Name: proplatelet formation dynamics of mouse fresh bone marrow explants
Uploaded: 2021-05-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par la bourse ANR (Agence Nationale de la Recherche) ANR-17-CE14-0001-01 et ANR-18-CE14-0037.

Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux normes européennes 2010/63/UE et au Comité CREMEAS d’Éthique de l’Expérimentation Animale de l’Université de Strasbourg (Comité Régional d’Ethique en Matière d’Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Préparation des réactifs
<ol><li>Préparer les réactifs comme décrit dans le tableau 1.<ol>
<li>Pour le Stock I, dissoudre chaque poudre séparément. S’assurer que l’osmolar...

<ol>
	<li>Thiery, J. P., Bessis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+platelet+genesis;+in+vitro+study+by+cinemicrophotography.">Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography.</a> Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).</li><li>Becker, R. P., De Bruyn, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmural+passage+of+blood+cells+into+myeloid+sinusoids+and+the+entry+of+platelets+into+the+sinusoidal+circulation:+A+scanning+electron+microscopic+investigation.">The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation.</a> American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).</li><li>Muto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scanning+and+transmission+electron+microscopic+study+on+rat+bone+marrow+sinuses+and+transmural+migration+of+blood+cells.">A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells.</a> Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).</li><li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand.">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li><li>Kaushansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+megakaryocyte+progenitor+expansion+and+differentiation+by+the+c-Mpl+ligand+thrombopoietin.">Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin.</a> Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors.">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li><li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation.">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).</li><li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes.">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment.">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation.">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice.">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li><li>Ortiz-Rivero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3G,+through+its+GEF+activity,+induces+megakaryocytic+differentiation+and+proplatelet+formation.">C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).</li><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow.">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+MYH9-related+disease:+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A.">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238-250 (2012).</li><li>Malara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+structure+and+nano-mechanics+determine+megakaryocyte+function.">Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function.</a> Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).</li><li>Balduini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+receptors,+extracellular+proteins+and+myosin+IIA+orchestrate+proplatelet+formation+by+human+megakaryocytes.">Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).</li></ol>

Nous décrivons ici une méthode in vitro simple et peu coûteuse pour évaluer l’efficacité des mégacaryocytes pour étendre les proplaquettaires qui se sont développées dans la moelle osseuse. Le modèle d’explantation de moelle osseuse pour souris présente quatre avantages principaux. Tout d’abord, aucune compétence technique avancée n’est requise. Deuxièmement, le temps nécessaire pour obtenir des proplaquettaires étendant les mégacaryocytes est assez court, seulement 6 heures pour la mét...

La technique de l’explantation de moelle osseuse a été développée pour la première fois par Thiéry et Bessis en 1956 pour décrire la formation d’extensions cytoplasmiques mégacaryocytaires de rat comme un événement initial dans la formation de plaquettes1. En utilisant le contraste de phase et des techniques cinématographiques, ces auteurs ont caractérisé la transformation de mégacaryocytes ronds matures en cellules thrombocytogènes « semblables à des calmars » avec des extensions cytoplasmiques montrant des mouvements dynamiques d’allongement et de contraction. Ces bras deviennent progressivement plus minces jusqu’à ce qu’ils deviennent filiformes avec de petits gonflements le long des bras et aux extrémités. Ces allongements typiques des mégacaryocytes, obtenus in vitro et en milieu liquide, présentent certaines similitudes avec les plaquettes observées dans la moelle osseuse fixe, où les mégacaryocytes dépassent de longues extensions à travers les parois sinusoïdales dans la circulation sanguine2,3. La découverte et le clonage du TPO en 1994, ont permis de différencier les mégacaryocytes en culture capables de former des extensions proplaquettaires ressemblant à celles décrites dans les explantes de moelle osseuse4,5,6. Cependant, la maturation des mégacaryocytes est beaucoup moins efficace dans les conditions de culture, notamment le vaste réseau membranaire interne des mégacaryocytes matures de la moelle osseuse est sous-développé dans les mégacaryocytes en culture, entravant les études sur les mécanismes de la biogenèse plaquettaire7,8.
Nous détaillons ici le modèle d’explantation de moelle osseuse, basé sur Thiéry et Bessis, à suivre en temps réel la formation de proplaquettaires de mégacaryocytes de souris, qui ont complètement mûri dans leur environnement natif, contournant ainsi d’éventuels artefacts in vitro et des interprétations erronées. Les résultats obtenus chez des souris adultes de type sauvage sont présentés pour illustrer la capacité des mégacaryocytes à étendre les proplaquettaires, leur morphologie et la complexité des proplaquettaires. Nous introduisons également une stratégie de quantification rapide pour la validation de la qualité afin d’assurer l’exactitude et la robustesse des données pendant le processus d’enregistrement des mégacaryocytes. Le protocole présenté ici est la version la plus récente de la méthode publiée sous la forme d’un chapitre de livre précédemment9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+05S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverwall Incubation Chambers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70324-02</td>
			<td>Depth : 0,2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-3375</td>
			<td>pH adjusted to 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>VIALEBEX</td>
			<td>authorized medication : n&#176; 3400956446995</td>
			<td>20% (200mg/mL -100mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BVBW8448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72200-40</td>
			<td>22 mm x 55 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems SA, Westlar, Germany</td>
			<td>DMI8 - 514341</td>
			<td>air lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope camera</td>
			<td>Leica Microsystems SA, Westlar, Germany</td>
			<td>K5 CMS GmbH -14401137</td>
			<td>image resolution : 4.2 megapixel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S2160-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSG 100x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>1037-016</td>
			<td>10,000 units/mL penicillin, 10,000 &#956;g/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D (+)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proplatelet formation dynamics of mouse fresh bone marrow explants

