Name: leukodepletion filters-derived cd34+ cells as a cell source to study megakaryocyte differentiation and platelet formation
Uploaded: 2021-05-20T14:00:00
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Este trabajo ha sido apoyado por la ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.

Se obtuvieron muestras humanas de control de donantes de sangre voluntarios que dieron su consentimiento informado por escrito reclutados por el centro de transfusión de sangre donde se realizó la investigación (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Todos los procedimientos fueron registrados y aprobados por el Ministerio de Educación Superior e Investigación de Francia y registrados con el número AC_2015_2371.Los donantes dieron su aprobación en el formulario de consentimiento CODHECO número AC- 2008 - 562...

<ol>
	<li>Deutsch, V. R., Tomer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+development+and+platelet+production.">Megakaryocyte development and platelet production.</a> British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).</li><li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors.">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li><li>de Sauvage, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+megakaryocytopoiesis+and+thrombopoiesis+by+the+c-Mpl+ligand.">Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand.</a> Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).</li><li>Almomani, M. 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L., Balduini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+system+for+the+in+vitro+study+of+megakaryocytes+and+functional+platelet+production+using+silk-based+vascular+tubes.">Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).</li></ol>

Este protocolo describe un método para producir MK capaz de emitir proplatelets a partir de HP derivados de la sangre y liberar plaquetas del medio de cultivo. Los HP se obtienen de LRF, un subproducto de los bancos de sangre, utilizado para eliminar los leucocitos contaminantes de los productos sanguíneos celulares y evitar reacciones adversas. Aunque este método es relativamente simple, algunos puntos merecen una atención especial.
La deposición de la suspensión celular en el medio de ...

Las plaquetas sanguíneas provienen de células poliploides grandes especializadas, los megacariocitos (MK), que se originan en un proceso de producción constante y ajustado conocido como megacaropoyesis (MKP). En el ápice de este proceso se encuentran las células madre hematopoyéticas que, en contacto con el entorno de la médula ósea (citoquinas, factores de transcripción, nicho hematopoyético), serán capaces de proliferar y diferenciarse en progenitores hematopoyéticos (HP) capaces de comprometerse hacia la vía megacariocítica, dando lugar a MKs inmaduros1. Bajo la influencia de varias citoquinas, y en particular la trombopoyetina (TPO), que es la citoquina principal de MKP; el MK se someterá entonces a dos etapas principales de maduración: endomitosis y el desarrollo de membranas de demarcación (DMS). Esta MK completamente madura aparece entonces cerca de un vaso sinusoide en el que puede emitir extensiones citoplasmáticas, los proplatlets, que se liberarán bajo el flujo sanguíneo y posteriormente se remodelarán en plaquetas funcionales2. La clonación de TPO en 19943 proporcionó un impulso en el estudio de MKP al acelerar el desarrollo de técnicas de cultivo in vitro que permiten la diferenciación de HP y la maduración de MK.
Existen muchas patologías que afectan a las plaquetas sanguíneas, tanto en cuanto al número de plaquetas (aumento o disminución) como a la función4,5. Ser capaz de recapitular MKP in vitro a partir de HP humano podría mejorar la comprensión de los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a este proceso y, en última instancia, el manejo terapéutico de los pacientes.
Varias fuentes de HP humano son adecuadas: sangre del cordón umbilical, médula ósea y sangre periférica6,7,8. La recolección de HP de la sangre periférica plantea menos problemas logísticos y éticos que su recuperación de la sangre del cordón umbilical o la médula ósea. HP se puede recuperar de la leucoféresis o el pelaje buffy, pero estas fuentes son caras y no siempre están disponibles en los centros sanguíneos. Otros protocolos, menos costosos y más fáciles de realizar, permiten la recuperación directa de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) sin necesidad de aislamiento previo impulsado por CD344,8. Sin embargo, la pureza de los megacariocitos no es satisfactoria con este método y se recomienda una selección de células CD34 + de PBMC para una diferenciación óptima en MK. Esto nos llevó a implementar una purificación HP a partir de filtros de leucorreducción (LRF), utilizados rutinariamente en los bancos de sangre para eliminar los glóbulos blancos y así evitar reacciones inmunológicas adversas9. De hecho, desde 1998, los concentrados de plaquetas se han agotado automáticamente en Francia. Al final de este proceso, se descartan los LRF y se destruyen todas las células retenidas en el LRF. Las células en los LRF están, por lo tanto, fácilmente disponibles sin costo adicional. Los LRF tienen un contenido celular cercano al obtenido por leucoféresis o en pelajes buffy, notablemente en su composición de CD34+ HP convirtiéndolos en una fuente notablemente atractiva10. LRF como fuente humana de HP ya se ha demostrado que proporciona a las células capacidades funcionales intactas11. Esta fuente tiene la ventaja de ser abundante y asequible para la investigación de laboratorio. En este contexto, este artículo describe sucesivamente: i) la extracción y selección de CD34+ HP a partir de LRFs; ii) un cultivo optimizado de dos fases, que recapitula el compromiso de HP en la vía megacariocítica y la maduración de MK capaz de emitir proplatelets; iii) un método para liberar eficientemente las plaquetas de estas MK; y iv) un procedimiento para fenotipar MK y plaquetas cultivadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >7-AAD</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >558819</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACD</td>
			<td>EFS-Alsace</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34-PE&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-081-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34-PECy7</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >25-0349-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD41-Alexa Fluor 488</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >303724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD42a-PE</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td >559919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Apyrase</td>
			<td >EFS-Alsace</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Trucount Tubes</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD34 MicroBead Kit UltraPure, human&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Megafuge 1.OR</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compteur ADAM&#160;</td>
			<td>DiagitalBio</td>
			<td >NA</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryotubes</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>55002</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran from leuconostoc spp&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392-50g</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO Hybri-max&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA 0.5 M&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 1,5 mL&#160;</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>616201</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit Steriflip PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow Cytometer</td>
			<td >BD Bioscience</td>
			<td >Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human LDL</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL</td>
			<td >Bayer</td>
			<td>MA038EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inserts</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>R4R1401</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow hood&#160;</td>
			<td>Holten</td>
			<td >NA</td>
			<td>Archived product</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LS Columms&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>7861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS (-)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-169&#160;</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PGi2</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poches de transferts 600ml&#160;</td>
			<td>Macopharma</td>
			<td>VSE4001XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pre-Separation Filters (30&#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemRegenin 1 (SR1)</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#72344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemSpan Expansion Supplement (100x)</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemSpan-SFEM&#160;</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stericup Durapore 0,22&#181;m PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SCGVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SVF Hyclone&#160;</td>
			<td>Thermos scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringues 30 mL&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS*30ESE1</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filters Millex 0,22&#181;M PVDF</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TPO</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#02822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 50 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.548.004 PP</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 15 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.001 PP</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulures</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>4055137</td>
			<td>Or equivalent material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leukodepletion filters-derived cd34+ cells as a cell source to study megakaryocyte differentiation and platelet formation

