Name: production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

يود المؤلفون أن يشكروا داليا بارسيت لوفجوي على أخذ الوقت لتقديم تعليقات قيمة وتعليقات انتقادية على المخطوطة وجميع زملائنا في SGC الذين عملوا مع عائلة بروتين PRMT المعبر عنها من نظام ناقلات التعبير عن فيروس باكولو.
وSGC هي مؤسسة خيرية مسجلة (رقم 1097737) التي تتلقى الأموال من AbbVie، باير AG، بوهرنجر إنغلهايم، جينينتيك، جينوم كندا من خلال معهد أونتاريو للجينوم [OGI-196]، الاتحاد الأوروبي وEFPIA من خلال مبادرة الأدوية المبتكرة 2 التعهد المشترك [منحة EUbOPEN 875510]، يانسن، ميرك KGaA (الملقب EMD في كندا والولايات المتحدة)، فايزر، تاكيدا وصندوق ويلكوم [106169/ZZ14/Z].

<ol>
	<li>Guccione, E., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation,+functions+and+relevance+of+arginine+methylation.">The regulation, functions and relevance of arginine methylation.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).</li><li>Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+RGG/RG+motif.">Defining the RGG/RG motif.</a> Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).</li><li>Lorton, B. M., Shechter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+arginine+methylation.">Cellular consequences of arginine methylation.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 76 (15), 2933-2956 (2019).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+Who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).</li><li>Frankel, A., Brown, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+kinetic+data:+What+the+numbers+tell+us+about+PRMTs.">Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs.</a> Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).</li><li>Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Se&#241;a, C. C., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+protein+arginine+methyltransferases.">Chemical probes for protein arginine methyltransferases.</a> Methods. 175, 30-43 (2020).</li><li>Savitsky, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+production+of+human+proteins+for+crystallization:+The+SGC+experience.">High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience.</a> Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).</li><li>Gileadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressing+the+human+proteome+for+affinity+proteomics:+Optimizing+expression+of+soluble+protein+domains+and+in+vivo+biotinylation.">Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation.</a> New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5, 135 (2008).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-insect+cell+expression+systems.">Baculovirus-insect cell expression systems.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).</li><li>Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector.">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).</li><li>Invitrogen Life Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system. , (2010).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).</li><li>Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Production+Using+the+Baculovirus+Expression+System.">Protein Production Using the Baculovirus Expression System.</a> Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).</li><li>Rieffel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cell+culture+in+reagent+bottles.">Insect cell culture in reagent bottles.</a> MethodsX. 1, 155-161 (2014).</li></ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

تركز إحدى مزايا BEVS في خلايا الحشرات على قدرة آلية التعديل بعد الترجمة على تمكين تعديلات أكثر تعقيدا مثل الفوسفور وال myristoylation والجيليكوزيليشن. جنبا إلى جنب مع للطي كفاءة عالية من البروتينات الثدييات، وهذه التعديلات تسهيل كميات عالية من البروتين المعدلة والمطوية مناسبة للتجارب المصب ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية16.
هنا ، وصفنا بروتوكولات مفصلة من BEVS التأكيد على العناصر الحاسمة لفحص التعبير الناجح لبنى متعددة من بروتينات PRMT وإنتاج البروتين PRMT على نطاق واسع في منصة التعبير Baculovirus: 1) استخدام العادية ، قابل للتعديل ، وبرمجة ماصة متعددة القنوات لنقل المواد البيولوجية بين 24- و 96 - لوحات زراعة الخلايا جيدا وكتل في مراحل الحمض النووي bacmid وتوليد الفيروسات؛ مجموعة من الفيروسات المؤتلفة ، تضخيم الأحجام الفيروسية للفيروسات المؤتلفة وإعداد كتل فحص التعبير البروتيني. 2) الأداء العالي والكواشف transfection فعالة من حيث التكلفة لتوليد الفيروسات المؤتلفة. 3) تعليق ثقافة خلايا الحشرات المصابة بفيروس الكولو (SCBIIC) لإنتاج البروتين على نطاق واسع. 4) استخدام حجم التعبئة العالية 2.8 L فرنباخ يهز قوارير للحفاظ على ثقافة تعليق SF9 و2.5 L Tunair يهز قوارير و 5 زجاجات كاشف L لإنتاج البروتين على نطاق واسع.
اعتبارات خاصة ومبررات لخطوات التحول والإصابة. على الرغم من أن البروتوكول التجاري يوصي باستخدام 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة لتحويل واحد14، فإن كفاءة تحويل الخلايا المختصة DH10Bac E. coli التجارية عالية مثل 1 × 108 cfu / μg DNA ، لذلك نستخدم فقط 4 ميكرولتر. وهذا يكفي لكل محول للحصول على مستعمرات بيضاء منعزلة مؤتلفة لعزل الحمض النووي bacmid. تم بذر خلايا Sf9 الملتصقة في لوحة العدوى العابرة 24 جيدا بكثافة خلية 2 × 105 / مل في 0.5 مل من وسائط الحشرات الخالية من المصل. هذا الحجم يكفي لضمان تغطية حتى من سطح العمل من البئر. وفي الوقت نفسه، فإنه لا يضعف مزيج العدوى أكثر من اللازم، مما يعزز كفاءة العدوى. الكواشف Transfection غير سامة لخلايا SF9، وتبادل وسائل الإعلام ليست ضرورية. بدلا من تغيير الوسائط، يتم إضافة 1.5 مل إضافية من الوسائط التي تحتوي على 10٪ (v/v) FBS إلى لوحة العدوى في 4-5 ساعات بعد وقت العدوى لتسهيل نمو الخلايا. كفاءة العدوى من كل من الكواشف transfection عالية. ومع ذلك ، مع X - tremeGene 9 ، تظهر علامات العدوى في الخلايا المصابة (الشكل 2) 10-12 ساعة في وقت سابق مما كانت عليه مع كاشف JetPrime ، لذلك نختار بين هذه الكواشف اعتمادا على جدول العمل للخطوات التالية في البروتوكولات ، والتي توفر بعض المرونة في العملية الشاملة.
يمكن إعداد فحص التعبير عن اختبار البروتين مع فيروسات P2 إذا كانت كمية الفيروسات المؤتلفة الأولية ، التي تم جمعها من لوحة العدوى ووصفت بأنها P1 ، عاملا مقيدا لاستخدامه في فحص التعبير عن البروتين.
الاعتبارات عند الانتقال من أحجام الثقافة الصغيرة إلى الكبيرة. تاريخيا، كان يعتقد أن نمو الخلايا الأمثل يتطلب مساحة جوية عالية في ثقافة التعليق من صيانة الخلايا SF9 وتوسيع نطاق الإنتاج. ومع ذلك ، في عام 2014 ، أفادت التقارير أن ارتفاع المساحة الجوية في السفن الثقافية أقل أهمية مما كان يعتقد سابقا17. سفينة الثقافة التي أنشئت باستخدام سرعة اهتزاز المعدلة بشكل مناسب لرمي المداري من منصة اهتزاز سيوفر نقل الأكسجين كافية حتى في ثقافة تعليق حجم التعبئة العالية من خلال خلق والحفاظ على فقاعات الهواء الصغيرة لفترة أطول. مع هذا النهج ، يمكن زراعة خلايا الحشرات المتاحة تجاريا بسرعة اهتزاز أعلى ضمن نطاق طبيعي من وقت مضاعفة الخلايا دون التضحية بقابلية الخلية العالية للحياة.
وهكذا، قبل 6 سنوات، بدأنا في زيادة حجم ثقافة التعليق في قارورة تهتز أثناء صيانة الخلية، وقدم نوع مختلف من وعاء الثقافة لإنتاج البروتين مع ضبط ورصد ظروف اهتزاز(الشكل 6). ولتهيئة الظروف المثلى في هذه الأوعية الثقافية، قمنا بمراقبة معلمات ثقافة الخلايا Sf9 مثل مضاعفة وقت مضاعفة الخلية إلى جانب صلاحية الخلية وحجمها وشكلها وحالة التجميع وقابلية الخلايا للعدوى.
على سبيل المثال، لصيانة الخلية Sf9، في 2.8 L فرنباخ يهز قوارير، ونحن ثقافة 2 L بدلا من 0.8 L من الخلايا تعليق SF9 تهتز في 150 دورة في الدقيقة في 27 درجة مئوية وقابلية بقاء الخلية معظم الوقت هو ما يقرب من 99٪، مع خلايا تقسيم صحية على شكل بالتساوي. لتوسيع نطاق الإنتاج، ونحن تصيب 4 لتر من الخلايا في زجاجات كاشف 5 لتر تهتز بسرعة عالية كما 145 دورة في الدقيقة في درجة حرارة خفضت من 25 درجة مئوية. يمكن أن تحمل الحاضنات الأكثر استخداما مع منصة اهتزاز مدمجة قوارير اهتزاز 6 × 2.8 لتر أو زجاجات كاشفة 6 × 5 لتر ، أو 10 × 2.5 لتر تونير يهز قوارير. وهكذا، فإن قدرة منصة اهتزاز واحدة، إذا كنا ملء قوارير فيرنباخ يهز وزجاجات كاشف إلى 1/3 مقابل لحجم التعبئة العالية من السفن هو 4.8 لتر مقابل 12 L باستخدام 2.8 L فرنباخ يهز قوارير و 10 L مقابل 24 L باستخدام زجاجات كاشف 5 لتر(الشكل 6). وقد ساعدتنا صيانة ثقافة الخلايا المعلقة وزيادة الإنتاج في سفن الثقافة ذات الحجم العالي على التغلب على قيود أحجام الإنتاج واعتماد منصة واسعة النطاق. وبالتالي، فإن هذا مفيد للغاية للمختبرات التي لا تتوفر لها إمكانية الوصول إلى المفاعلات الحيوية و/أو المساحة المحدودة في خطوط أنابيب الإنتاج.
يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة لإنتاج وتنقية بنيات البروتين مع علامات تقارب مختلفة باستخدام الراتنجات المناسبة وتعديل مخازن تنقية كما هو موضح في ورقة SGC المنشورة6 للبروتينات كاملة الطول الموسومة بالعلم من PRMT4 و 7 و 9 ومجمع PRMT5-MEP50 الموسومة له وPRMT6. على الرغم من أننا نصف بروتوكول BEVS لعائلة PRMT من البروتينات ، يمكن تطبيق نفس النهج على أي عائلة بروتين أخرى.

البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراسيس (PRMTs) ميثيلات أرجينين المخلفات بطريقة أحادية ميثيل أو متماثل / ثنائي ميثيل غير متماثل. وتفضل كثيرا تسلسل RG/RGG/GRG المتكررة من قبل معظم PRMTs وتوجد في مجموعة واسعة من البروتينات1،2. البروتينات الميثيلية أرجينين مثل الهستونات أو عوامل النسخ وعوامل الربط تنظيم النسخ, الربط, وهيكل الكروماتين3,4. زيادة المعرفة بتنظيم متنوع من الركيزة واستخدام عامل مساعد، دوران، وحركية PRMTs، فضلا عن توليد مثبطات انتقائية، وقد ألقى الضوء الميكانيكي على هذه الإنزيمات ومجمعاتها5،6. ومع ذلك، لا تتم دراسة جميع أفراد أسرة PRMT بنفس القدر؛ على سبيل المثال، تم اكتشاف PRMT9 مؤخرا فقط ليكون عضوا في عائلة PRMT1. تتطلب دراسات وظيفة الهيكل والانزيم لهذه البروتينات كميات كافية ، غالبا ما تكون ملليغرام ، من البروتين المؤتلف لتكون متاحة.
الإشريكية القولونية (E. coli) نظام التعبير prokaryotic عادة ما يكون الخيار الأول لفحص التعبير باستخدام بنيات متعددة لبروتين معين7,8,9. ومع ذلك ، فإن التعبير القائم على الإشريكية القولونيةلا يؤدي دائما إلى كميات كافية من بروتينات PRMT في أشكالها النشطة ، كما لاحظنا بشكل خاص بالنسبة ل PRMT5 و PRMT7 (انظر أدناه). وهكذا، فإن تكنولوجيات PRMTs التي لم تعبر عن الإشريكية القولونية أو التي تحتاج إلى إنتاجها بواسطة آلية التعبير eukaryotic كانت معلبة في ناقلات مناسبة لفحص التعبير في نظام متجه التعبير البديل لفيروس الباكولو (BEVS). في حين أعرب E. coli عينات من PRMT1، PRMT3 وPRMT8 وقد استخدمت على نطاق واسع في المقايسات المختبرية والبلورات، PRMTs أخرى مثل PRMT5، الذي يتطلب MEP50 شريك ملزم من مجالها ميثيل ترانسفيراز المزدوج، وPRMTs مثل PRMT7 و 9، تتطلب التعبير عن خلايا الحشرات للحصول على كميات كافية من البروتين النشط. بشكل عام ، استخدمت المقايسات الموحدة متوسطة الإنتاجية ميثيل ترانسفيراز ل PRMT4 و 5 و 6 و 7 و 9 BEVS في خلايا الحشرات6. نظام متجهات التعبير عن الفيروسات الكولولية (BEVS) هو منصة متعددة الاستخدامات لإنتاج البروتينات المؤتلفة التي تتطلب آلات التعبير eukaryotic التي تمكن من التعديلات ما بعد الترجمة الضرورية للدراسات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية والهيكلية10،11،12. أصبحت العديد من BEVSs متاحة تجاريا منذ أول استخدام للفيروسات الكولوفيروس في عام 1983 للتعبير عن البروتين13. تستخدم معظم هذه البروتوكولات استراتيجيات مختلفة لنقل البلازميد التعبيري إلى خلايا الحشرات. وتشمل هذه باك إلى باك، flashBAC، BaculoGOLD مشرق، BacVector-3000، BacMagic، BacPAK، الخ. ويستند بروتوكولنا على النظام الأكثر استخداما في BEVS، ونظام البكالوريا إلى البكالوريا14،الذي يهدف إلى نقل الجين / cDNA ترميز البروتين من الفائدة (POI، هنا PRMTs) في الجينوم فيروس baculo الحفاظ عليها في سلالة متخصصة من القولونية E. عن طريق نقل موقع محدد15.
لفترة وجيزة، تم تحويل ناقل نقل البلازميد الذي يحتوي على جين الفائدة إلى خلايا DH10Bac E. coli المختصة لتوليد الحمض النووي الفيروسي bacmid المؤتلف. ثم تم نقل خلايا Sf9 الملتصقة بالحمض النووي الباكميد. بعد أربعة إلى خمسة أيام من العدوى، تم استرداد الفيروسات الباكولوية المؤتلفة الأولية التي تفرز في وسط زراعة الخلايا ووصفت بأنها فيروس P1. ثم استخدمت مخزونات فيروس الباكولو P1 لتضخيم الفيروسات (أي توليد مخزونات فيروسات الباكولو P2) وفحص التعبير عن البروتين. استنادا إلى نتائج فحص التعبير ، تم تحديد فيروسات P2 للحصول على أفضل تعبير عن البروتين واستخدامها لتوليد ثقافات تعليق خلايا الحشرات المصابة بفيروس الكولو (SCBIIS) لإنتاج البروتين على نطاق واسع. هنا، نقوم بوصف بروتوكولاتنا التفصيلية ووصف الأساس المنطقي وراء اختياراتنا للكواشف والثقافة لدعم استراتيجيتنا لتطوير منهجية أكثر كفاءة من حيث الوقت، وفعالة من حيث التكلفة، وقابلة للتوسع للحصول على كميات كافية من البروتينات المؤتلفة المطلوبة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.8L Nalgene&#160; Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>29171-854</td>
			<td>For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Blocks RB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19583</td>
			<td>For incubation of&#160; 4ml of suspension&#160; Sf9 cells&#160; for protein&#160; expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5671095</td>
			<td>For SDS-PAGe analysis of the purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Reagent Reservoir</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229290</td>
			<td>&#160;Reservoir used for diluted transfection reagent&#160; and Sf9 cells suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cap mat, for use with square well, 2 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>381080</td>
			<td>Used to cover 96 well block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>For LB-agar selection paltes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airpore Tape Sheets</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19571</td>
			<td>To cover 24 well blocks for protein expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allega X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacmid DNA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>non-catalog item</td>
			<td>Bacmid DNA for baculovirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-Gal, 1g</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA 8.1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30722116</td>
			<td>Tissue&#160; culture treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Resuspension Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCRS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell&#160;Lysis Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCLS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR&#160; Tissue Culture Plates, 96 well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td>For transfection mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 1250, filter reload, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>94420818</td>
			<td>Tips for&#160; programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (25 mM each)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1-ClipTip&#160; Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 &#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4672090BT</td>
			<td>Programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4&#160; XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 &#956;L</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>LTS EA6-300XLS</td>
			<td>Ranin adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 &#181;m ultra high molecular weight polyethylene membrane</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>201005-100</td>
			<td>For protein purification in expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>SS-6003C</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 10x10ml</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>301-045-LL</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue, Ultrafast Protein Stain</td>
			<td>Expedeon Protein Solutions</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td>For protein gel (SDS-PAGE) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>IPT001.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPRIME Transfection Reagent&#160; Provided with&#160; jetPRIME buffer</td>
			<td>POLYPLUS TRANSFECTION Inc</td>
			<td>114-01</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&#38;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterblock 96 deep well 2.4mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>780285-FD</td>
			<td>Used in the transformation and expression screening procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10361012</td>
			<td>Competent cells for bacmid DNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartorius 725240</td>
			<td>12 channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization Solution, 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKNS0500</td>
			<td>For bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick&#160; Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td>Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX&#160; Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 500ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-500</td>
			<td>For&#160; suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 125ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-125</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 250ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-250</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe&#160;Nucleic&#160;Acid&#160;Staining&#160;Solution</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, 0.9&#160;mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKPMRN30</td>
			<td>For suspension buffer for bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roll &#38; Grow Spherical Glass Plating Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>115000550</td>
			<td>For&#160; spread&#160; of bacterial&#160; cells across the surface of an agar plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LTS-A-300&#956;L-768/8 (tips)</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>30389253</td>
			<td>Tips for ranin multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian</td>
			<td>cytivalifesciences</td>
			<td>SH3039602</td>
			<td>Addition to the serum free medim for&#160; the transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12659017</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td>
			<td>Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td>SH3027802</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape Pad</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td>Tape Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hcl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TET701.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For&#160; assessment of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITLAB&#160; Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>V100889</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Digital Mini Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10055-006</td>
			<td>Incubator for adherent Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-606</td>
			<td>Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA73370-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGene 9 DNA&#160; Transfection Reagent&#160; 1.0 M</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system

البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراسيس (PRMTs) بقايا الميثيلات أرجينين على مجموعة واسعة من البروتينات التي تلعب أدوارا في العديد من العمليات الخلوية. PRMTs يمكن إما أحادية أو ثنائي ميثيلات مجموعات أرجينين جوانيدينو بشكل متناظر أو غير متماثل. الأنزيمولوجيا من هذه البروتينات هي منطقة معقدة والتحقيق المكثف الذي يتطلب كميات ملليغرام من البروتين المؤتلف عالية الجودة. تم استخدام نظام متجهات التعبير عن الفيروسات الكولوبية (BEVS) الذي يستخدم Autographa californica متعددة nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) وSpodoptera frugiperda 9 (Sf9) خلايا الحشرات لفحص التعبير وإنتاج العديد من PRMTs ، بما في ذلك PRMT 1 و 2 و 4 إلى 9. في وقت واحد للشاشة للتعبير عن بنيات متعددة من هذه البروتينات، بما في ذلك المجالات وشظايا مبتورة، فضلا عن البروتينات كاملة الطول، قمنا بتطبيق أساليب قابلة للتطوير باستخدام ماصة متعددة القنوات قابلة للتعديل وبرمجة، جنبا إلى جنب مع لوحات 24-و 96-well وكتل. وعموما، مكنت هذه التعديلات طريقة توليد واسعة النطاق من الحمض النووي bacmid، والفيروسات المؤتلفة، وفحص التعبير البروتين. ساعد استخدام الأوعية الثقافية ذات الحجم العالي من تعليق خلايا Sf9 على التغلب على قيود المساحة في خط أنابيب الإنتاج لإنتاج البروتين على نطاق واسع دفعة واحدة. هنا، نقوم بوصف البروتوكولات التفصيلية للتعبير الفعال والفعال من حيث التكلفة عن PRMTs الوظيفية للدراسات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية والهيكلية.

ويرد في الشكل 1لمحة عامة عن بروتوكول BEVS . تم إنشاء بنى تعبير متعددة من PRMTs ، بما في ذلك الطول الكامل ، والمجالات ، والشظايا المبتورة ، في اتحاد الجينوم الهيكلي (SGC ، تورونتو) وفقا لاستراتيجيات داخلية مع محاولة لزيادة معدل النجاح لتحديد البروتينات القابلة للذوبان والمستقرة مع مستوى تعبير مرتفع نسبيا7،9. يتم تشجيع القراء المهتمين على مراجعة تعريفات ومنهجية SGC لتصميم "جزء" كشريحة من التسلسل الجيني المدمج في استنساخ التعبير ، و "المجال" كمجال هيكلي مشروح PFAM ، و "بناء" كجزأ مستنسخ في متجه تعبير ، وكلها وصفت بالتفصيل في منشور سابق7. إن بنى التعبير من PRMTs المعروضة في هذا البروتوكول هي لإنتاج البروتينات الموسومة بالبوليهيستدين المستنسخة في ناقل pFBOH-MHL ، وهو مشتق من ناقل pFastBac1. في الشكل 4، نقدم تحليل SDS-PAGE للبنى القابلة للذوبان الموسومة من PRMT1 ، 2 ، 4-9 منقي من الكريات التي تم جمعها بعد 4 مل من الإنتاج في خلايا Sf9 (الخطوة 3.1.4). لم يتم تقديم كامل طول (فلوريدا) PRMT1 و PRMT9 في هذا الجل، منذ تم إنتاج FL PRMT1 من كولاي،وFL PRMT9 المنتجة من BEVS تم تنقيتها من قبل العلم العلامة6. تظهر البنى المبتورة من PRMT1 و FL PRMT4 وجميع بنيات PRMT8 عائدا مرتفعا نسبيا ، ولكن الملوات البروتينية تحتوي على أجزاء من الملوثات المنقية المشتركة. تتطلب هذه الإنشاءات تحسين بروتوكولات التنقية. ولذلك يلزم اتباع نهج إضافية لتحسين نقاء هذه البروتينات من زيادة الإنتاج، مثل تخفيض كمية حبات النيكل في مرحلة الحضانة مع توضيح اللذات؛ زيادة تركيزات إيميدازول في مخازن الغسيل؛ انشقاق له الوسم مع بروتياز TEV، تليها تطبيق على راتنج ني تقارب؛ وخطوات تنقية إضافية مثل استبعاد الحجم والكروماتوغرافيا التبادلية الأيونية. تظهر بنى PRMT2 عائدا أقل بكثير مقارنة بالبروتينات الأخرى وبروتين PRMT2 كامل الطول مصحوبا بنطاق ملوث قوي. وأكد توسيع الإنتاج وخطوتين من تنقية مثل IMAC وحجم الاستبعاد مستوى التعبير منخفضة لهذا البناء جنبا إلى جنب مع وجود مستمر من الملوثات تنقية مشتركة للبروتين فلوريدا. تم الحصول على البروتينات النقية لمجمع PRMT5 المنتجة وتنقية مع شريك ملزم ملزم، MEP50. يحتوي البناء المبتور ل PRMT9 على مستوى تعبير أقل بمقدار ضعفين أو ثلاثة أضعاف تقريبا ، بالقرب من 1.5 ملغ / لتر ، مقارنة ب PRMTs الأخرى. ومع ذلك، استخدمت المخزونات الفيروسية المؤتلفة من هذا البناء لتوسيع نطاق الإنتاج، تم الحصول على بلورات diffracting، وحلت هيكل لهذا البروتين جنبا إلى جنب مع PRMT4، 6، و 7 (الشكل 5).
بالنسبة للإنتاج الأعلى ، تم استخدام فيروسات P2 المقابلة لإصابة ثقافة التعليق لخلايا الحشرات Sf9. هذه الخطوة يولد 50/100/200 مل من الخلايا المصابة بالفيروسات الباكولو التي تحتوي على الخلايا المصابة وفيروسات P3 في supernatant. لإنتاج البروتين على نطاق واسع، تم استزراع 2 لتر من خلايا Sf9 في كل من قوارير اهتزاز فرنباخ 2.8 L عند 150 دورة في الدقيقة، 27 درجة مئوية (الشكل 6). في يوم الإنتاج، 2 لتر من خلايا Sf9 (صلاحية الخلية > 97٪) في 2.5 L Tunair هز قوارير أو 4 L في 5 زجاجات كاشف L تم تخفيفها إلى كثافة الخلية من 4 × 106/ مل. وقد أصيبت هذه الخلايا مباشرة ب 10-12 مل/لتر من زراعة التعليق لخلايا الحشرات المصابة بفيروس الكولو، وتم احتضانها بدرجة حرارة منخفضة تبلغ 25 درجة مئوية، عند 145 دورة في الدقيقة. العدوى دفعة الإنتاج مباشرة مع ثقافة تعليق خلايا الحشرات المصابة بالفيروسات البكولو خفضت بشكل كبير الخطوات الشاقة وتستغرق وقتا طويلا في تضخيم حجم الفيروس، باستثناء التعامل الإضافي مع الخلايا المصابة، وتجنب الحد من تدهور التيتر والفيروس. وقد تم SF9 خلية صيانة الثقافة وتوسيع الإنتاج في الأوعية ثقافة مع حجم تعبئة عالية لاعتماد إنتاج البروتين على نطاق واسع في دفعة واحدة(الشكل 6).
وقد استخدمت كامل طول PRMT 4، 5 (في مجمع مع MEP50)، 6، 7، و 9 البروتينات المنتجة من منصة الإنتاج بوساطة فيروس Baculo لتوصيف الحركية وفحص مركب المانع في SGC6. تم حل الهياكل البلورية وإيداعها في بنك بيانات البروتين (PDB) للأشكال الكاملة أو المبتورة من البروتينات PRMT 4 و 6 و 7 و 9 مع مسابير ومثبطات كيميائية مختلفة. تم إيداع البلازميدات التعبيرية لهذه PRMTs في مستودع أدجين بلازميد (أدجين هو شريك توزيع لSGC ، https://www.addgene.org/) ومتاحة لمجتمع البحوث(الشكل 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg"> الشكل 1:نظرة عامة تخطيطية لخطوات عملية التعبير عن الفيروسات الكولولية، <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg"> الشكل 2: فيروس باكولو المصابة وغير المصابة SF9 الخلايا. علامات العدوى هي تغييرات هيكلية في خلايا الحشرات ، مثل زيادة بنسبة 25-50٪ في قطر الخلية ، ونوى الخلية الموسعة ، والشكل المستدير بشكل موحد ، وفقدان الانتشار ، والالتزام بسطح طبق الثقافة ، بالإضافة إلى انخفاض في صلاحية الخلية. شريط مقياس أبيض 200 ميكرومتر. علامات العدوى المعروضة هنا هي نفسها بالنسبة للخلايا المصابة باستخدام كل من الكواشف transfection، JetPrime وX-tremeGene 9. المثال المحدد الموضح هو لمشف العدوى عبر JetPrime. (أ) خلايا Sf9 غير المصابة كعنصر تحكم. (ب) خلايا SF9 المصابة بفيروس باكولو. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg"> الشكل 3:تجميع لوحة الربط لتنقية سريعة من البروتينات التعبير الاختبار. يرجى الاطلاع على نص التفاصيل، الخطوات 3.2.1-2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg"> الشكل 4: نتائج فحص التعبير البروتيني. نتائج فحص التعبير البروتيني لإنتاج البروتين بوساطة فيروس baculo في 4 مل من ثقافة تعليق Sf9 المصابة بالفيروسات المؤتلفة P1 المقابلة لمختلف PRMTs ومجمع PRMT5-MEP50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg"> الشكل 5:ملخص لبنى التعبير لPRMT4 و 6 و 7 و 9 المستخدمة لدراسات البنية البلورية في اتحاد الجينوم الهيكلي، تورونتو (SGC). تم حل الهياكل البلورية وإيداعها في بنك بيانات البروتين (PDB) لكامل طول أو أشكال مبتورة من البروتينات PRMT 4 و 6 و 7 و 9 مع مسابير ومثبطات كيميائية مختلفة. تم إيداع البلازميدات التعبيرية لهذه PRMTs في مستودع Addgene plasmid وهي متاحة لمجتمع الأبحاث (Addgene هو شريك توزيع ل SGC ، https://www.addgene.org/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg"> الشكل 6: Sf9 صيانة خلايا الحشرات وإنتاج البروتين في الأوعية ثقافة مختلفة: (أ) 2.8 L قارورة فرنباخ لصيانة الخلايا وإنتاج البروتين. استخدام 72٪ ملء حجم يزيد من معدل الإنتاجية بنسبة 2.5 أضعاف في منصة واحدة اهتزاز. (ب)تونير يهز قوارير (فقط 9 قوارير من أصل 10 يتم تقديمها في هذه الصورة) وزجاجات كاشف مع 80٪ ملء حجم زيادة كبيرة في الطاقة الإنتاجية للمنصة تهتز. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

نظام ناقلات التعبير عن الفيروسات الكولوئية (BEVS) هو منصة قوية لفحص التعبير وإنتاج البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراس (PRMTs) لاستخدامها في الدراسات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية والهيكلية. يمكن إنتاج كميات ملليغرام من المواد لغالبية PRMTs والبروتينات الأخرى ذات الأهمية التي تتطلب منصة التعبير eukaryotic.

إنتاج بروتينات PRMT المؤتلفة باستخدام نظام ناقلات التعبير عن فيروس باكولو

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

الهدف العام لهذا البروتوكول هو فحص التعبير عن بناء متعددة من البروتين أرجينين ميثيلترانسفيراس في الإنتاج على نطاق واسع للحصول على كمية ملليغرام من البروتين للدراسات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية والهيكلية في المتوسطة المدعومة، ووضع كفاءة من حيث التكلفة في تغطية التعبير منصة S، baculovirus التعبير نظام ناقلات التعبير. وستقدم الدكتورة ألما سيتوفا الخطوات التالية. تمييع خلايا SF9 المتنامية بشكل كبير إلى كثافة الخلية النهائية البالغة 0.4 مليون لكل ميل في وسائط الحشرات الخالية من المصل ، وتصب في خزان الكاشف العقيم.استخدام ماصة متعددة القنوات للبرمجة لزرع 0.5 ميل من خلايا SF9 المخففة إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. هذا الحجم يكفي لضمان تغطية حتى من سطح العمل من البئر. وفي الوقت نفسه، فإنه لا يخفف من مزيج العدوى أكثر من اللازم، مما يمكن من كفاءة العدوى.تسمية بئر واحد من لوحة كخلية فقط، واستخدامه كعنصر تحكم للمقارنة بين الخلية المصابة وغير المصابة لتقييم للعلامات المحتملة للعدوى. احتضان لوحات في 27 درجة حتى الحاجة، ما يقرب من ساعة واحدة، للسماح للخلايا نعلق على لوحات ثقافة الخلية. تمييع كاشف العدوى المختلط جيدا في وسط الحشرات غير المؤتمن وخزان كاشف معقم ، ويخلط بلطف لمدة 10 ثوان.باستخدام ماصة من 12 قناة، نقل 102 ميكرولتر من كاشف المعاملات المخفف إلى لوحة 96 MicroWell معقمة. نقل 10 ميكرولتر من 0.2 ميكروغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي bacmid المؤتلف في البئر المقابلة من لوحة MicroWell 96 جيدا ومزيج عن طريق اهتزاز بلطف، والتنصت على لوحة من الجانبين. احتضان مزيج العدوى لمدة 15 إلى 20 دقيقة لتشكيل معقد.باستخدام ماصة قابلة للتعديل من ست قنوات مصممة لنقل بين لوحة 96 و 24 جيدا، تراكب مزيج العدوى على الخلايا قطرة الحكمة في الآبار المقابلة من لوحات العدوى، واحتضان لمدة أربع ساعات في 27 درجة. لضمان توزيع حتى من مزيج transfection على cells'monolayer، صخرة بلطف لوحات ذهابا وإيابا عدة مرات خلال فترة الحضانة. بعد أربع إلى خمس ساعات من وقت العدوى ، أضف 1.5 ميل من وسائط الحشرات الخالية من المصل.تكملة ذلك مع 10٪ النهائي من مصل البقر الجنيني المعطل للحرارة و 1٪ المضادات الحيوية ومضاد الذهان. احتضان الخلايا في حاضنة 27 درجة لمدة 72 إلى 96 ساعة. هز بلطف لوحات العدوى مرة واحدة في اليوم عندما يكون ذلك ممكنا.ابحث عن علامات العدوى الواضحة في الخلايا المصابة في 72 إلى 96 ساعة بعد وقت العدوى. بعد أربعة إلى خمسة أيام من العدوى ، يجب أن تكون علامات العدوى واضحة في الخلايا المصابة بالمقارنة مع خلايا التحكم تحت المجهر المقلوب ، ويجب أن تكون الفيروسات الباكولوية المؤتلفة الأولية التي تفرز في وسط زراعة الخلية جاهزة لجمعها. استخدام متعدد القنوات الإلكترونية للبرمجة للسماح في وقت واحد لجمع الفيروسات P1، والعدوى من خلايا SF9 المصنف حديثا في عدوى الخلايا المعلقة في كتل الآبار 24 مع 150 ميكرولتر من الفيروسات P1.