Name: leukodepletion filters-derived cd34+ cells as a cell source to study megakaryocyte differentiation and platelet formation
Uploaded: 2021-05-20T14:00:00
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이 작품은 ANR (기관 국가 드 라 Recherche) 그랜트 ANR- 17-CE14-0001-1에 의해 지원되었습니다.

제어 인간 샘플은 연구가 수행 된 수혈 센터에 의해 모집 서면 통보 동의를 준 volonteer 혈액 기증자로부터 얻어졌다 (Etablissement 프랑수아 뒤 상 - 그랜드 에스트). 모든 절차는 프랑스 고등 교육 연구부에 의해 등록및 승인되었으며 AC_2015_2371 번호에 따라 등록되었습니다.기부자는 연구 목적으로 샘플을 사용하기 위해 CODHECO 번호 AC- 2008 - 562 동의 서에 승인을 받았습니다. 헬싱키 선언에 따라 인간 연...

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L., Balduini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+system+for+the+in+vitro+study+of+megakaryocytes+and+functional+platelet+production+using+silk-based+vascular+tubes.">Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).</li></ol>

이 프로토콜은 혈액 유래 HP로부터 프로플라판을 방출하고 배양 배지에서 혈소판을 방출할 수 있는 MK를 생산하는 방법을 설명합니다. HP는 혈액 은행의 부산물인 LRF로부터 수득되며, 세포 혈액 제품에서 백혈구를 오염시키는 것을 제거하고 불리한 반응을 피하는 데 사용됩니다. 이 방법은 비교적 간단하지만 몇 가지 점은 특별한주의를 기울일 자격이 있습니다.
밀도 그라데이...

