Name: proplatelet formation dynamics of mouse fresh bone marrow explants
Uploaded: 2021-05-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Жана-Ива Ринкеля, Жюли Бошер, Патрисию Лоффер, Моник Фройнд, Кетти Кнез-Хипперт за техническую помощь. Эта работа была поддержана грантом ANR (Agence National de la Recherche) ANR-17-CE14-0001-01 и ANR-18-CE14-0037.

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с европейскими стандартами 2010/63/EU и Комитетом CREMEAS по этике экспериментов на животных Страсбургского университета (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Подготовка реагентов
<ol><li>Готовят реагенты, как опис...

<ol>
	<li>Thiery, J. P., Bessis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+platelet+genesis;+in+vitro+study+by+cinemicrophotography.">Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography.</a> Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).</li><li>Becker, R. P., De Bruyn, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmural+passage+of+blood+cells+into+myeloid+sinusoids+and+the+entry+of+platelets+into+the+sinusoidal+circulation:+A+scanning+electron+microscopic+investigation.">The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation.</a> American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).</li><li>Muto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scanning+and+transmission+electron+microscopic+study+on+rat+bone+marrow+sinuses+and+transmural+migration+of+blood+cells.">A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells.</a> Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).</li><li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand.">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li><li>Kaushansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+megakaryocyte+progenitor+expansion+and+differentiation+by+the+c-Mpl+ligand+thrombopoietin.">Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin.</a> Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors.">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li><li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation.">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).</li><li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes.">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment.">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation.">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice.">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li><li>Ortiz-Rivero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3G,+through+its+GEF+activity,+induces+megakaryocytic+differentiation+and+proplatelet+formation.">C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).</li><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow.">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+MYH9-related+disease:+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A.">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238-250 (2012).</li><li>Malara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+structure+and+nano-mechanics+determine+megakaryocyte+function.">Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function.</a> Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).</li><li>Balduini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+receptors,+extracellular+proteins+and+myosin+IIA+orchestrate+proplatelet+formation+by+human+megakaryocytes.">Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).</li></ol>

Здесь мы описываем простой и недорогой метод in vitro для оценки эффективности мегакариоцитов для расширения процибетов, выросших в костном мозге. Модель эксплантата костного мозга для мышей имеет четыре основных преимущества. Во-первых, не требуются продвинутые технические навыки. ...

Метод эксплантации костного мозга был впервые разработан Тьери и Бессисом в 1956 году для описания формирования цитоплазматических расширений мегакариоцитов крыс как начального события в образовании тромбоцитов1. Используя фазовый контраст и кинематографические методы, эти авторы охарактеризовали трансформацию зрелых круглых мегакариоцитов в «кальмароподобные» тромбоцитогенные клетки с цитоплазматическими расширениями, показывающими динамические движения удлинения и сокращения. Эти руки становятся все тоньше, пока не станут нитевидными с небольшими отеками вдоль рук и на кончиках. Эти типичные удлинения мегакариоцитов, полученные in vitro и в жидких средах, имеют определенное сходство с тромбоцитами, наблюдаемыми в фиксированном костном мозге, где мегакариоциты выступают длинными расширениями через синусоидальные стенки в кровообращение2,3. Открытие и клонирование ТПО в 1994 г. позволило дифференцировать мегакариоциты в культуре, способные образовывать расширения проплатлетов, напоминающие описанные в костном мозговых эксплантатах4,5,6. Однако созревание мегакариоцитов гораздо менее эффективно в условиях культивирования, в частности, обширная внутренняя мембранная сеть зрелых мегакариоцитов костного мозга недоразвита в культивированных мегакариоцитах, что затрудняет исследования механизмов биогенеза тромбоцитов7,8.
Здесь мы подробно описываем модель экспланта костного мозга, основанную на Тьери и Бессисе, чтобы проследить в реальном времени за образованием проплатлетов мышиных мегакариоцитов, которые полностью созрели в своей родной среде, тем самым обходя возможные артефакты in vitro и неправильные интерпретации. Представлены результаты, полученные у взрослых мышей дикого типа, иллюстрирующие способность мегакариоцитов к расширению проплацетов, их морфологию и сложность проплацелетов. Мы также внедряем стратегию быстрой количественной оценки для проверки качества для обеспечения точности и надежности данных в процессе регистрации мегакариоцитов. Протокол, представленный здесь, является самой последней версией метода, опубликованной в виде главы книгиранее 9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+05S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverwall Incubation Chambers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70324-02</td>
			<td>Depth : 0,2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-3375</td>
			<td>pH adjusted to 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>VIALEBEX</td>
			<td>authorized medication : n&#176; 3400956446995</td>
			<td>20% (200mg/mL -100mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BVBW8448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72200-40</td>
			<td>22 mm x 55 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems SA, Westlar, Germany</td>
			<td>DMI8 - 514341</td>
			<td>air lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope camera</td>
			<td>Leica Microsystems SA, Westlar, Germany</td>
			<td>K5 CMS GmbH -14401137</td>
			<td>image resolution : 4.2 megapixel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S2160-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSG 100x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>1037-016</td>
			<td>10,000 units/mL penicillin, 10,000 &#956;g/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D (+)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proplatelet formation dynamics of mouse fresh bone marrow explants

Последняя стадия мегакариопоэтиса приводит к цитоплазматическим расширениям из зрелых мегакариоцитов, так называемых проплацелетов. Многое было изучено о формировании проплатлетов с использованием in vitro-дифференцированных мегакариоцитов; однако появляется все больше доказательств того, что традиционные системы культивирования не точно повторяют процесс дифференцировки/созревания, который происходит внутри костного мозга. В этой рукописи мы представляем метод эксплантата, первоначально описанный в 1956 году Тьери и Бессисом для визуализации мегакариоцитов, которые созрели в своей родной среде, тем самым обходя потенциальные артефакты и неправильные интерпретации. Свежие костные мозги собирают путем промывки бедренных костей мышей, нарезают на поперечные сечения 0,5 мм и помещают в инкубационную камеру при 37 °C, содержащую физиологический буфер. Мегакариоциты постепенно становятся видимыми на периферии экспланта и наблюдаются до 6 часов под перевернутым микроскопом, соединенным с видеокамерой. Со временем мегакариоциты меняют свою форму, причем некоторые клетки имеют сферическую форму, а другие развивают толстые расширения или расширяют множество тонких пластин с обширным ветвлением. Проводятся как качественные, так и количественные исследования. Этот метод имеет то преимущество, что он прост, воспроизводим и быстр, так как присутствуют многочисленные мегакариоциты, и классически половина из них образует проплацелеты за 6 часов по сравнению с 4 днями для культивируемых мышиных мегакариоцитов. В дополнение к изучению мышей-мутантов, интересным применением этого метода является прямая оценка фармакологических агентов в процессе расширения проплатлетов, не вмешиваясь в процесс дифференцировки, который может происходить в культурах.

Качественные результаты. В начале эксперимента все клетки уплотняются в области костного мозга. Требуется 30 минут, чтобы клетки стали хорошо видны на периферии эксплантов. Затем мегакариоциты распознаются по их большому размеру, и их эволюция затем может быть изучена с течени...

Watch this Scientific Journal Video about Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants at JoVE.com

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

Здесь мы подробно описываем метод эксплантации костного мозга, от пробоподготовки до микроскопического анализа слайдов, для оценки способности мегакариоцитов, которые дифференцировались в своей физиологической среде, образовывать проплацелеты.

Динамика образования проплатлетов эксплантов костного мозга мыши

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the ...

Общая цель этой процедуры – проследить в режиме реального времени за образованием проплатлета из мышиных мегакариоцитов, которые созрели в родной среде. Преимущество этого метода заключается в том, что он прост, воспроизводим и быстр. Можно проанализировать множество мегакариоцитов и визуализировать образование проплацелет всего за шесть часов, вместо того, чтобы ждать первого дня культивации, как для мышиных мегакариоцитов in vitro.Интересным применением этого метода является возможность изучения эффекта фармацевтического лечения или генетической мутации, в частности, на этапе расширения проплатлета. Здесь нет вмешательства в процесс дифференциации, как в случае с культурой in vitro. Это видео помогает обеспечить эти ключевые этапы промывки и разрезания костного мозга.Также объясняется, как классифицировать морфологию и мегакариоциты, что действительно полезно для характеристики дефектов тромбофильной болезни. Для начала нагрейте буфер Тирода при 37 градусах Цельсия и включите нагревательную камеру микроскопа, чтобы довести температуру до 37 градусов по Цельсию. Подготовьте все необходимые инструменты, такие как таймер, инкубационные камеры, пять миллилитров 21 калибра шприцев, щипцы, лезвие бритвы, пипетки Пастера, стеклянные слайды и 15-миллилитровая центрифужная трубка.Промыть костный мозг двумя миллилитрами буфера Тирода, введя иглу 21 калибра в отверстие бедренной кости со стороны колена и медленно нажмите на поршень, чтобы извлечь неповрежденный цилиндр костного мозга. Используйте трехминутную литровую пластиковую пипетку, чтобы аккуратно и аккуратно перенести неповрежденный костный мозг на стеклянную горку. Отрежьте концы костного мозга, которые, возможно, были сжаты во время промывки.Затем вырежьте тонкие поперечные участки толщиной 0,5 миллиметра с помощью острого лезвия бритвы, чтобы избежать повреждения мегакариоцитов. Используя пластиковую пипетку, соберите 10 секций в одну миллилитровую трубку, содержащую буфер Тирода. Аккуратно перенесите секции в инкубационную камеру диаметром 13 миллиметров.Аспирируйте буфер и отрегулируйте объем до 30 микролитров буфера Tyrode, дополненного 5% сывороткой мыши. Расположите секции на расстоянии. Запечатайте самоклеящуюся камеру с помощью скольжения крышки 22 на 55 миллиметров, наклоняя скольжение крышки, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.Поместите камеру в нагревательную камеру при 37 градусах Цельсия. Запустите хронометр и запускайте эксперимент в течение шести часов при 37 градусах Цельсия, делайте видео для записи трансформации мегакариоцитов. Через 30 минут клетки костного мозга постепенно мигрируют на периферию экспланта, образуя монослой.После одного часа инкубации мегакариоциты можно идентифицировать по их большим размерам и полилобуляционным ядрам. Количество мегакариоцитов увеличивается после трех часов инкубации, а некоторые имеют длительные расширения. Нарисуйте карту, чтобы локализовать каждую секцию в инкубационной камере.Через час определите видимые мегакариоциты, которые представляют собой гигантские полилобулированные клетки на периферии каждого участка, и нарисуйте их положения на рисунке. Повторите эту процедуру через три и шесть часов. Мегакариоциты подсчитывают вручную и классифицируют по их морфологии через три и шесть часов после запечатывания инкубационной камеры.Они классифицируются как маленькие, большие с толстым намерением и расширяющиеся. С помощью картографирования их эволюцию можно проследить с течением времени. Результаты выражаются в процентах от каждого класса в каждое время наблюдения.Классически, половина мегакариоцитов, видимых на периферии, простирается через шесть часов для костного мозга диких мышей. За судьбой круглых мегакариоцитов последовал захват последовательных изображений с течением времени, чтобы изобразить, как они образуют проплацелеты. Важно помнить при попытке этой процедуры держать экспланты на уровне 37 градусов цельсия в течение всего эксперимента.Другая температура может изменить результаты. Интересно, что протокол экспланта может быть использован после экспериментов с интровертной микроскопией. В конце концов, мегакариоциты в эксплантатах костного мозга будут естественно флуоресцентными, и их поведение можно легко исследовать.Это дает возможность сочетать разное лечение на одних и тех же животных и таким образом уменьшать количество мышей. В заключение, метод экспланта является быстрым, простым и дает много информации о способности природных мегакариоцитов к внешним проплацетам. Полученные качественные и количественные результаты являются ключом к нашему пониманию тромбофильных заболеваний.в физиологическом или патологическом контексте.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Культура миелоидных дендритных клеток из костного мозга прекурсоров

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Генерация костного мозга мышей Производные дендритных клеток для использования в 2-фотонных изображений

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing гемопоэтических клеток в костном мозге

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Остеокластов Вывод из костного мозга мыши

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Выражение флуоресцентные синтез белков в мышиных костного мозга-производные дендритные клетки и макрофаги

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Изоляция, очищение, и дифференциация Остеокласт прекурсоров из костного мозга крысы

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

В городе Vivo Двухфотонная визуализация мегакариоцитов и проплацелетов в костном мозге черепа мыши

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells

Анализ проточной цитометрии гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников костного мозга мышей и стромальных нишевых клеток

The bone marrow (BM) is the soft tissue found within bones where hematopoiesis, the process by which new blood cells are generated, primarily occurs. As ...