Name: leukodepletion filters-derived cd34+ cells as a cell source to study megakaryocyte differentiation and platelet formation
Uploaded: 2021-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי ANR (אגנס נשיונל דה לה Recherche) גרנט ANR- 17-CE14-0001-1.

דגימות אנושיות שליטה התקבלו מתורמי דם וולונטרים שנתנו הסכמה מדעת בכתב שגויסה על ידי מרכז עירוי הדם שבו בוצע המחקר (Etablissement Français du Sang-Grand Est). כל ההליכים נרשמו ואושרו על ידי המשרד הצרפתי להשכלה גבוהה ומחקר ונרשמו תחת המספר AC_2015_2371.התורמים נתנו את אישורם בטופס ההסכמה AC- 2008 - 562, על מנת שהדגימות י?...

<ol>
	<li>Deutsch, V. R., Tomer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+development+and+platelet+production.">Megakaryocyte development and platelet production.</a> British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).</li><li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors.">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li><li>de Sauvage, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+megakaryocytopoiesis+and+thrombopoiesis+by+the+c-Mpl+ligand.">Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand.</a> Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).</li><li>Almomani, M. H., Mangla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+mice+lacking+the+GPIb-V-IX+complex+question+the+role+of+this+receptor+in+atherosclerosis.">Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).</li><li>Delalat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34++stem+cells+and+their+cotransplantation+with+or+without+mesenchymal+stem+cells.">Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells.</a> Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).</li><li>Yin, T., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+niches+in+bone.">The stem cell niches in bone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).</li><li>Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Guti&#233;rrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+megakaryocytes+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells.</a> Bio-protocol. 5 (21), 1639 (2015).</li><li>Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discarded+leukoreduction+filters:+a+new+source+of+stem+cells+for+research,+cell+engineering+and+therapy.">Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy.</a> Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).</li><li>Lapostolle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulating+hematopoietic+stem+cells+from+steady-state+blood+before+and+after+ex+vivo+culture+are+enriched+in+the+CD34(+)CD133(+)CXCR4(low)+fraction.">Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction.</a> Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).</li><li>Ivanovic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-blood+leuko-depletion+filters+as+a+source+of+CD+34++progenitors+potentially+usable+in+cell+therapy.">Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy.</a> Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor-dependent+enrichment+of+a+megakaryocytic+precursor+with+a+high+potential+to+produce+proplatelets.">Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets.</a> Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).</li><li>Do Sacramento, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+human+platelets+derived+in+vitro+from+CD34(+)+cells.">Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 914 (2020).</li><li>Blin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+model+of+the+platelet-generating+organ:+beyond+bone+marrow+biomimetics.">Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics.</a> Scientific Reports. 6, 21700 (2016).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turbulence+activates+platelet+biogenesis+to+enable+clinical+scale+ex+vivo+production.">Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production.</a> Cell. 174 (3), 636-648 (2018).</li><li>Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+system+for+the+in+vitro+study+of+megakaryocytes+and+functional+platelet+production+using+silk-based+vascular+tubes.">Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור MK המסוגלת לפלוט פרופלטלטים מ- HP שמקורה בדם ולשחרר טסיות דם מדיום התרבות. HP מתקבלת מ- LRF, תוצר לוואי של בנקי הדם, המשמשת להסרת לויקוציטים מזהמים ממוצרי דם תאיים ולהימנע מתופעות לוואי. למרות ששיטה זו היא פשוטה יחסית, כמה נקודות ראויות לתשומת לב מיוחדת.
<p class="jove_conte...

