Name: leukodepletion filters-derived cd34+ cells as a cell source to study megakaryocyte differentiation and platelet formation
Uploaded: 2021-05-20T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par la subvention ANR (Agence Nationale de la Recherche) ANR- 17-CE14-0001-1.

Des échantillons humains témoins ont été obtenus auprès de donneurs de sang volontaires qui ont donné leur consentement éclairé écrit recruté par le centre de transfusion sanguine où la recherche a été effectuée (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Toutes les procédures ont été enregistrées et approuvées par le ministère Français de l’Enseignement supérieur et de la Recherche et enregistrées sous le numéro AC_2015_2371.Les donneurs ont donné leur approbation dans le formulaire de consen...

<ol>
	<li>Deutsch, V. R., Tomer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+development+and+platelet+production.">Megakaryocyte development and platelet production.</a> British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).</li><li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors.">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li><li>de Sauvage, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+megakaryocytopoiesis+and+thrombopoiesis+by+the+c-Mpl+ligand.">Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand.</a> Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).</li><li>Almomani, M. 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L., Balduini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+system+for+the+in+vitro+study+of+megakaryocytes+and+functional+platelet+production+using+silk-based+vascular+tubes.">Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).</li></ol>

Ce protocole décrit une méthode de production de MK capable d’émettre des proplaquettaires à partir de HP d’origine sanguine et de libérer des plaquettes du milieu de culture. Les HP sont obtenus à partir de LRF, un sous-produit des banques de sang, utilisé pour éliminer les leucocytes contaminants des produits sanguins cellulaires et éviter les effets indésirables. Bien que cette méthode soit relativement simple, quelques points méritent une attention particulière.
Le dépôt...

