Name: proplatelet formation dynamics of mouse fresh bone marrow explants
Uploaded: 2021-05-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا جان إيف رينكل وجولي بوشر وباتريشيا لاوفر ومونيك فرويند وكيتي كنيز - هيبرت على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل من قبل ANR (وكالة الوطنية للريشة) منح ANR-17-CE14-0001-01 و ANR-18-CE14-0037.

وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمعايير الأوروبية 2010/63/EU ولجنة CREMEAS المعنية بأخلاقيات التجارب على الحيوانات التابعة لجامعة ستراسبورغ (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. إعداد الكواشف
<ol><li>إعداد الكواشف كما هو موضح في الجدول 1.<ol>
<li>للسهم I، حل كل ...

<ol>
	<li>Thiery, J. P., Bessis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+platelet+genesis;+in+vitro+study+by+cinemicrophotography.">Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography.</a> Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).</li><li>Becker, R. P., De Bruyn, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmural+passage+of+blood+cells+into+myeloid+sinusoids+and+the+entry+of+platelets+into+the+sinusoidal+circulation:+A+scanning+electron+microscopic+investigation.">The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation.</a> American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).</li><li>Muto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scanning+and+transmission+electron+microscopic+study+on+rat+bone+marrow+sinuses+and+transmural+migration+of+blood+cells.">A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells.</a> Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).</li><li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand.">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li><li>Kaushansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+megakaryocyte+progenitor+expansion+and+differentiation+by+the+c-Mpl+ligand+thrombopoietin.">Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin.</a> Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors.">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li><li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation.">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).</li><li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes.">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment.">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation.">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice.">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li><li>Ortiz-Rivero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3G,+through+its+GEF+activity,+induces+megakaryocytic+differentiation+and+proplatelet+formation.">C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).</li><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow.">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+MYH9-related+disease:+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A.">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238-250 (2012).</li><li>Malara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+structure+and+nano-mechanics+determine+megakaryocyte+function.">Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function.</a> Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).</li><li>Balduini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+receptors,+extracellular+proteins+and+myosin+IIA+orchestrate+proplatelet+formation+by+human+megakaryocytes.">Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).</li></ol>

هنا نحن نصف طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة في المختبر لتقييم كفاءة الخلايا الضخمة لتوسيع الصفائح التي نمت في نخاع العظام. نموذج نخاع العظم explant للفأر لديه أربع مزايا رئيسية. أولا، لا توجد مهارات تقنية متقدمة مطلوبة. ثانيا، الوقت اللازم للحصول على صفائح عملاقة تمتد كريات الدم قصيرة جدا، ?...

