverede blodplader.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >7-AAD</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >558819</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACD</td>
			<td>EFS-Alsace</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34-PE&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-081-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34-PECy7</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >25-0349-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD41-Alexa Fluor 488</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >303724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD42a-PE</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td >559919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Apyrase</td>
			<td >EFS-Alsace</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Trucount Tubes</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD34 MicroBead Kit UltraPure, human&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Megafuge 1.OR</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compteur ADAM&#160;</td>
			<td>DiagitalBio</td>
			<td >NA</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotubes</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>55002</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran from leuconostoc spp&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392-50g</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO Hybri-max&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA 0.5 M&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 1,5 mL&#160;</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>616201</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit Steriflip PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow Cytometer</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td >Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human LDL</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL</td>
			<td >Bayer</td>
			<td>MA038EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inserts</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>R4R1401</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow hood&#160;</td>
			<td>Holten</td>
			<td >NA</td>
			<td>Archived product</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LS Columms&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS (-)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-169&#160;</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PGi2</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poches de transferts 600ml&#160;</td>
			<td>Macopharma</td>
			<td>VSE4001XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pre-Separation Filters (30&#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemRegenin 1 (SR1)</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#72344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemSpan Expansion Supplement (100x)</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemSpan-SFEM&#160;</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stericup Durapore 0,22&#181;m PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SCGVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SVF Hyclone&#160;</td>
			<td>Thermos scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringues 30 mL&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS*30ESE1</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filters Millex 0,22&#181;M PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TPO</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 50 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.548.004 PP</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 15 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.001 PP</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulures</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>4055137</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukodepletion filters-derived cd34+ cells as a cell source to study megakaryocyte differentiation and platelet formation

In vitro ekspansion og differentiering af menneskelige hæmatoopoietic forfædre i megakaryocytter i stand til at aflange proplatelets og frigive blodplader giver mulighed for en dybdegående undersøgelse af de mekanismer, der ligger til grund for blodplade biogenese. Tilgængelige kulturprotokoller er for det meste baseret på hæmatoopoietic forfædre stammer fra knoglemarv eller navlestrengsblod rejser en række etiske, tekniske og økonomiske bekymringer. Hvis der allerede er tilgængelige protokoller for at opnå CD34-celler fra perifert blod, foreslår dette manuskript en enkel og optimeret protokol til at opnå CD34 + celler fra leukodepletion filtre let tilgængelige i blodcentre. Disse celler er isoleret fra leukodepletion filtre, der anvendes til fremstilling af blodtransfusion produkter, svarende til otte bloddonationer. Disse filtre er beregnet til at blive kasseret. En detaljeret procedure for indsamling af hæmatoopoietic forfædre identificeret som CD34 + celler fra disse filtre er beskrevet. Metoden til at opnå modne megakaryocytter udvide proplatelets samtidig diskutere deres fænotypiske evolution er også detaljeret. Endelig præsenterer protokollen en kalibreret pipetteringsmetode for effektivt at frigive blodplader, der er morfologisk og funktionelt ligner indfødte. Denne protokol kan tjene som grundlag for evaluering af farmakologiske forbindelser, der virker på forskellige trin i processen for at dissekere de underliggende mekanismer og nærme sig in vivo-blodpladeudbyttet.

Ekstraktion og udvælgelse af CD34+-celler fra LRF'er Her beskriver metoden, der er afledt af Peytour et al.9, ekstraktion og udvælgelse af CD34+ celler fra kasserede LRF'er, der er tilgængelige i blodbanker efter fjernelse af leukocyt. Efter tilbageløbsproceduren genvindes normalt 1,03 x 109 ± 2,45 x 108 celler/LRF (Middel±SEM; n = 155) med en levedygtighed på 94,88 ± 0,10 % (figur 2A i). Ef...

Watch this Scientific Journal Video about Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation at JoVE.com

Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation

Denne protokol beskriver i detaljer alle de trin, der er involveret i at opnå leukofilter-afledte CD34 + hæmatopoietic forfædre og deres in vitro differentiering og modning i proplatelet-bærende megakaryocytter, der er i stand til at frigive blodplader i kulturmediet. Denne procedure er nyttig til dybdegående analyse af cellulære og molekylære mekanismer, der styrer megakaryopoiesis.

Leukodepletion Filtre-afledte CD34 + celler som en celle kilde til at studere Megakaryocyte differentiering og blodplade dannelse

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing ...

Denne protokol foreslår en enkel metode til at opnå menneskelige hæmatooietic forfædre, og for at fremkalde deres differentiering i megakaryocytter. Det kan tjene som grundlag for bedre forståelse af megakaryopoiesis Denne teknik bruger en kilde, men giver den fordel at være overkommelig og rigelig til laboratorieforskning i hæmatopoiesis. Denne metode bruges til bedre at forstå megakaryopoiesis for cellen, der skal anvendes i terapi, de bliver nødt til at blive forberedt i GMP betingelser, som i øjeblikket ikke er tilfældet.Forståelse af trinene, herunder PBMC-samling, kan kun fuldføres fuldt ud med en visuel demonstration. Før du begynder et eksperiment, skal du tilslutte et leukoreduktionsfilter til en tom 600 milliliter overførselspose og til et slangesæt. I et biosikkerhedsskab injiceres 25 milliliter filtreret elutionsbuffer pr. leukoreduktionsfilter i den tomme pose, og brug en 30 milliliter sprøjte til forsigtigt at aspirere posens indhold gennem filteret.Overfør de indsamlede røde blodlegemer til et nyt 50 milliliterrør, og fortynd celleaffjedringen med halvdelen med 2% dextran. Bland godt til at samle blodcellerne og lad cellerne til sediment i 30 minutter ved stuetemperatur. Når de røde blodlegemer har afgjort overføre supernatant til en 50 milliliter rør og fylde røret med to millimolar PBS EDTA opløsning.Overlejr forsigtigt halvdelen af supernatanten på 25 milliliter tæthedsgradientmedium i hvert af to 50 milliliterrør uden at forstyrre gradientoverfladen og adskille cellerne ved densitetsgradientcentrifugering. Brug en engangs pipette til at overføre cellerne fra hver grænseflade til et nyt 50 milliliterrør. Vask cellerne to gange i 50 milliliter af to millimolar PBS EDTA pr vask.Efter den anden vask skal pillerne genbruges i et enkelt 50 milliliter volumen frisk PBS EDTA til tælling. Her er muligt at stoppe proceduren ved at opretholde de indsamlede celler under agitation ved fire grader Celsius i løbet af natten. For CD34 +cellevalg skal cellenummeret bestemmes og opsamles cellerne ved centrifugering og genbruge cellepillen i 300 mikroliter af to millimolar PBS EDTA pr. 10 til ottende celler.Tilføj den passende mængde AF FC receptor blokering reagens og 50 mikroliter af CD34 mikroperler pr 10 til den ottende celler. Efter 30 minutter ved fire grader Celsius, vask cellerne med to millimolar PBS EDTA, og genbruge pellet i 500 mikroliter af friske to millimolar PBS EDTA, pr 10 til de otte celler. Befugte og passende størrelse magnetisk kolonne med PBS EDTA, og derefter tilføje prøven til kolonnen.Vask kolonnen to gange med tre milliliter af to millimolar PBS EDTA pr vask. Før du undviger CD34+-cellerne, med to fem milliliter mængder af to millimolar PBS EDTA per elution. For at vurdere renheden af de magnetiske perle udvalgte celler, tilføje to mikroliter af en passende human anti CD34 antistof til en 100 mikroliter aliquot af de isolerede celler og bland godt før inkubation i 15 minutter ved fire grader celsius.Efter inkubation vaskes cellerne i PBS og genbruges pelleten i 200 mikroliter pbs til analyse af celleprøvens renhed ved flowcytometri. Efter optælling, indsamle CD34 +celler ved centrifugering og straks genbruge pellet i kold opløsning en til en densitet på 10 til de seks celler pr milliliter før hurtigt at tilføje celle suspension til kold opløsning to. Derefter skal kryorøret straks placeres i en minus 80 grader Celsius fryser i 24 timer, før kryorøret overføres til flydende nitrogenopbevaring.I denne repræsentative undersøgelse blev cellerne genvundet ved leukoreduktionsfiltrering som demonstreret med en omtrentlig 95% levedygtighed. Efter magnetisk perlevalg blev der opnået en større end 90% ren CD34+-cellepopulation. Cellespredning falder typisk efter en uges kultur, men uden væsentlige ændringer i celle levedygtighed.Ved dag syv, cd34 +celler bør begynde at udtrykke CD41, en specifik og tidlig markør eller for megakaryocyt og blodplade udvikling. På dag 10 udvikler de fleste celler i kulturen sig typisk til modne CD41, der udtrykker megakaryocytter. Ved dag 13, megakaryocyt pro blodplade forlængelse og blodplade frigivelse kan observeres ved lys mikroskopi.Det samlede antal CD41, CD42, 8 positive blodplader frigivet i kulturen kan derefter kvantificeres ved hjælp af et kalibreret antal fluorescerende perler. Denne metode baner vejen for at forbedre de underliggende mekanismer i megakaryopoiesis og for at øge blodplader udbytter i visuelle. Selvom denne metode virker kedelig, er det meget simpelt, at du bare skal være tålmodig og forberede alle regionerne på forhånd.Selv om vores kritiske bekymringer megakaryopoiesis vi får CD42 celler kan bruges i overhæmatopoietic veje.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Isolering og Differentiering af Stromale vaskulære celler til Beige / Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion i zebrafisk til model akut nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

En 3D-kartografisk beskrivelse af cellen ved Hjælp af Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

Megakaryocyt Kultur i 3D Methylcellulose-baserede Hydrogel at forbedre cellemodning og studere virkningen af stivhed og indespærring

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...