Les plaquettes sanguines proviennent de grandes cellules polyploïdes spécialisées, les mégacaryocytes (MK), qui proviennent d’un processus de production constant et affiné connu sous le nom de mégacarylopoïèse (MKP). Au sommet de ce processus se trouvent les cellules souches hématopoïétiques qui, au contact de l’environnement de la moelle osseuse (cytokines, facteurs de transcription, niche hématopoïétique), seront capables de proliférer et de se différencier en progéniteurs hématopoïétiques (HP) capables de s’engager vers la voie mégacaryocytaire, donnant naissance à des MK immatures1. Sous l’influence de diverses cytokines, et en particulier de la thrombopoïétine (TPO), qui est la cytokine majeure de MKP; le MK subira alors deux grandes étapes de maturation : l’endomitose et le développement de membranes de démarcation (DMS). Ce MK complètement mature apparaît alors à proximité d’un vaisseau sinusoïdal dans lequel il peut émettre des extensions cytoplasmiques, les proplaquettaires, qui seront libérées sous le flux sanguin puis remodelées en plaquettes fonctionnelles2. Le clonage du TPO en 19943 a donné un coup de pouce à l’étude du MKP en accélérant le développement de techniques de culture in vitro permettant la différenciation HP et la maturation du MK.
Il existe de nombreuses pathologies affectant les plaquettes sanguines, à la fois en termes de nombre de plaquettes (augmentation ou diminution) et de fonction4,5. Être capable de récapituler la MKP in vitro à partir de HP humaine pourrait améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à ce processus et, en fin de compte, la prise en charge thérapeutique des patients.
Diverses sources de HP humaine conviennent: sang de cordon, moelle osseuse et sang périphérique6,7,8. La récolte de HP dans le sang périphérique soulève moins de problèmes logistiques et éthiques que leur récupération du sang de cordon ombilical ou de la moelle osseuse. HP peut être récupéré de la leucaphérèse ou du pelage bouffant, mais ces sources sont coûteuses et pas toujours disponibles dans les centres de transfusion sanguine. D’autres protocoles, moins coûteux et plus faciles à réaliser, permettent la récupération directe des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) sans qu’il soit nécessaire de s’isoler préalablement par CD344,8. Cependant, la pureté des mégacaryocytes n’est pas satisfaisante avec cette méthode et une sélection de cellules CD34+ de PBMC est recommandée pour une différenciation optimale en MK. Cela nous a amenés à mettre en œuvre une purification HP à partir de filtres de leucoréduction (LRF), couramment utilisés dans les banques de sang pour éliminer les globules blancs et ainsi éviter les réactions immunologiques indésirables9. En effet, depuis 1998, les concentrés de plaquettes sont automatiquement leucodés en France. À la fin de ce processus, les LRF sont jetés et toutes les cellules retenues dans le LRF sont détruites. Les cellules des LRF sont donc facilement disponibles sans frais supplémentaires. Les LRF ont un contenu cellulaire proche de celui obtenu par leucaphérèse ou dans des couches bouffantes, notamment dans leur composition en CD34+ HP ce qui en fait une source remarquablement attrayante10. Il a déjà été démontré que le LRF en tant que source HP humaine fournit aux cellules des capacités fonctionnelles intactes11. Cette source a l’avantage d’être abondante et abordable pour la recherche en laboratoire. Dans ce contexte, cet article décrit successivement : i) l’extraction et la sélection de CD34+ HP à partir de LRF ; ii) une culture optimisée en deux phases, qui récapitule l’engagement de HP dans la voie mégacaryocytaire et la maturation de MK capable d’émettre des proplaquettaires; iii) une méthode pour libérer efficacement les plaquettes de ces MK; et iv) une procédure de phénotypage de MK et de plaquettes cultivées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >7-AAD</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >558819</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACD</td>
			<td>EFS-Alsace</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34-PE&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-081-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34-PECy7</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >25-0349-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD41-Alexa Fluor 488</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >303724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD42a-PE</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td >559919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Apyrase</td>
			<td >EFS-Alsace</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Trucount Tubes</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD34 MicroBead Kit UltraPure, human&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Megafuge 1.OR</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compteur ADAM&#160;</td>
			<td>DiagitalBio</td>
			<td >NA</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotubes</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>55002</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran from leuconostoc spp&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392-50g</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO Hybri-max&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA 0.5 M&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 1,5 mL&#160;</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>616201</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit Steriflip PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow Cytometer</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td >Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human LDL</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL</td>
			<td >Bayer</td>
			<td>MA038EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inserts</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>R4R1401</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow hood&#160;</td>
			<td>Holten</td>
			<td >NA</td>
			<td>Archived product</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LS Columms&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS (-)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-169&#160;</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PGi2</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poches de transferts 600ml&#160;</td>
			<td>Macopharma</td>
			<td>VSE4001XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pre-Separation Filters (30&#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemRegenin 1 (SR1)</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#72344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemSpan Expansion Supplement (100x)</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemSpan-SFEM&#160;</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stericup Durapore 0,22&#181;m PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SCGVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SVF Hyclone&#160;</td>
			<td>Thermos scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringues 30 mL&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS*30ESE1</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filters Millex 0,22&#181;M PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TPO</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 50 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.548.004 PP</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 15 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.001 PP</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulures</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>4055137</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukodepletion filters-derived cd34+ cells as a cell source to study megakaryocyte differentiation and platelet formation

L’expansion et la différenciation in vitro des progéniteurs hématopoïétiques humains en mégacaryocytes capables d’allonger les proplaquettaires et de libérer des plaquettes permettent une étude approfondie des mécanismes sous-jacents à la biogenèse plaquettaire. Les protocoles de culture disponibles sont principalement basés sur des progéniteurs hématopoïétiques dérivés de la moelle osseuse ou du sang de cordon ombilical soulevant un certain nombre de préoccupations éthiques, techniques et économiques. S’il existe déjà des protocoles disponibles pour obtenir des cellules CD34 à partir du sang périphérique, ce manuscrit propose un protocole simple et optimisé pour obtenir des cellules CD34+ à partir de filtres leucodéplétion facilement disponibles dans les centres sanguins. Ces cellules sont isolées à partir de filtres de leucodeplétion utilisés dans la préparation de produits de transfusion sanguine, correspondant à huit dons de sang. Ces filtres sont destinés à être jetés. Une procédure détaillée pour recueillir les progéniteurs hématopoïétiques identifiés comme des cellules CD34+ à partir de ces filtres est décrite. La méthode pour obtenir des mégacaryocytes matures prolongeant les proplaquettaires tout en discutant de leur évolution phénotypique est également détaillée. Enfin, le protocole présente une méthode de pipetage calibrée, pour libérer efficacement des plaquettes morphologiquement et fonctionnellement similaires aux plaquettes natives. Ce protocole peut servir de base à l’évaluation des composés pharmacologiques agissant à différentes étapes du processus pour disséquer les mécanismes sous-jacents et approcher les rendements plaquettaires in vivo.

Extraction et sélection de cellules CD34+ à partir de LRF Ici, la méthode, dérivée de Peytour et al.9, décrit l’extraction et la sélection de cellules CD34+ à partir de LRF rejetées disponibles dans les banques de sang après l’élimination des leucocytes. À la suite de la procédure de rinçage arrière, habituellement 1,03 x10 9 ± 2,45 x10 8 cellules/LRF (Moyenne±SEM; n = 155) sont récupérés avec une viabilité de 94,88 ± 0...

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Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation

Ce protocole décrit en détail toutes les étapes impliquées dans l’obtention de progéniteurs hématopoïétiques CD34+ dérivés de leucofiltres et leur différenciation et maturation in vitro en mégacaryocytes proplaquettaires capables de libérer des plaquettes dans le milieu de culture. Cette procédure est utile pour l’analyse approfondie des mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la mégacaryopoïèse.

Filtres de leucodeplétion Des cellules CD34+ dérivées comme source cellulaire pour étudier la différenciation des mégacaryocytes et la formation de plaquettes

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing ...