La expansión y diferenciación in vitro de progenitores hematopoyéticos humanos en megacariocitos capaces de alargar proplatelets y liberar plaquetas permite un estudio en profundidad de los mecanismos subyacentes a la biogénesis plaquetaria. Los protocolos de cultivo disponibles se basan principalmente en progenitores hematopoyéticos derivados de la médula ósea o la sangre del cordón umbilical que plantean una serie de preocupaciones éticas, técnicas y económicas. Si ya existen protocolos disponibles para obtener células CD34 de sangre periférica, este manuscrito propone un protocolo sencillo y optimizado para obtener células CD34+ a partir de filtros de leucodepleción fácilmente disponibles en los centros sanguíneos. Estas células se aíslan de los filtros de leucodepleción utilizados en la preparación de productos de transfusión de sangre, correspondientes a ocho donaciones de sangre. Estos filtros están destinados a ser descartados. Se describe un procedimiento detallado para recolectar progenitores hematopoyéticos identificados como células CD34 + de estos filtros. También se detalla el método para obtener megacariocitos maduros que extienden los proplatlets mientras se discute su evolución fenotípica. Finalmente, el protocolo presenta un método de pipeteo calibrado, para liberar eficientemente plaquetas que son morfológica y funcionalmente similares a las nativas. Este protocolo puede servir como base para evaluar compuestos farmacológicos que actúan en varios pasos del proceso para diseccionar los mecanismos subyacentes y abordar los rendimientos plaquetarios in vivo.

Extracción y selección de células CD34+ de LRFs Aquí, el método, derivado de Peytour et al.9,describe la extracción y selección de células CD34+ de LRF descartados disponibles en bancos de sangre después de la eliminación de leucocitos. Después del procedimiento de retrolavado, generalmente se recuperan 1,03 x10 9 ± 2,45 x10 8 células/LRF (Media±EM; n = 155) con una viabilidad de 94,88 ± 0,10% (Figura 2A</stro...

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Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation

Este protocolo describe en detalle todos los pasos implicados en la obtención de progenitores hematopoyéticos CD34+ derivados de leucofiltros y su diferenciación y maduración in vitro en megacariocitos portadores de proplatlet que son capaces de liberar plaquetas en el medio de cultivo. Este procedimiento es útil para el análisis en profundidad de los mecanismos celulares y moleculares que controlan la megacaripoyesis.

Los filtros de leucodepleción derivan de células CD34+ como fuente celular para estudiar la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing ...

