随着人们对细胞因子在巨噬细胞HIV感染中的作用越来越感兴趣，我们开发了一种灵活的分析系统，特别是对于SAM HG one，它在U937细胞中不表达。该系统的主要优点是其灵活性。一旦设置好，它就可以用来分析各种蛋白质、细胞或目标病毒。
保持细胞健康以及适应多色流式细胞术非常重要。在开始分析前10分钟打开细胞仪和计算机。确保废物是空的，护套罐已满。
然后登录并打开分析软件。移动手臂后，取下水管。将流速设置为高，然后按素数。
等待灯熄灭，再重复这个过程三次。将水管放回原处，以高流速运行三分钟。然后，将流速设置为低，并按待机直到采集。
选择实验，新建实验，然后按确定选择空白实验，右键单击实验并添加新标本。按确定以空白面板。右键单击以使用适当的名称重命名，并通过单击加号打开标本以显示新管。
双击试管以查看检查器中的细胞仪设置。在参数菜单中，删除除蓝色激光 53030 和黄色激光 61020 之外不需要的荧光染料。在工作表上，通过单击相应的图标并通过单击轴标签更改轴来创建前向散点区域与侧向散点区域点图、YFP 直方图、RFP 直方图和 RFP 与 YFP 点图。
加载未感染、未转导的控制器，然后在机器上按运行。然后在采集仪表板中按获取。调整仪表板中的前向和侧面散射电压，以将单元格定位在左下象限。
在这个种群周围门，并将其标记为P一。右键单击其他图并选择显示 P 1 以从后续分析中删除碎片。向下调整RFP和YFP电压，使峰值位于直方图的左侧。
加载YFP的单色控件并按采集。在仪表板中调整YFP电压，使大多数荧光细胞都在检测器范围内。然后对 RFP 控件重复相同的操作。
选择实验。转到薪酬设置并选择创建薪酬控件，然后切换到普通工作表，然后选择未染色的正常工作表。按下运行并获取未染色的对照。
在完整的单元格周围绘制一个门P并记录。拆下管子并将机器置于待机状态。右键单击 P 一。
单击应用于所有薪酬控件并切换到 RFP 普通工作表。按下运行，并记录单色RFP控制，软件将自动对阳性细胞进行门控。将机器置于待机状态，并对 YFP 控制重复相同的操作。
选择实验，转到补偿设置，选择计算补偿，然后单击链接并保存。切换到全局工作表并返回到标本管。获取用感染HIV RFP的野生型SAM HD转导的细胞，并检查在YFP和RFP垂直和水平对齐的象限角落中可以看到四个不同的群体。
取出管子并按待机。重新加载未转导、未感染的样品并按运行。在采集仪表板中，将停止门设置为 P 1，将事件设置为记录 30， 000 个事件。
新闻记录。通过按每个试管之间的下一个管子，对其他样品和对照重复相同的操作。在运行时或后 hawk 时重命名示例，并将数据导出为点 FCS 文件。
打开软件并将所有 FCS 文件拖到仪表板中。选择补偿控件并将其拖到补偿子文件夹中。双击未转导、未感染的管子以打开文件并向前散射 a 与侧散射图。
选择多边形工具，并在完整像元群上浇口（左下角的碎片除外），并将其命名为像元。移动标签，使其不会遮挡单元格。将此门拖动到所有样本栏中的整个试管群中。
使用水平箭头按钮滚动浏览整个群体，以确保每个管子都有适当的门控。双击单元格并将轴调整为高度与面积。使用矩形门选择单个大群体以排除双峰，并允许软件建议将其自动命名为单个细胞。
然后，将此门拖到所有细胞群，并检查门控是否适用于所有样品。为未感染、未转导的样品选择单细胞群。将 Y 轴更改为 YFP 的补偿蓝色激光，将 X 轴更改为 RFP 的补偿黄色激光。
选择象限门控工具，然后单击阴性细胞群的右上角。通过拖动到所有样本栏中的父门上，将此初步门控应用于所有单细胞群。如果象限门不能令人满意地分离人口，请使用面工具对各个象限进行浇注。
滚动到仅野生型SAM HD样品，以检查未转导的YFP阴性和YFP阳性细胞之间的正确门控。使用轮廓视图将阴性单元格与暗淡的 YFP 单元格区分开来。使用对所有样本都有效的YFP阴性和阳性之间的最佳划分，并滚动浏览样本以检查与YFP阳性有关的门控。
滚动到未转导的HIV RFP感染样本，并检查未感染的RFP阴性和感染的RFP阳性之间的门控是否正确。如果需要，请使用轮廓视图并滚动浏览其余样品以检查门控是否对所有样品有效。每个样本需要四个象限。
Q1 YFP 阳性，Q2 双阳性，Q3 RFP 阳性和 Q4 双阴性。打开表编辑器并将四个象限门拖到仪表板中。从下拉列表中选择文件和 excel。
选择您的文件目标，然后单击创建表。根据本地文件命名约定保存生成的电子表格。单击布局编辑器图标以导出图和门控策略的表示。
选择每个人口并将其拖动到具有所需轴、标签和间距的编辑器中。要创建具有批次部分下所有样品显示的相同图的布局，请在列中输入一个图，然后按创建批次报告。在文件菜单中，选择缩放宽度并避免分页符。
然后以所需的文件格式保存。在导出的电子表格中，按照文本手稿中的说明生成列。使用适当的数据分析软件对每个SAM HD一个构造体的重复数据进行平均，并计算限制比值。
生成具有代表性的YFP与RFP图，以获得最佳和次优数据。次优数据图表明HIV感染率太低，在补偿和门控方面造成了困难。限制比率为0.5，高于预期的0.3。
生成SAM HD One变体相对于野生型和阴性对照的限制比图，以获得最佳和次优数据。在最佳数据中，野生型的预期限制约为0.2，阴性对照HD 206至7AA的限制比为1.0。变体R372D与野生型显着不同，但与阴性对照没有显着差异，并且失去了限制能力。
在次优数据中，阴性对照的表现符合预期，但由于感染率低，野生型的限制比为0.5。R143D表现出与野生型和阴性对照在统计学上不同的中间表型。变体G209S与野生型明显不同，但与阴性对照没有显着差异，因此失去了限制能力。
拥有充足的对照细胞很重要，特别是如果您不熟悉流式细胞术。在此之后或同时，可以对相同的突变体进行生化分析以形成整体图景。