Ce protocole propose une méthode simple pour obtenir des progéniteurs hématopoïétiques humains, et pour induire leur différenciation en mégacaryocytes. Elle peut servir de base à une meilleure compréhension de la mégacarylopoïèse Cette technique utilise une source, mais offre l’avantage d’être abordable et abondante pour la recherche en laboratoire sur l’hématopoïèse. Cette méthode est utilisée pour mieux comprendre la mégacaryopoïèse pour la cellule à utiliser dans la thérapie, ils devront être préparés dans les conditions GMP, ce qui n’est pas le cas actuellement.Comprendre les étapes, y compris la collection PBMC, ne peut être complet qu’avec une démonstration visuelle. Avant de commencer une expérience, connectez un filtre de leucoréduction à un sac de transfert vide de 600 millilitres et à un ensemble de tubes. Dans une armoire de biosécurité, injectez 25 millilitres de tampon d’élution filtré par filtre de leucoréduction dans le sac vide et utilisez une seringue de 30 millilitres pour aspirer doucement le contenu du sac à travers le filtre.Transférer les globules rouges prélevés dans un nouveau tube de 50 millilitres et diluer la suspension cellulaire de moitié avec 2% de dextran. Bien mélanger pour agréger les cellules sanguines et laisser les cellules sédimenter pendant 30 minutes à température ambiante. Lorsque les globules rouges se sont déposés, transférez le surnageant dans un tube de 50 millilitres et remplissez le tube avec une solution d’EDTA PBS de deux millimolaires.Superposer doucement la moitié du surnageant sur 25 millilitres de milieu de gradient de densité dans chacun des deux tubes de 50 millilitres sans perturber la surface du gradient et séparer les cellules par centrifugation de gradient de densité. Utilisez une pipette jetable pour transférer les cellules de chaque interface vers un nouveau tube de 50 millilitres. Lavez les cellules deux fois dans 50 millilitres de deux millimolaires PBS EDTA par lavage.Après le deuxième lavage, ressuspendez les granulés dans un seul volume de 50 millilitres de PBS EDTA frais pour le comptage. Ici, il est possible d’arrêter la procédure en maintenant les cellules collectées sous agitation à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour la sélection des cellules CD34+, déterminez le nombre de cellules et collectez les cellules par centrifugation et ressuspendez la pastille cellulaire dans 300 microlitres de deux millimolaires PBS EDTA par 10 à la huitième cellule.Ajouter le volume approprié de réactif bloquant les récepteurs FC et 50 microlitres de microbilles CD34 par 10 aux huitièmes cellules. Après 30 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les cellules avec deux millimolaires PBS EDTA, et resuspendez la pastille dans 500 microlitres de PBS EDTA frais de deux millimolaires, pour 10 aux huit cellules. Humidifiez et dimensionnez correctement la colonne magnétique avec PBS EDTA, puis ajoutez l’échantillon à la colonne.Lavez la colonne deux fois avec trois millilitres de deux millimolaires PBS EDTA par lavage. Avant d’échapper aux cellules CD34+, avec deux volumes de cinq millilitres de deux millimolaires PBS EDTA par élution. Pour évaluer la pureté des cellules sélectionnées par la perle magnétique, ajouter deux microlitres d’un anticorps anti CD34 humain approprié à une aliquote de 100 microlitres des cellules isolées et bien mélanger avant l’incubation pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Après l’incubation, laver les cellules dans du PBS et ressuspend la pastille dans 200 microlitres de PBS pour l’analyse de la pureté de l’échantillon cellulaire par cytométrie en flux. Après le comptage, prélever les cellules CD34+ par centrifugation et ressuspender immédiatement la pastille dans une solution froide une à une densité de 10 à six cellules par millilitre avant d’ajouter rapidement la suspension cellulaire à la solution froide deux. Ensuite, placez immédiatement le tube cryogénique dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant 24 heures avant de transférer le tube cryogénique dans un stockage d’azote liquide.Dans cette étude représentative, les cellules ont été récupérées par filtration de leucoréduction, comme démontré avec une viabilité d’environ 95%. Après sélection des billes magnétiques, une population de cellules CD34+ pure supérieure à 90 % a été obtenue. La prolifération cellulaire diminue généralement après une semaine de culture, mais sans changements significatifs dans la viabilité cellulaire.Au septième jour, les cellules CD34+ devraient commencer à exprimer CD41, un marqueur spécifique et précoce ou pour le développement des mégacaryocytes et des plaquettes. Au jour 10, la majorité des cellules de la culture se développent généralement en mégacaryocytes matures exprimant CD41. Au jour 13, l’extension et la libération plaquettaires pro mégacaryocytaires peuvent être observées par microscopie optique.Le nombre total de plaquettes CD41, CD42, 8 positives libérées dans la culture peut ensuite être quantifié à l’aide d’un nombre étalonné de billes fluorescentes. Cette méthode ouvre la voie à l’amélioration des mécanismes sous-jacents de la mégacaryopoïèse et à l’augmentation des rendements en plaquettes visuelles. Même si cette méthode semble fastidieuse, il est très simple qu’il vous suffit d’être patient et de préparer toutes les régions à l’avance.Bien que nos préoccupations critiques mégacaryopoïèse, nous obtenons des cellules CD42 peuvent être utilisées dans les voies surmatopoïétiques.

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Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Cartographie sort des cellules souches embryonnaires humaines par la formation de tératome

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Un test basé sur Matrigel Tube Formation d&#39;évaluer l&#39;activité Vasculogenic de cellules tumorales

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

L&#39;isolement et la différenciation des cellules stromales vasculaires de cellules Beige / Brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Une description cartographique 3D de la cellule par cryo tomographie par rayons X mous

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

Culture de mégacaryocytes dans un hydrogel 3D à base de méthylcellulose pour améliorer la maturation cellulaire et étudier l’impact de la rigidité et du confinement

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...