تدور أسفل بقية الأسهم الفيروسية P1 الجماعية لمدة 15 دقيقة، وتغطي كتل البئر 24 مع ثقافة تعليق خلايا SF9 المصابة مع ورقة AirPore. احتضان كتلة البئر 24 في 27 درجة مع اهتزاز في 245 RPMs لمدة 72 إلى 96 ساعة. قبل أربعة أيام من وقت الإنتاج المقرر ، انقسمت خلايا SF9 المتنامية بشكل كبير ، بكثافة الخلية النهائية من 2 مليون لكل ميل إلى خيط اهتزاز زجاجي Erlenmeyer مع حيرات في وسائط الحشرات الخالية من المصل التي تحتوي على 1٪ من المضادات الحيوية النهائية ومضاد الذهان.هذه الخطوة سوف تولد ثقافة تعليق خلايا الحشرات المصابة وفيروسات P2 في supernatant لعدوى الخلايا الجديدة في دفعة الإنتاج. إضافة الفيروسات P2 المقابلة واحتضان الخلايا المصابة في درجة حرارة أقل من 25 درجة لإبطاء نمو الخلايا، ويهتز في 165 RPMs على شاكر المداري مع ضربة بوصة واحدة. قبل أربعة أيام من وقت الإنتاج المقرر، بذور لترين من خلايا SF9 المتنامية أضعافا مضاعفة في وسائل الإعلام الحرة مصل الحشرات إلى كثافة الخلية من 1 مليون لكل ميل، في قارورة اهتزاز فرنباخ 2.8 لتر.هز القارورة في 27 درجة مع اهتزاز في 150 RPMs. عالم البحوث آشلي هاتشينسون سوف تظهر البروتوكول التالي. تقسيم أربعة لترات من خلايا SF9 المتنامية أضعافا مضاعفة والوسائط الخالية من مصل الحشرات إلى كثافة الخلية النهائية من 4 ملايين لكل ميل في زجاجات كاشفات خمسة لترات كبيرة.إضافة 10 إلى 12 ميل من ثقافة تعليق خلايا الحشرات المصابة بالفيروس الكولو. احتضان الثقافة المصابة من خلايا SF9 في شاكر يهز بها 145 دورة في الدقيقة في درجة حرارة أقل من 25 درجة مئوية لمدة 72 إلى 96 ساعة. كميات مليغرام من البروتينات المؤتلفة عدة من عائلة PRMT التعبير في إنتاج فوري baculovirus في خلايا SF9 وتستخدم للدراسات التعليمية البيوكيميائية الحيوية الفيزيائية، كما يمكن أن نرى في الشكل الخامس.في SGC، تم حل الهياكل البلورية في إيداعها في بنك بيانات البروتين لكامل طول أو أشكال مبتورة من البروتينات PRMT4، 6، 7، و 9 مع التحقيق الكيميائي المختلفة ومثبطات. تم إيداع البلازميدات التعبيرية لهذه PRMTs لإضافة جمع الجينات من قبل SGC وهي متاحة لمجتمع البحوث. في هذا الفيديو، أكدنا على العناصر الرئيسية للفحص الاستكشافي الناجح لبنائهم المتعدد من ميثيل ترانسفيراسيات أرجينين البروتين في الإنتاج على نطاق واسع في نظام التعبير عن الفيروسات الباكولو.استخدام ماصة متعددة القنوات قابل للتعديل وقابلة للبرمجة العادية ، جعلت العملية برمتها أسرع من الكفاءة. استخدام عالية الأداء وأقل سمية الخلية للخلايا، كاشف العدوى لتوليد الفيروسات المؤتلفة أدى إلى أكثر كفاءة من حيث التكلفة، وهذا البروتوكول معالجة الخلايا transfection. العدوى دفعة واسعة النطاق لإنتاج البروتين مع ثقافة تعليق من فيروس baculo المصابة في ست خلايا خفضت بشكل كبير من المخاض في خطوة تستغرق وقتا طويلا في تضخيم بداية الحيوية.هو على سبيل المثال، الطرد المركزي هذا مع ثقافة خاصة من الخلايا المصابة. هذا بالطبع في استبعاد التعامل الإضافي مع الخلايا المصابة في تجنب في تشديد في تدهور الفيروس. تعليق ثقافة صيانة الخلية الثقافة في هذا التوسع في الإنتاج في سفينة الثقافة كان حجم حقل عالية تساعدنا على التغلب على الحد من حجم الإنتاج واعتماد منصة واسعة النطاق.وهذا مفيد للغاية للمختبرات التي لا يمكن الوصول إليها إلى المفاعلات الحيوية أو مساحة محدودة في خط أنابيب الإنتاج. على الرغم من أن تم وصف بروتوكولنا لبروتينات البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراسيس الأسرة، يمكن تطبيق نفس النهج على أي عائلة البروتينات الأخرى التي تتطلب منصة التعبير للحصول على كمية كافية من البروتين للدراسات التعليمية البيوفيزيائية الحيوية الكيميائية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

تعبير البروتين المؤتلف، التبلور، والدراسات البيوفيزيائية ل<em&gt; العصوية</em&gt; -conserved النيوكليوتيد بيروفوسفوريلاس، بكمازغ

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

تعبير عابر في نيكوتيانا بينثاميانا يترك لإنتاج ترتيربين في نطاق التحضير

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

تعديل ناقلات التعبير باكولوفيروس لإنتاج يفرز البروتينات النباتية في خلايا الحشرات

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

الإنتاج الواسع النطاق للكشف المؤتلف في سقالة دائرية باستخدام نظام المستمدة من فرويد في الإشريكيّة القولونية

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

استخدام البروتينات الانصهار المؤتلف في منصة فحص حوزتي فلورسنت وما ريناتوريشن في جل

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

توطين البروتينات المعدلة السومو باستخدام السومو الفلورسنت-البروتينات الملائمة

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

التعبير، تنقية، تبلور، واختبارات إنزيم من البروتينات التي تحتوي على مجال الهيدرولاز اتاتس

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

توصيف الناقلات غشاء بواسطة تعبير مغاير في كولاي وإنتاج الحويصلات الغشائية

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

إنتاج البروتينات الخالية من الخلايا للتحليل الوظيفي وتطوير الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات الغشائية

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...