Este protocolo propone un método sencillo para la obtención de progenitores hematopoyéticos humanos, y para inducir su diferenciación en megacariocitos. Puede servir como base para una mejor comprensión de la megacaropoyesis Esta técnica utiliza una fuente, pero ofrece la ventaja de ser asequible y abundante para la investigación de laboratorio en hematopoyesis. Este método se utiliza para comprender mejor la megacaropoyesis para que la célula se utilice en la terapia, deberá prepararse en las condiciones GMP, lo que actualmente no es el caso.Comprender los pasos, incluida la colección PBMC, solo puede completarse completamente con una demostración visual. Antes de comenzar un experimento, conecte un filtro de leucorreducción a una bolsa de transferencia vacía de 600 mililitros y a un juego de tubos. En un gabinete de bioseguridad, inyecte 25 mililitros de tampón de elución filtrado por filtro de leucorreducción en la bolsa vacía y use una jeringa de 30 mililitros para aspirar suavemente el contenido de la bolsa a través del filtro.Transfiera los glóbulos rojos recolectados a un nuevo tubo de 50 mililitros y diluya la suspensión celular a la mitad con 2% de dextrano. Mezcle bien para agregar las células sanguíneas y permita que las células se sedimenten durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando los glóbulos rojos se hayan asentado, transfiera el sobrenadante a un tubo de 50 mililitros y llene el tubo con dos solución milimolar de PBS EDTA.Superponga suavemente la mitad del sobrenadante sobre 25 mililitros de medio de gradiente de densidad en cada uno de los dos tubos de 50 mililitros sin perturbar la superficie del gradiente y separe las celdas mediante centrifugación por gradiente de densidad. Utilice una pipeta desechable para transferir las células de cada interfaz a un nuevo tubo de 50 mililitros. Lave las células dos veces en 50 mililitros de PBS EDTA milimolar por lavado.Después del segundo lavado, vuelva a gastar los gránulos en un solo volumen de 50 mililitros de PBS EDTA fresco para contar. Aquí es posible detener el procedimiento manteniendo las células recolectadas bajo agitación a cuatro grados centígrados durante la noche. Para la selección de células CD34+, determine el número de células y recoja las células por centrifugación y resuspiva el pellet celular en 300 microlitros de dos milimolares PBS EDTA por 10 a la octava célula.Agregue el volumen apropiado de reactivo bloqueador del receptor FC y 50 microlitros de microperlas CD34 por 10 a las octavas células. Después de 30 minutos a cuatro grados centígrados, lave las células con dos PBS EDTA milimolares y vuelva a gastar el pellet en 500 microlitros de PBS EDTA fresco de dos milimolares, por 10 a las ocho células. Humidifique y dimensione adecuadamente la columna magnética con PBS EDTA y, a continuación, agregue la muestra a la columna.Lave la columna dos veces con tres mililitros de pbS EDTA milimolar por lavado. Antes de eludir las células CD34+, con dos volúmenes de cinco mililitros de dos milimolares PBS EDTA por elución. Para evaluar la pureza de las células seleccionadas de perlas magnéticas, agregue dos microlitros de un anticuerpo humano anti CD34 apropiado a una alícuota de 100 microlitros de las células aisladas y mezcle bien antes de incubar durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.Después de la incubación, lave las células en PBS y resuspenda el pellet en 200 microlitros de PBS para el análisis de la pureza de la muestra celular por citometría de flujo. Después de contar, recoja las células CD34 + por centrifugación e inmediatamente vuelva a suspender el pellet en solución fría uno a una densidad de 10 a las seis celdas por mililitro antes de agregar rápidamente la suspensión celular a la solución fría dos. Luego, coloque inmediatamente el tubo criogénico en un congelador de menos 80 grados Celsius durante 24 horas antes de transferir el tubo criogénico al almacenamiento de nitrógeno líquido.En este estudio representativo, las células fueron recuperadas por filtración de leucorreducción como se demostró con una viabilidad aproximada del 95%. Después de la selección de perlas magnéticas, se obtuvo una población de células CD34+ puras superior al 90%. La proliferación celular generalmente disminuye después de una semana de cultivo, pero sin cambios significativos en la viabilidad celular.Para el séptimo día, las células CD34+ deben comenzar a expresar CD41, un marcador específico y temprano o para el desarrollo de megacariocitos y plaquetas. Para el día 10, la mayoría de las células en el cultivo generalmente se convierten en megacariocitos cd41 maduros que expresan. Para el día 13, la extensión plaquetaria pro megacariocito y la liberación de plaquetas se pueden observar mediante microscopía de luz.El número total de CD41, CD42, 8 plaquetas positivas liberadas en el cultivo se puede cuantificar utilizando un número calibrado de perlas fluorescentes. Este método allana el camino para mejorar los mecanismos subyacentes de la megacaripoyoyesis y para aumentar los rendimientos de plaquetas en visual. Incluso si este método parece tedioso, es muy simple, solo necesita ser paciente y preparar todas las regiones con anticipación.Aunque nuestra megacaropoyesis de preocupaciones críticas, obtenemos células CD42 que se pueden usar en vías hematopoyéticas.

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Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Aislamiento y diferenciación de las células del estroma vascular a células Beige / Brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Una descripción cartográfica 3D de la célula mediante tomografía de rayos X cryo soft

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

Cultivo de megacariocitos en hidrogel 3D a base de metilcelulosa para mejorar la maduración celular y estudiar el impacto de la rigidez y el confinamiento

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...