혈액 혈소판은 메가카요포이시스(MKP)로 알려진 상수 및 미세 조정 된 생산 공정에서 유래한 특수 대형 폴리플로이드 세포, 메가 카요사이클 (MK)에서 비롯됩니다. 이 과정의 정점에는 골수 환경(사이토카인, 전사 인자, 조혈 성 틈새)과 접촉하여 거대 핵증식 경로로 커밋할 수 있는 조혈선(HP)으로 증식하고 분화할 수 있는 조혈 줄기세포가있습니다. MKP의 주요 사이토카인인 다양한 사이토카인 및 특히 혈전포이에틴(TPO)의 영향하에서; MK는 다음 성숙의 두 가지 주요 단계를 겪습니다: 내막과 경계 막의 개발 (DMS). 이 완전히 성숙한 MK는 세포질 확장을 방출할 수 있는 부비동성 혈관에 가깝게 나타나며, 혈류하에서 방출되고 이후에 기능혈소판2로리모델링될 프로플라소판이 된다. 1994년3월 TPO의 복제는 HP 분화 및 MK 성숙을 허용하는 체외 배양 기술의 개발을 가속화함으로써 MKP 연구에 활력을 불어넣습니다.
혈소판 수(증가 또는 감소) 및 기능4,5의 관점에서 혈액 혈소판에 영향을 미치는 많은 병리들이있다. 인간 HP에서 시험관에서 MKP를 다시 수면할 수 있다는 것은 이 과정의 근간을 근로하고 궁극적으로 환자의 치료 관리를 위한 분자 및 세포 기계장치의 이해를 향상시킬 수 있었습니다.
인간의 HP의 다양한 소스는 적합하다 : 코드 혈액, 골수, 말초 혈액6,7,8. 말초 혈액에서 HP를 수확하는 것은 코드 혈액 또는 골수에서 회복하는 것보다 덜 물류 및 윤리적 문제를 제기합니다. HP는 백혈구 또는 버피 코트에서 복구 할 수 있지만, 이러한 소스는 비싸고 혈액 센터에서 항상 사용할 수 없습니다. 다른 프로토콜은, 더 저렴하고 수행하기 쉬운, 이전 CD34 구동절연4에대한 필요없이 인간의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 직접 복구를 허용4,8. 그러나, 메가카요세포의 순도는 이 방법으로 만족스럽지 못하며 PBMC로부터 CD34+ 셀을 선택하여 MK로의 최적의 분화를 권장한다. 이것은 백혈구를 제거하고 따라서 불리한 면역 반응을 피하기 위하여 혈액 은행에서 일상적으로 이용되는 백혈구 감소 필터 (LRF)에서 HP 정화를 구현하기 위하여 저희를지도했습니다. 실제로, 1998 년 이후, 혈소판 농축액은 자동으로 프랑스에서 백류오데트되었습니다. 이 과정이 끝나면 LRF가 폐기되고 LRF에 유지되는 모든 셀이 파괴됩니다. 따라서 LRF의 세포는 추가 비용 없이 쉽게 사용할 수 있습니다. LRF는 백혈구 또는 버피 코트에 의해 얻은 것과 가까운 셀룰러 함량을 가지고 있으며, 특히 CD34 + HP의 구성에서 놀랍도록 매력적인 소스10을만듭니다. 인간 HP 소스로서의 LRF는 이미 세포에 온전한 기능성 용량을 제공하는 것으로입증되었다(11). 이 소스는 실험실 연구에 대 한 풍부 하 고 저렴 한 되 고의 장점이 있다. 이 맥락에서 이 문서에서는 연속적으로 설명합니다: i) LRFs의 CD34+ HP의 추출 및 선택; ii) 2단계 최적화 된 문화, 이는 발판을 방출 할 수있는 MK의 메가 카요 사이클 경로 및 성숙에 HP의 헌신을 재구성; iii) 이러한 MK로부터 혈소판을 효율적으로 방출하는 방법; 및 iv) Phenotyping MK 및 배양 혈소판에 대한 절차.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >7-AAD</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >558819</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACD</td>
			<td>EFS-Alsace</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34-PE&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-081-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34-PECy7</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >25-0349-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD41-Alexa Fluor 488</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >303724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD42a-PE</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td >559919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Apyrase</td>
			<td >EFS-Alsace</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Trucount Tubes</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD34 MicroBead Kit UltraPure, human&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Megafuge 1.OR</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compteur ADAM&#160;</td>
			<td>DiagitalBio</td>
			<td >NA</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotubes</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>55002</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran from leuconostoc spp&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392-50g</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO Hybri-max&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA 0.5 M&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 1,5 mL&#160;</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>616201</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit Steriflip PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow Cytometer</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td >Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human LDL</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL</td>
			<td >Bayer</td>
			<td>MA038EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inserts</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>R4R1401</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow hood&#160;</td>
			<td>Holten</td>
			<td >NA</td>
			<td>Archived product</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LS Columms&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS (-)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-169&#160;</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PGi2</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poches de transferts 600ml&#160;</td>
			<td>Macopharma</td>
			<td>VSE4001XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pre-Separation Filters (30&#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemRegenin 1 (SR1)</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#72344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemSpan Expansion Supplement (100x)</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemSpan-SFEM&#160;</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stericup Durapore 0,22&#181;m PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SCGVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SVF Hyclone&#160;</td>
			<td>Thermos scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringues 30 mL&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS*30ESE1</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filters Millex 0,22&#181;M PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TPO</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 50 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.548.004 PP</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 15 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.001 PP</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulures</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>4055137</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukodepletion filters-derived cd34+ cells as a cell source to study megakaryocyte differentiation and platelet formation

자궁 내 의 팽창 및 발판을 연장하고 혈소판을 방출 할 수있는 거대 karyocytes로 인간의 조혈 선조의 분화는 혈소판 생물 발생의 메커니즘의 심층 연구를 할 수 있습니다. 사용 가능한 배양 프로토콜은 주로 골수 또는 코드 혈액에서 파생 된 조혈 선조에 기초하여 윤리적, 기술적, 경제적 우려를 제기합니다. 말초 혈액에서 CD34 세포를 얻기 위한 이미 유효한 프로토콜이 있는 경우에, 이 원고는 혈액 센터에서 쉽게 유효한 백혈구 필터에서 CD34+ 세포를 얻기 위한 간단하고 최적화된 프로토콜을 제안합니다. 이 세포는 8개의 혈액 기증에 대응하는 수혈 제품의 준비에 사용된 백혈구 필터에서 격리됩니다. 이러한 필터는 폐기해야 합니다. 이러한 필터에서 CD34+ 세포로 확인된 조혈 선조를 수집하는 상세한 절차가 설명되어 있습니다. 그들의 현상 진화를 토론하는 동안 proplatelet을 확장하는 성숙한 megakaryocytes를 얻는 방법 또한 상세합니다. 마지막으로, 프로토콜은 형태학적으로 그리고 기능적으로 네이티브 와 유사한 혈소판을 효율적으로 방출하기 위해 보정된 파이펫팅 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 기본 메커니즘을 해부하고 생체 내 혈소판 수율에 접근하는 과정의 다양한 단계에서 작용하는 약리학적 화합물을 평가하기위한 기초가 될 수 있습니다.

LRF에서 CD34+ 셀 추출 및 선택 여기서, Peytour외. 9로부터유래된 방법은 백혈구 제거 후 혈액 은행에서 사용할 수 있는 버려진 LRFs로부터 CD34+ 세포의 추출 및 선택을 설명한다. 백플러시 절차에 따라, 보통 1.03 x 109 ± 2.45 x 108 세포/LRF(Mean±SEM; n =155)는 94.88 ± 0.10%의 생존율로 회복된다(그림2A i). CD34 양성 선택 ?...

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Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation

이 프로토콜은 배양 배지에서 혈소판을 방출할 수 있는 배혈구를 방출할 수 있는 배혈구를 생성할 수 있는 배혈구-발광식 CD34+ 조혈선 및 체외 분화 및 성숙을 얻는 데 관련된 모든 단계를 자세히 설명합니다. 이 절차는 거대 karyopoiesis를 통제하는 세포 및 분자 기계장치의 심층 분석에 유용합니다.

류코데플션 필터-유래 CD34+ 세포가 메가카요시테 분화 및 혈소판 형성을 연구하는 세포 공급원으로

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing ...

이 프로토콜은 인간 조혈 선조를 얻고, 메가 카요세포로 그들의 분화를 유도하기위한 간단한 방법을 제안한다. 그것은 메가 karyopoiesis의 더 나은 이해를 위한 기초역할을 할 수 있습니다이 기술은 소스를 사용 하지만 조혈에 실험실 연구에 대 한 저렴 하 고 풍부한의 장점을 제공 합니다. 이 방법은 현재 그렇지 않은 GMP 조건에서 준비되어야 할 치료법에 사용되는 세포에 대한 메가 카요포에이스(megakaryopoiesis)를 더 잘 이해하는 데 사용됩니다.PBMC 컬렉션을 포함한 단계를 이해하는 것은 시각적 데모를 통해서만 완전히 완료될 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에, 빈 600 밀리리터 전송 가방에 백과 튜브 세트에 백류 감소 필터를 연결합니다. 바이오 안전 캐비닛에서 루코환원 필터당 25밀리리터의 여과된 용출 버퍼를 빈 백에 주입하고, 30 밀리리터 주사기를 사용하여 필터를 통해 가방 내용을 부드럽게 흡인시합니다.수집된 적혈구를 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮기고, 세포 현탁액을 2%dextran으로 반으로 희석시. 잘 섞어서 혈액 세포를 집계하고 실온에서 30 분 동안 세포가 퇴적할 수 있도록합니다. 적혈구가 50 밀리리터 튜브로 상체를 이송하고 2개의 밀리머 PBS EDTA 용액으로 튜브를 채웁니다.상피체의 절반을 25밀리리터의 밀도 그라데이션 배지에 부드럽게 오버레이하여 그라데이션 표면을 방해하지 않고 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리합니다. 일회용 파이펫을 사용하여 각 인터페이스에서 새로운 50 밀리리터 튜브로 셀을 전송합니다. 세척당 2밀리머 PBS EDTA의 50 밀리리터에서 세포를 두 번 세척하십시오.두 번째 세척 후, 계산에 대한 신선한 PBS EDTA의 단일 50 밀리리터 볼륨에 펠릿을 다시 중단. 여기서는 야간 동안 섭씨 4도에서 교반하에서 수집된 세포를 유지함으로써 절차를 중지할 수 있다. CD34+셀 선택을 위해, 세포 수를 결정하고 10개 세포에서 8세포에 10당 2밀리머 PBS EDTA의 300마이크로리터에서 세포 펠릿을 회수한다.FC 수용체 차단 시약의 적절한 부피와 CD34 마이크로비드 50마이크로리터를 10개당 8번째 세포에 첨가한다. 