1.8K Views
•
09:43 min
•
June 13th, 2021
DOI :
June 13th, 2021
•0:05
Introduction
0:35
Flow Cytometry Analysis
4:18
Data Analysis
7:50
Results: Analysis of the Restriction Ratio in the Optimal and Suboptimal Data
9:15
Conclusion
Transcript
Med stigende interesse for cellulære faktorers rolle i HIV-infektion af makrofager har vi udviklet et fleksibelt analysesystem, især for SAM HG en, som ikke udtrykkes i U937-celler. Den største fordel ved systemet er dets fleksibilitet. Når det er konfigureret, kan det bruges til at analysere en række proteiner, celler eller målvirus.
Det er vigtigt at opretholde cellernes sundhed og også at være fortrolig med flerfarvet flowcytometri. Tænd cytometeret og computeren 10 minutter før analysen startes. Sørg for, at affaldet er tomt, og at kappetanken er fuld.
Log derefter ind og åbn analysesoftwaren. Når du har flyttet armen, skal du tage vandrøret af. Indstil strømningshastigheden til høj, og tryk på prime.
Vent på, at lyset slukkes, og gentag denne proces tre gange mere. Placer vandrøret tilbage og kør med en høj strømningshastighed i tre minutter. Indstil derefter strømningshastigheden til lav, og tryk på standby indtil erhvervelse.
Vælg eksperiment, nyt eksperiment, og tryk på okay for at vælge tomt eksperiment, højreklik på eksperimentet og tilføj ny prøve. Tryk på OK til tomt panel. Højreklik for at omdøbe med et passende navn, og åbn prøven ved at klikke på plustegnet for at afsløre et nyt rør.
Dobbeltklik på røret for at se cytometerindstillingerne i inspektøren. I parametermenuen skal du slette de ikke-krævede fluorokromer undtagen den blå laser 53030 og den gule laser 61020. Opret et fremadrettet spredningsområde versus sidespredningsområdepunktplot, YFP-histogram, RFP-histogram og RFP versus YFP-prikplot i regnearket ved at klikke på det tilsvarende ikon og ændre akserne ved at klikke på akseetiketten.
Indlæs den uinficerede, utransducerede kontrol, og tryk på kør på maskinen. Tryk derefter på Hent i anskaffelsesdashboardet. Juster spændingerne fremad og side i instrumentbrættet for at placere cellerne i den nederste venstre kvadrant.
Gå rundt om denne befolkning og mærk den som P en. Højreklik på de andre plots og vælg vis P en for at fjerne affaldet fra den efterfølgende analyse. Juster RFP- og YFP-spændingerne ned, så toppen sidder til venstre for histogrammet.
Indlæs enkeltfarvekontrollen til YFP, og tryk på indhentning. Juster YFP-spændingen i instrumentbrættet, så de mest fluorescerende celler er inden for detektorområdet. Gentag derefter det samme for RFP-kontrolelementet.
Vælg eksperimentet. Gå til kompensationsopsætningen, og vælg opret kompensationskontroller og okay for at skifte til et normalt regneark, og vælg derefter et ufarvet normalt regneark. Tryk på på løbeturen og anskaf for den ufarvede kontrol.
Tegn en port P en omkring de intakte celler og optag. Fjern røret, og sæt maskinen på standby. Højreklik på P one.
Klik på anvend på alle kompensationskontroller og skift til RFP's normale regneark. Tryk på kør, og optag RFP-kontrollen med en enkelt farve, og softwaren vil automatisk gate de positive celler. Sæt maskinen på standby, og gentag det samme for YFP-kontrollen.
Vælg eksperiment, gå til kompensationsopsætning, vælg beregne kompensation, og klik derefter på link og gem. Skift til det globale regneark, og vend tilbage til prøveemnet. Anskaf cellerne transduceret med vildtype SAM HD en inficeret med HIV RFP, og kontroller, at fire forskellige populationer kan ses i hjørnerne af kvadranterne justeret lodret og vandret for YFP og RFP.
Fjern røret, og tryk på standby. Genindlæs den uoverførte, uinficerede prøve, og tryk på kør. I anskaffelsesdashboardet skal du indstille stopporten til P one og begivenheder til at registrere 30.000 hændelser.
Tryk på optag. Gentag det samme for andre prøver og kontroller ved at trykke på næste rør mellem hvert rør. Omdøb eksemplerne, mens du kører eller post-hawk, og eksporter dataene som dot FCS-filer.
Åbn softwaren, og træk alle FCS-filer ind i instrumentbrættet. Vælg kompensationskontrolelementerne, og træk dem til undermappen kompensation. Dobbeltklik på det uoverførte, uinficerede rør for at åbne filen og videresprede a versus side scatter et plot.
Vælg polygonværktøjet og porten på den intakte cellepopulation undtagen snavs i nederste venstre hjørne, og navngiv det celler. Flyt etiketten, så den ikke skjuler cellerne. Træk denne port til hele populationen af rør i alle prøver bar.