تم تطوير تقنية explant نخاع العظم لأول مرة من قبل ثيري واسيس في عام 1956 لوصف تشكيل ملحقات السيتوبلازمية megakaryocyte الفئران كحدث أولي في تشكيل الصفائح الدموية1. باستخدام النقيض من المرحلة والتقنيات السينمائية ، وصف هؤلاء المؤلفون تحويل الخلايا الضخمة المستديرة الناضجة إلى خلايا خثارية "تشبه الحبار" مع ملحقات السيتوبلازمية التي تظهر حركات ديناميكية للاستطالة والانكماش. تصبح هذه الأسلحة أرق تدريجيا حتى تصبح شكل خيوط مع تورمات صغيرة على طول الذراعين وعلى النصائح. هذه الاستطالات megakaryocyte نموذجية، التي تم الحصول عليها في المختبر وفي وسائل الإعلام السائلة، لديها بعض أوجه التشابه مع الصفائح الدموية لوحظ في نخاع العظام الثابتة، حيث megakaryocytes تبرز امتدادات طويلة من خلال الجدران sinusoid في الدورة الدموية2،3. اكتشاف والاستنساخ من TPO في عام 1994، سمح للتمييز بين megakaryocytes في الثقافة قادرة على تشكيل ملحقات proplatelet تشبه تلك الموصوفة في نخاع العظم explants4،5،6. ومع ذلك ، فإن نضوج megakaryocyte أقل كفاءة بكثير في ظروف الثقافة ، ولا سيما شبكة الأغشية الداخلية الواسعة من خلايا العظم الضخمة الناضجة المتخلفة في الخلايا الضخمة المستزرعة ، مما يعيق الدراسات على آليات التكوين الحيوي للصفائح الدموية7،8.
نحن بالتفصيل هنا نموذج explant نخاع العظم، استنادا إلى ثيري واسيس، لمتابعة في الوقت الحقيقي تشكيل proplatelet من الخلايا العملاقة الماوس، والتي نضجت تماما في بيئتها الأصلية، وبالتالي التحايل على القطع الأثرية في المختبر ممكن وسوء التفسير. يتم تقديم النتائج التي تم الحصول عليها في الفئران البالغة البرية لتوضيح قدرة الخلايا العملاقة على تمديد الصفائح ، ومورفولوجياها وتعقيد الصفائح. كما نقدم استراتيجية قياس سريع للتحقق من الجودة لضمان دقة البيانات ومتانتها خلال عملية تسجيل الخلايا الضخمة. البروتوكول المعروض هنا هو أحدث إصدار من الأسلوب المنشور كفصل كتاب سابقا9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+05S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverwall Incubation Chambers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70324-02</td>
			<td>Depth : 0,2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-3375</td>
			<td>pH adjusted to 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>VIALEBEX</td>
			<td>authorized medication : n&#176; 3400956446995</td>
			<td>20% (200mg/mL -100mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BVBW8448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72200-40</td>
			<td>22 mm x 55 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems SA, Westlar, Germany</td>
			<td>DMI8 - 514341</td>
			<td>air lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope camera</td>
			<td>Leica Microsystems SA, Westlar, Germany</td>
			<td>K5 CMS GmbH -14401137</td>
			<td>image resolution : 4.2 megapixel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S2160-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSG 100x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>1037-016</td>
			<td>10,000 units/mL penicillin, 10,000 &#956;g/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D (+)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proplatelet formation dynamics of mouse fresh bone marrow explants

المرحلة الأخيرة من megakaryopoiesis يؤدي إلى ملحقات السيتوبلازمية من megakaryocytes ناضجة، ما يسمى proplatelets. وقد تم تعلم الكثير عن تشكيل البربليتليت باستخدام في المختبر- megakaryocytes المتمايزة؛ ومع ذلك ، هناك أدلة متزايدة على أن نظم الثقافة التقليدية لا تلخص بأمانة عملية التمايز / النضج التي تأخذ أماكن داخل نخاع العظام. في هذه المخطوطة، نقدم طريقة تفسيرية وصفها في البداية في عام 1956 من قبل ثيري وسيس لتصور الخلايا الضخمة التي نضجت في بيئتها الأصلية، وبالتالي التحايل على القطع الأثرية المحتملة والتفسيرات الخاطئة. يتم جمع نخاع العظم الطازج عن طريق مسح عظم الفخذ من الفئران، وشرائح إلى أقسام عرضية 0.5 ملم، ووضعها في غرفة حضانة في 37 درجة مئوية تحتوي على عازل الفسيولوجية. تصبح الخلايا الضخمة مرئية تدريجيا في المحيط المكشوف ويتم ملاحظتها حتى 6 ساعات تحت مجهر مقلوب إلى جانب كاميرا فيديو. مع مرور الوقت ، تغير الخلايا الضخمة شكلها ، مع بعض الخلايا التي لها شكل كروي والبعض الآخر تطوير ملحقات سميكة أو تمديد العديد من الصفائح الرفيعة مع تفريع واسع النطاق. وتجرى تحقيقات نوعية وكمية على السواء. هذه الطريقة لديها ميزة كونها بسيطة، استنساخها، وبسرعة كما megakaryocytes عديدة موجودة، وكلاسيكيا نصفها شكل proplatelets في 6 ساعات مقارنة مع 4 أيام لmegakaryocytes الماوس المثقف. بالإضافة إلى دراسة الفئران المتحولة ، فإن التطبيق المثير للاهتمام لهذه الطريقة هو التقييم المباشر للعوامل الدوائية على عملية تمديد الصفائح الدموية ، دون التدخل في عملية التمايز التي قد تحدث في الثقافات.

النتائج النوعية. في بداية التجربة، يتم ضغط جميع الخلايا في قسم نخاع العظم. يستغرق 30 دقيقة للخلايا لتصبح مرئية بوضوح على هامش explants. ثم يمكن التعرف على الخلايا الضخمة من خلال حجمها الكبير ويمكن بعد ذلك دراسة تطورها مع مرور الوقت (الحجم والشكل والديناميكية وتمديد الصفائح الدموية وإط...

Watch this Scientific Journal Video about Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants at JoVE.com

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

هنا، ونحن بالتفصيل طريقة explant نخاع العظم، من إعداد العينة لتحليل الشريحة المجهرية، لتقييم قدرة megakaryocytes التي تمايزت في بيئتها الفسيولوجية لتشكيل الصفائح.

ديناميات تشكيل الصفائح الدموية من الفأر نخاع العظم الطازج Explants

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the ...

الهدف العام لهذا الإجراء هو متابعة تشكيل البروبليت في الوقت الحقيقي من الخلايا العملاقة الماوس ، والتي نضجت في بيئتها الأصلية. هذه الطريقة لديها ميزة كونها بسيطة، استنساخها، وبسرعة. يمكن للمرء أن يحلل العديد من الخلايا الضخمة وتصور تشكيل الصفائح في ست ساعات فقط ، بدلا من الانتظار لليوم الأول من الثقافة كما هو الحال بالنسبة لخلايا الماوس الضخمة في المختبر.تطبيق مثير للاهتمام من هذه الطريقة هو إمكانية لدراسة تأثير العلاج الصيدلاني أو الطفرة الوراثية، وتحديدا في خطوة تمديد البربليتليت. وهنا لا يوجد أي تدخل في عملية التمايز، كما هو الحال في الثقافة داخل المختبر. يساعد هذا الفيديو على ضمان هذه الخطوات الرئيسية لمسح وقطع نخاع العظم.كما أنه يشرح كيفية تصنيف مورفولوجيا وmegakaryocytes ، وهو أمر مفيد حقا لوصف العيوب في مرض الجلطات الدموية. للبدء، دافئة العازلة التيرود في 37 درجة مئوية، وبدوره على غرفة التدفئة من المجهر لجعل درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. إعداد جميع الأدوات اللازمة، مثل جهاز توقيت، غرف الحضانة، وخمسة محاقن قياس 21 ملليلتر، ملقط، شفرة حلاقة، ماصة باستور، الشرائح الزجاجية، وأنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر.قم بغسل نخاع العظم بميليلترين من العازلة في Tyrode عن طريق إدخال إبرة قياس 21 في فتحة عظم الفخذ على جانب الركبة ، واضغط ببطء على المكبس لاسترداد أسطوانة نخاع سليمة. استخدام ماصة بلاستيكية لمدة ثلاث دقائق لتر لنقل بعناية وبلطف نخاع العظام سليمة على شريحة زجاجية. قطع نهايات النخاع التي قد تكون مضغوطة في وقت تدفق.ثم قطع أجزاء عرضية رقيقة من سمك 0.5 ملليمتر باستخدام شفرة حلاقة حادة لتجنب إتلاف megakaryocytes. باستخدام ماصة بلاستيكية، اجمع 10 أقسام في أنبوب ملليلتر واحد يحتوي على المخزن المؤقت لتيرود. نقل بعناية أقسام إلى غرفة حضانة بقطر 13 ملليمتر.يستنشق العازلة وضبط حجم إلى 30 ميكرولتر من العازلة التيرود تكملها مع مصل الماوس 5٪. ضع المقاطع على مسافة. ختم غرفة لاصقة الذاتي مع زلة غطاء 22 في 55 ملليمتر، يميل زلة الغطاء لتجنب تشكيل فقاعات الهواء.ضع الغرفة في غرفة التدفئة عند 37 درجة مئوية. بدء الكرونومتر وتشغيل التجربة لمدة ست ساعات في 37 درجة مئوية، وجعل أشرطة الفيديو لتسجيل التحول من megakaryocytes. بعد 30 دقيقة، تهاجر خلايا النخاع تدريجيا إلى محيط الزرع الذي يشكل طبقة أحادية.بعد ساعة واحدة من الحضانة ، يمكن التعرف على الخلايا الضخمة من خلال حجمها الكبير والنوى متعددة الأضلاع. يزداد عدد الخلايا العملاقة بعد ثلاث ساعات من الحضانة ، وبعضها له امتدادات طويلة. رسم خريطة لتعريب كل قسم في غرفة الحضانة.بعد ساعة واحدة، حدد الخلايا الضخمة المرئية، وهي خلايا عملاقة متعددة الأضلاع على أطراف كل قسم، ورسم مواقعها على الرسم. كرر هذا الإجراء بعد ثلاث وست ساعات. يتم حساب الخلايا الضخمة يدويا وتصنيفها وفقا لمورفولوجيا في ثلاث وست ساعات بعد ختم غرفة الحضانة.يتم تصنيفها على أنها صغيرة وكبيرة مع نية سميكة ، وتمتد بروبليت. بمساعدة رسم الخرائط ، يمكن متابعة تطورها مع مرور الوقت. يتم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية من كل فئة في كل وقت مراقبة.كلاسيكيا، نصف الخلايا الضخمة المرئية في المحيط تمتد الصفائح في ست ساعات لنخاع عظم الفأر البرية نوع. وأعقب مصير megakaryocytes جولة من خلال التقاط الصور المتتابعة مع مرور الوقت لتصوير كيف أنها تشكل proplatelets. شيء مهم أن نتذكر عند محاولة هذا الإجراء هو الحفاظ على explants في 37 درجة مئوية لمدة التجربة.يمكن لدرجة حرارة مختلفة تغيير النتائج. ومن المثير للاهتمام، يمكن استخدام بروتوكول الزرع بعد تجارب المجهر الانطوائية. في النهاية سوف تكون الخلايا الضخمة في explants نخاع العظم الفلورسنت بشكل طبيعي، وسلوكهم يمكن التحقيق بسهولة.وهذا يجعل من الممكن الجمع بين معاملة مختلفة على نفس الحيوانات وبالتالي تقليل عدد الفئران. في الختام ، فإن طريقة الاختلاط سريعة وبسيطة ، وتوفر العديد من المعلومات حول قدرة الخلايا العملاقة الطبيعية على الصفائح الخارجية. النتيجة النوعية والكمية الناتجة هي المفتاح لفهمنا لمرض الجلطات الدموية.في سياق فسيولوجي أو مرضي.

proplatelet-formation-dynamics-of-mouse-fresh-bone-marrow-explants

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

ثقافة الخلايا الجذعية من الدم النخاعي السلائف نخاع العظم

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

جيل من نخاع عظام الفئران الخلايا الجذعية المشتقة للاستخدام في 2 الفوتون التصوير

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

صاروخ موجه من الخلايا المكونة للدم في نخاع العظام

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

ناقضة العظم اشتقاق من الفأر نخاع العظم

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

تعبير البروتينات الفلورية الانصهار في مورين الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

العزلة ، تنقيه ، والتمايز من السلائف العظمية من نخاع العظم الفئران

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

في فيفو تصوير فوتونين لخلايا ميجاكاريوسيت وبروبليتس في نخاع عظم جمجمة الفأر

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...