טסיות הדם מגיעות מתאי פוליפלואיד גדולים מיוחדים, המגקריוציטים (MK), שמקורם בתהליך ייצור קבוע ומכוון המכונה megakaryopoiesis (MKP). בשיאו של תהליך זה נמצאים תאי גזע hematopoietic אשר, במגע עם סביבת מח העצם (ציטוקינים, גורמי שעתוק, נישה hematopoietic), יוכלו להתרבות ולהבדיל לתוך אבות hematopoietic (HP) מסוגל להתחייב לכיוון המסלול megakaryocytic, יצירת חברי פרל"ק לא בשלים1. בהשפעת ציטוקינים שונים, ובמיוחד תרומבו-אפיטין (TPO), שהוא הציטוקינים העיקריים של MKP; לאחר מכן יעבור הח"כ שני שלבים עיקריים של התבגרות: אנדומיטוזיס ופיתוח ממברנות תיחום (DMS). ח"כ בוגר לחלוטין זה מופיע אז קרוב לכלי סינויד שבו הוא יכול לפלוט הרחבות ציטופלסמיות, את proplatelets, אשר ישוחררו תחת זרימת הדם ולאחר מכן שופץ לתוך טסיות תפקוד2. השיבוט של TPO בשנת 1994 3 סיפקדחיפה במחקר של MKP על ידי האצת הפיתוח של טכניקות תרבות במבחנה המאפשרות בידול HP והתבגרות MK.
ישנן פתולוגיות רבות המשפיעות על טסיות הדם, הן מבחינת מספר טסיות הדם (עלייה או ירידה) והן מבחינת פונקציה4,5. היכולת לשחזר את MKP במבחנה של HP האנושית יכולה לשפר את ההבנה של המנגנונים המולקולריים והתאים שבבסיס תהליך זה ובסופו של דבר את הניהול הטיפולי של המטופלים.
מקורות שונים של HP האנושית מתאימים: דם טבורי, מח עצם, ודם היקפי6,7,8. קצירת HP מדם היקפי מעלה פחות בעיות לוגיסטיות ואתיות מאשר החלמתן מדם טבורי או ממח העצם. ניתן לשחזר את HP מלוקפרזיס או מעיל באפי, אך מקורות אלה יקרים ולא תמיד זמינים במרכזי דם. פרוטוקולים אחרים, פחות יקר וקל לביצוע, מאפשרים התאוששות ישירה של תאים מונונוקלאריים בדם היקפי אנושי (PBMCs) ללא צורך בבידוד מונע CD34 קודם4,8. עם זאת, טוהר המגקריוציטים אינו משביע רצון בשיטה זו ובחירה של תאי CD34+ מ- PBMC מומלצת לבידול אופטימלי לח"כ. זה הוביל אותנו ליישם טיהור HP ממסנני לויקורדוקציה (LRF), המשמש באופן שגרתי בבנקי דם כדי להסיר תאי דם לבנים ובכך למנוע תגובות חיסוניות שליליות9. ואכן, מאז 1998, תרכיזי טסיות דם כבר אוטומטי לויקודל בצרפת. בסוף תהליך זה, LRF נמחקים וכל התאים שנשמרו ב- LRF נהרסים. תאים במפות ה-LR הם, אם כן, זמינים ללא עלות נוספת. ל-LRFs יש תוכן סלולרי קרוב לזה המתקבל על ידי לויקפרזיס או במעילי באפי, במיוחד בהרכב של CD34+ HP, מה שהופך אותם למקור אטרקטיבי להפליא10. LRF כמקור HP אנושי כבר הוכח לספק לתאים יכולות תפקודיות שלמות11. מקור זה יש את היתרון של להיות בשפע ובמחיר סביר למחקר מעבדה. בהקשר זה, מאמר זה מתאר ברציפות: i) את החילוץ והבחירה של CD34+ HP מ- LRFs; ii) תרבות ממוטבת דו-פאזית, אשר משחזרת את המחויבות של HP למסלול המגקריוציטי והבשלת ח"כים המסוגלים לפלוט מפיץ; iii) שיטה לשחרור יעיל של טסיות דם מח"כים אלה; ו-4) הליך של ח"כ פנוטיפינג וטסיות דם תרבותיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >7-AAD</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >558819</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACD</td>
			<td>EFS-Alsace</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34-PE&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-081-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34-PECy7</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >25-0349-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD41-Alexa Fluor 488</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >303724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD42a-PE</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td >559919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Apyrase</td>
			<td >EFS-Alsace</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Trucount Tubes</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD34 MicroBead Kit UltraPure, human&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Megafuge 1.OR</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compteur ADAM&#160;</td>
			<td>DiagitalBio</td>
			<td >NA</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotubes</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>55002</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran from leuconostoc spp&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392-50g</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO Hybri-max&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA 0.5 M&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 1,5 mL&#160;</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>616201</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit Steriflip PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow Cytometer</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td >Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human LDL</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL</td>
			<td >Bayer</td>
			<td>MA038EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inserts</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>R4R1401</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow hood&#160;</td>
			<td>Holten</td>
			<td >NA</td>
			<td>Archived product</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LS Columms&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS (-)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-169&#160;</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PGi2</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poches de transferts 600ml&#160;</td>
			<td>Macopharma</td>
			<td>VSE4001XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pre-Separation Filters (30&#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemRegenin 1 (SR1)</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#72344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemSpan Expansion Supplement (100x)</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemSpan-SFEM&#160;</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stericup Durapore 0,22&#181;m PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SCGVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SVF Hyclone&#160;</td>
			<td>Thermos scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringues 30 mL&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS*30ESE1</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filters Millex 0,22&#181;M PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TPO</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 50 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.548.004 PP</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 15 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.001 PP</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulures</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>4055137</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukodepletion filters-derived cd34+ cells as a cell source to study megakaryocyte differentiation and platelet formation