La dernière étape de la mégacarylopoïèse conduit à des extensions cytoplasmiques à partir de mégacaryocytes matures, appelés proplaquettaires. On a beaucoup appris sur la formation de proplaquettaires à l’aide de mégacaryocytes différenciés in vitro; cependant, il existe de plus en plus de preuves que les systèmes de culture conventionnels ne récapitulent pas fidèlement le processus de différenciation/maturation qui a lieu à l’intérieur de la moelle osseuse. Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode d’explantation initialement décrite en 1956 par Thiéry et Bessis pour visualiser les mégacaryocytes qui ont mûri dans leur environnement natif, contournant ainsi les artefacts potentiels et les mauvaises interprétations. Les moelles osseuses fraîches sont collectées en rinçant les fémurs des souris, tranchées en sections transversales de 0,5 mm et placées dans une chambre d’incubation à 37 °C contenant un tampon physiologique. Les mégacaryocytes deviennent progressivement visibles à la périphérie de l’explantation et sont observés jusqu’à 6 heures sous un microscope inversé couplé à une caméra vidéo. Au fil du temps, les mégacaryocytes changent de forme, certaines cellules ayant une forme sphérique et d’autres développant des extensions épaisses ou étendant de nombreuses proplaquettaires minces avec une ramification étendue. Des enquêtes qualitatives et quantitatives sont menées. Cette méthode a l’avantage d’être simple, reproductible et rapide car de nombreux mégacaryocytes sont présents, et classiquement la moitié d’entre eux forment des proplaquettaires en 6 heures contre 4 jours pour les mégacaryocytes de souris en culture. En plus de l’étude de souris mutantes, une application intéressante de cette méthode est l’évaluation simple des agents pharmacologiques sur le processus d’extension proplaquettaire, sans interférer avec le processus de différenciation qui peut se produire dans les cultures.

Résultats qualitatifs. Au début de l’expérience, toutes les cellules sont compactées dans la section de la moelle osseuse. Il faut 30 min pour que les cellules deviennent clairement visibles à la périphérie des explants. Les mégacaryocytes sont alors reconnaissables à leur grande taille et leur évolution peut ensuite être étudiée dans le temps (taille, forme, dynamique, extension proplaquettaire et libération plaquettaire)(Figure 2A). Les petits mégacaryocyt...

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Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

Ici, nous détaillons la méthode d’explantation de moelle osseuse, de la préparation de l’échantillon à l’analyse microscopique des lames, afin d’évaluer la capacité des mégacaryocytes qui se sont différenciés dans leur environnement physiologique à former des proplaquettaires.

Dynamique de formation proplaquettaire des explants de moelle osseuse fraîche de souris

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the ...