섭씨 4도에서 30분 후, 2개의 밀리머 PBS EDTA로 세포를 씻고, 10개 세포에서 10개세포당 신선한 2밀리머 PBS EDTA의 500마이크로리터에서 펠릿을 재보습한다. PBS EDTA를 사용하여 자기 컬럼의 가습및 크기를 적절히 조정한 다음 컬럼에 샘플을 추가합니다.세탁당 2밀리미터 PBS EDTA의 3밀리리터로 컬럼을 두 번 세척합니다. CD34+셀을 제외하기 전에 용출당 2밀리미터 PBS EDTA의 5밀리리터 볼륨이 있습니다. 마그네틱 비드 선택 된 세포의 순도를 평가하기 위해, 적절한 인간 항체의 2 개의 마이크로 리터를 분리 된 세포의 100 마이크로 리터 알리쿼트에 추가하고 섭씨 4도에서 15 분 동안 배양하기 전에 잘 섞는다.인큐베이션에 이어, PBS에서 세포를 세척하고 혈동 세포측정에 의한 세포 시료의 순도 분석을 위해 PBS의 200 마이크로리터에서 펠릿을 재중단한다. 계산 후, 원심분리에 의해 CD34+세포를 수집하고 즉시 차가운 용액에서 펠릿을 10의 밀도로 재차리밀리리터당 6개의 세포로 재차 후 2개의 콜드 액스탈에 세포 현탁액을 신속하게 추가한다. 그런 다음 냉동고 튜브를 영하 80도 냉동고에 24시간 동안 즉시 놓은 후 냉동고 튜브를 액체 질소 저장장치로 옮춥시다.이 대표적인 연구에서, 세포는 대략 95%의 생존력으로 입증된 바와 같이 백혈구 감소 여과에 의해 회복되었다. 자기 비드 선택 후, 90% 이상의 순수 CD34+세포 집단이 얻어졌다. 세포 증식은 전형적으로 배양의 1 주일 후에 감소합니다, 그러나 세포 생존성에 있는 중요한 변경없이.7일째까지 CD34+세포는 CD41, 특이적이고 초기 마커 또는 메가카요시테 및 혈소판 개발을 발현하기 시작해야 한다. 10일째에, 배양에 있는 세포의 대다수는 일반적으로 메가karyocytes를 표현하는 성숙한 CD41로 발전합니다. 13일까지, 메가카요세포 프로 혈소판 연장 및 혈소판 방출은 빛 현미경검사법에 의해 관찰될 수 있다.배양에 방출된 CD41, CD42, 8개의 양성 혈소판의 총 수는 형광구의 보정된 수를 사용하여 정량화될 수 있다. 이 방법은 메가카요포에이스의 기본 메커니즘을 강화하고 시각적으로 혈소판 수율을 증가하기위한 길을 열어줍니다. 이 방법이 지루한 것처럼 보이지만 인내심을 가지고 모든 지역을 미리 준비해야합니다.우리의 중요한 관심사 메가 karyopoiesis 비록 우리는 CD42 세포를 얻는 것은 조혈 통로 를 통해 이용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

동물 세럼 - 무료 인간 줄기 세포 배양을위한 효율적인 보충으로 풀링 인간 혈소판 Lysate (pHPL)의 준비

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

기형 종의 형성에 의해 인간 배아 줄기 세포의 운명 매핑

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

종양 세포의 Vasculogenic 활동을 평가 Matrigel 기반 튜브 형성 분석

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

베이지 / Brite 셀에 Stromal 혈관 세포의 분리와 차별화

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

세포 성숙을 개선하고 강성과 감금의 영향을 연구하기 위해 3D 메틸셀룰로오스 기반 하이드로겔의 메가카요세포 배양

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...