הרחבת במבחנה ובידול של אבות hematopoietic אנושי לתוך megakaryocytes מסוגל להאריך את מרחיבים ושחרור טסיות מאפשר מחקר מעמיק של המנגנונים שבבסיס ביוגנזה טסיות דם. פרוטוקולי התרבות הזמינים מבוססים בעיקר על אבות hematopoietic נגזר מח עצם או דם טבורי העלאת מספר חששות אתיים, טכניים וכלכליים. אם יש כבר פרוטוקולים זמינים להשגת תאי CD34 מדם היקפי, כתב יד זה מציע פרוטוקול פשוט וממוטב להשגת תאי CD34+ ממסנני לויקו-פלציה הזמינים במרכזי דם. תאים אלה מבודדים ממסנני לויקודלציה המשמשים להכנת מוצרי עירוי דם, המתאימים לשמונה תרומות דם. מסננים אלה אמורים להימחק. הליך מפורט לאיסוף אבות hematopoietic מזוהה כתאי CD34 + ממסננים אלה מתואר. השיטה להשיג megakaryocytes בוגר הרחבת פרופלטלטים תוך כדי דיון האבולוציה הפנוטיפית שלהם מפורט גם. לבסוף, הפרוטוקול מציג שיטת צנרת מכוילת, כדי לשחרר ביעילות טסיות דם הדומות מבחינה מורפולוגית ופונקציונלית לאלה ילידים. פרוטוקול זה יכול לשמש בסיס להערכת תרכובות פרמקולוגיות הפועלות בשלבים שונים של התהליך כדי לנתח את המנגנונים הבסיסיים ולגשת לתשואות טסיות ה- in vivo.

מיצוי ובחירה של תאי CD34+ ממפות LRF כאן, השיטה, נגזרת Peytour ואח'9, מתאר את החילוץ והבחירה של CD34+ תאים מ LRFs זרוק זמין בבנקי דם לאחר הסרת לויקוציטים. בעקבות הליך הזרימה האחורית, בדרך כלל 1.03 x 109 ± 2.45 x 108 תאים / LRF (ממוצע±SEM; n = 155) הם התאוששו עם הכדאיות של 94.88 ± 0.10% (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation at JoVE.com

Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את כל השלבים הכרוכים בהשגת CD34+ hematopoietic שמקורם ב- leukofilter ואת בידול המבחנה וההתבגרות שלהם למגקריוציטים נושאי פרופלטלט המסוגלים לשחרר טסיות דם במדיום התרבותי. הליך זה שימושי לניתוח מעמיק של מנגנונים תאיים ומולקולריים השולטים megakaryopoiesis.

תאי CD34+ שמקורם במסנני לויקודלציה כמקור לתא לחקר בידול מגהקריוציט והיווצרות טסיות דם

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing ...

פרוטוקול זה מציע שיטה פשוטה להשגת אבות hematopoietic אנושי, ועל גרימת הבידול שלהם לתוך megakaryocytes. זה יכול לשמש בסיס להבנה טובה יותר של megakaryopoiesis טכניקה זו משתמשת במקור, אבל מציעה את היתרון של להיות זול ושופע למחקר מעבדה hematopoiesis. שיטה זו משמשת כדי להבין טוב יותר megakaryopoiesis עבור התא לשמש בטיפול הם יצטרכו להיות מוכנים בתנאי GMP, וזה כרגע לא המקרה.הבנת השלבים כולל אוסף PBMC יכולה להסתיים במלואה רק עם הדגמה חזותית. לפני תחילת ניסוי, חבר מסנן לויקורדוקציה לתיק העברה ריק של 600 מיליליטר ולסט צינורות. בארון בטיחות ביולוגי להזריק 25 מיליליטר של חיץ elution מסונן לכל מסנן לויקורדוקציה לתוך השקית הריקה, ולהשתמש מזרק 30 מיליליטר כדי לשאוף בעדינות את תוכן השקית דרך המסנן.העבר את תאי הדם האדומים שנאספו לתוך צינור חדש 50 מיליליטר, לדלל את ההשעיה התא על ידי חצי עם 2%dextran. מערבבים היטב כדי לצבור את תאי הדם ולאפשר לתאים משקעים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. כאשר תאי הדם האדומים התיישבו להעביר את supernatant לצינור 50 מיליליטר ולמלא את הצינור עם פתרון PBS EDTA שני מילימולרי.לכסות בעדינות מחצית supernatant על 25 מיליליטר של צפיפות הדרגתי מדיום בכל אחד משני צינורות 50 מיליליטר מבלי להפריע משטח הדרגתי ולהפריד את התאים על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות. השתמש פיפטה חד פעמית כדי להעביר את התאים מכל ממשק לצינור חדש 50 מיליליטר. לשטוף את התאים פעמיים ב 50 מיליליטר של שני מילימילימטרים PBS EDTA לכל לשטוף.לאחר הכביסה השנייה, resuspend הכדורים בנפח יחיד 50 מיליליטר של PBS EDTA טרי לספירה. כאן ניתן לעצור את ההליך על ידי שמירה על התאים שנאספו תחת עצבנות בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. עבור בחירת CD34+תאים, קבע את מספר התא ואסוף את התאים על ידי צנטריפוגה וקבע מחדש את גלולה התא ב- 300 מיקרוליטרים של PBS EDTA של שני מילימטרים לכל 10 לתאים השמיניים.הוסף את הנפח המתאים של קולטן FC חוסם ריאגנט ו 50 microliters של CD34 מיקרו חרוזים לכל 10 לתאים השמיניים. לאחר 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, לשטוף את התאים עם שני מילי PBS EDTA, ולתכנת מחדש את הכדור ב 500 microliters של PBS EDTA טרי שני מילימולר, לכל 10 עד שמונה תאים. לחות וגודלו המתאים של עמוד מגנטי באמצעות PBS EDTA ולאחר מכן הוסף את הדוגמה לעמודה.לשטוף את העמודה פעמיים עם שלושה מיליליטר של שני מילימיליטר PBS EDTA לכל לשטוף. לפני התחמקות CD34 + תאים, עם שני נפחים חמישה מיליליטר של שני מילימילילר PBS EDTA לכל elution. כדי להעריך את טוהר התאים הנבחרים של החרוז המגנטי, הוסיפו שני מיקרוליטרים של נוגדן אנטי CD34 אנושי מתאים ל-100 מיקרוליטרים של התאים המבודדים וערבבו הרבה לפני הדגירה במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, לשטוף את התאים PBS ו resuspend הכדור ב 200 microliters של PBS לניתוח של טוהר דגימת התא על ידי cytometry זרימה. לאחר הספירה, לאסוף את CD34 + תאים על ידי centrifugation ומיד resuspend הכדור בתמיסה קרה אחד לצפיפות של 10 עד 6 תאים למיליליטר לפני הוספת במהירות את השעיית התא לפתרון קר שני. ואז מיד למקם את צינור ההקפאה במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות לפני העברת צינור ההקפאה לאחסון חנקן נוזלי.במחקר מייצג זה, התאים נמצאו על ידי סינון לויקורדוקציה כפי שהוכח עם כ 95%, כדאיות. לאחר בחירת חרוזים מגנטיים, הושגה אוכלוסיית CD34+תאים טהורה יותר מ- 90%. התפשטות התאים בדרך כלל פוחתת לאחר שבוע של תרבות, אך ללא שינויים משמעותיים בכדאיות התא.ביום השביעי, CD34 + תאים צריכים להתחיל להביע CD41, סמן ספציפי ומוקדם או עבור פיתוח megakaryocyte ו טסיות דם. ביום 10, רוב התאים בתרבות מתפתחים בדרך כלל ל- CD41 בוגר המבטא מגהקריוציטים. ביום 13, הרחבת טסיות דם pro megakaryocyte ושחרור טסיות ניתן לראות על ידי מיקרוסקופיה קלה.המספר הכולל של CD41, CD42, 8 טסיות דם חיוביות שפורסמו לתרבות ניתן לכמת לאחר מכן באמצעות מספר מכויל של חרוזים פלואורסצנטיים. שיטה זו סוללת את הדרך לשיפור המנגנונים הבסיסיים של megakaryopoiesis ולהגדלת התשואות טסיות הדם חזותי. גם אם שיטה זו נראית מייגע, זה פשוט מאוד אתה רק צריך להיות סבלני ולהכין את כל האזורים מראש.למרות החששות הקריטיים שלנו megakaryopoiesis אנו מקבלים תאי CD42 ניתן להשתמש מעל מסלולים hematopoietic.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (pHPL) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

הגורל מיפוי בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי גיבוש תפלצת

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Matrigel מבוסס גיבוש Tube Assay להעריך את פעילות Vasculogenic של תאים סרטניים

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

בידוד והתמיינות של תאי כלי דם לתאי סטרומה בז&#39;ים / Brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

תיאור קרטוגרפי תלת-ממדי של התא על ידי טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של Cryo

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

תרבות Megakaryocyte בהידרוג'ל מבוסס מתילצלולוז תלת מימדי לשיפור התבגרות התאים וחקר ההשפעה של נוקשות וכליאה

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...