L’objectif global de cette procédure est de suivre en temps réel la formation de proplaquettaires à partir de mégacaryocytes de souris, qui ont mûri dans leur environnement natif. Cette méthode a l’avantage d’être simple, reproductible et rapide. On peut analyser de nombreux mégacaryocytes et visualiser la formation de proplaquettaires en seulement six heures, au lieu d’attendre le premier jour de culture comme pour les mégacaryocytes de souris in vitro.Une application intéressante de cette méthode est la possibilité d’étudier l’effet du traitement pharmaceutique ou de la mutation génétique, en particulier à l’étape de l’extension proplaquettaire. Ici, il n’y a pas d’interférence avec le processus de différenciation, comme dans le cas de la culture in vitro. Cette vidéo permet d’assurer ces étapes clés du rinçage et de la coupe de la moelle osseuse.Il est également expliqué comment classer la morphologie et les mégacaryocytes, ce qui est vraiment utile pour la caractérisation des défauts dans la maladie thrombophile. Pour commencer, réchauffez le tampon de Tyrode à 37 degrés Celsius et allumez la chambre de chauffage du microscope pour amener la température à 37 degrés Celsius. Préparez tous les outils nécessaires, tels qu’une minuterie, des chambres d’incubation, des seringues de calibre 21 millilitres, des pinces, une lame de rasoir, des pipettes Pasteur, des lames en verre et un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.Rincez la moelle osseuse avec deux millilitres de tampon de Tyrode en introduisant une aiguille de calibre 21 dans l’ouverture du fémur du côté du genou et appuyez lentement sur le piston pour récupérer un cylindre de moelle intact. Utilisez une pipette en plastique de trois minutes pour transférer soigneusement et doucement la moelle osseuse intacte sur une lame en verre. Coupez les extrémités de la moelle qui peuvent avoir été comprimées au moment de la chasse d’eau.Coupez ensuite de fines sections transversales de 0,5 millimètre d’épaisseur à l’aide d’une lame de rasoir tranchante pour éviter d’endommager les mégacaryocytes. À l’aide d’une pipette en plastique, collectez 10 sections dans un tube d’un millilitre contenant le tampon de Tyrode. Transférez soigneusement les sections dans une chambre d’incubation d’un diamètre de 13 millimètres.Aspirez le tampon et réglez le volume à 30 microlitres du tampon de Tyrode complété par du sérum de souris à 5%. Positionnez les sections à distance. Scellez la chambre auto-adhésive avec un glissement de couvercle de 22 par 55 millimètres, en inclinant le glissement du couvercle pour éviter la formation de bulles d’air.Placez la chambre dans la chambre de chauffage à 37 degrés Celsius. Démarrez le chronomètre et exécutez l’expérience pendant six heures à 37 degrés Celsius, Faites des vidéos pour enregistrer la transformation des mégacaryocytes. Après 30 minutes, les cellules de la moelle migrent progressivement vers la périphérie de l’explantation formant une monocouche.Après une heure d’incubation, les mégacaryocytes peuvent être identifiés par leur grande taille et leurs noyaux polylobulés. Le nombre de mégacaryocytes augmente après trois heures d’incubation, et certains ont de longues extensions. Dessinez une carte pour localiser chaque section de la chambre d’incubation.Après une heure, identifiez les mégacaryocytes visibles, qui sont des cellules polylobulées géantes à la périphérie de chaque section, et tracez leurs positions sur le dessin. Répétez cette procédure après trois et six heures. Les mégacaryocytes sont comptés manuellement et classés selon leur morphologie trois et six heures après la fermeture de la chambre d’incubation.Ils sont classés comme petits, grands avec une intention épaisse et proplaquettaires. Avec l’aide de la cartographie, leur évolution peut être suivie au fil du temps. Les résultats sont exprimés en pourcentage de chaque classe à chaque moment d’observation.Classiquement, la moitié des mégacaryocytes visibles à la périphérie s’étendent les proplaquettaires à six heures pour la moelle osseuse de souris de type sauvage. Le sort des mégacaryocytes ronds a été suivi par la capture d’images séquentielles au fil du temps pour imager comment ils forment des proplaquettaires. Une chose importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est de maintenir les explants à 37 degrés Celsius pendant toute la durée de l’expérience.Une température différente peut modifier les résultats. Fait intéressant, le protocole explant peut être utilisé après des expériences de microscopie introvertie. En fin de compte, les mégacaryocytes dans les explantes de moelle osseuse seront naturellement fluorescents et leur comportement peut être facilement étudié.Cela permet de combiner différents traitements sur les mêmes animaux et ainsi de réduire le nombre de souris. En conclusion, la méthode d’explantation est rapide, simple et fournit de nombreuses informations sur la capacité des mégacaryocytes naturels aux proplaquettaires externes. Les résultats qualitatifs et quantitatifs qui en résultent sont essentiels à notre compréhension de la maladie thrombophile.dans un contexte physiologique ou pathologique.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Recherche

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Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Génération de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées murin pour l&#39;utilisation dans l&#39;imagerie 2-photons

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

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Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

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In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

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Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

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Expression des protéines de Fusion Fluorescent en Murine dérivés de la moelle osseuse des cellules dendritiques et Macrophages

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Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolement, purification et différenciation des précurseurs d’Ostéoclast de la moelle osseuse de rat

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In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

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Analyse par cytométrie en flux de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques de moelle osseuse murine et de cellules de niche stromale

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