Rul gennem hele befolkningen ved hjælp af de vandrette pileknapper for at sikre passende gating for hvert rør. Dobbeltklik på cellerne og juster akserne til højde versus område. Vælg den enkelte store population ved hjælp af en rektangulær port for at udelukke dubletter og for at tillade softwaren at foreslå at navngive den som enkeltceller automatisk.
Træk derefter denne port til alle cellepopulationer, og kontroller, at gatingen passer til alle prøver. Vælg populationen af enkeltceller for den uinficerede, ikke-transducerede prøve. Skift Y-aksen til kompenseret blå laser for YFP og X-akse for kompenseret gul laser for RFP.
Vælg kvadrantgitterværktøjet, og klik øverst til højre på den negative cellepopulation. Anvend denne foreløbige gating på alle enkeltcellepopulationer ved at trække til den overordnede port i linjen Alle prøver. Hvis kvadrantportene ikke adskiller populationen tilfredsstillende, skal du gate de enkelte kvadranter ved hjælp af polygonværktøjet.
Rul til wild type SAM HD kun en prøve for at kontrollere den korrekte gating mellem de utransducerede YFP-negative og YFP-positive celler. Brug konturvisningen til at skelne de negative celler fra svage YFP-celler. Brug den bedste opdeling mellem YFP-negativ og positiv, der gælder for alle prøver, og rul gennem prøverne for at kontrollere gating med hensyn til YFP-positivitet.
Rul til den ikke-transducerede HIV RFP-inficerede prøve, og kontroller, om gating mellem den ikke-inficerede RFP-negative og inficerede RFP-positive er korrekt. Brug konturvisningen, hvis det er nødvendigt, og rul gennem de resterende prøver for at kontrollere, at gating er gyldig for alle prøver. Hver prøve kræver fire kvadranter.
Q1 YFP positiv, Q2 dobbelt positiv, Q3 RFP positiv og Q4 dobbelt negativ. Åbn tabeleditoren, og træk de fire kvadrantporte ind i instrumentbrættet. Vælg for at arkivere og udmærke dig fra rullemenuen.
Vælg din fildestination, og klik på opret tabel. Gem det genererede regneark i henhold til lokale filnavngivningskonventioner. Klik på layouteditorikonet for at eksportere repræsentationerne af plots og gating-strategier.
Vælg hver population, og træk den ind i editoren med de nødvendige akser, mærkning og afstand. Hvis du vil oprette et layout med de samme plots, der vises for alle prøver under batchsektionen, skal du angive et i kolonnen og trykke på Opret batchrapport. I filmenuen skal du vælge skalaen til bredde og undgå sideskift.
Gem derefter i det ønskede filformat. I det eksporterede regneark skal du generere kolonnerne som beskrevet i tekstmanuskriptet. Brug passende dataanalysesoftware til at beregne gennemsnittet af replikatdataene for hver SAM HD one-konstruktion og beregne begrænsningsforholdsværdierne.
Repræsentative YFP- versus RFP-plots blev genereret for optimale og suboptimale data. Det suboptimale dataplot indikerer, at hiv-infektionen var for lav og skabte vanskeligheder med kompensation og gating. Begrænsningsgraden var 0,5, hvilket er højere end det forventede forhold på 0,3.
Plots af begrænsningsforhold for varianter af SAM HD one med hensyn til vildtype og negativ kontrol blev genereret for de optimale og suboptimale data. I de optimale data viste vildtypen den forventede begrænsning på ca. 0,2 og negativ kontrol HD 206 til syv AA havde restriktionsforholdet på 1,0. Varianten R372D var signifikant forskellig fra vildtypen, men ikke signifikant forskellig fra den negative kontrol og mistede evnen til at begrænse.
I de suboptimale data opførte den negative kontrol sig som forventet, men vildtypen viste en begrænsningsgrad på 0,5 på grund af den lave infektionsrate. R143D viste en mellemliggende fænotype, der var statistisk forskellig fra vildtypen og den negative kontrol. Varianten G209S var signifikant forskellig fra vildtypen, men ikke signifikant forskellig fra den negative kontrol og har dermed mistet evnen til at begrænse.
Det er vigtigt at have masser af dine kontrolceller, især hvis du er ny til flowcytometri. Efter dette eller parallelt kan biokemisk analyse af de samme mutanter udføres for at danne et holistisk billede.
Beskrevet her er en etableret metode til at bestemme omfanget af HIV-1-begrænsning af det cellulære hæmmende protein SAMHD1. Humane myeloide afstamning U937-celler transduceres med en SAMHD1-ekspressionsvektor, der co-udtrykker YFP, differentieret og derefter udfordret med HIV-RFP. Begrænsningsniveauet bestemmes ved flowcytometrianalyse.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved