Name: production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

De auteurs willen Dalia Barsyte-Lovejoy bedanken voor het nemen van de tijd om waardevolle feedback en kritische opmerkingen te geven over het manuscript en al onze SGC-collega's die werkten met de PRMT-eiwitfamilie, uitgedrukt vanuit het Baculovirus Expression Vector System.
De SGC is een geregistreerde liefdadigheidsinstelling (nummer 1097737) die fondsen ontvangt van AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada via Ontario Genomics Institute [OGI-196], de EU en EFPIA via de Joint Undertaking Innovative Medicines Initiative 2 [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (ook bekend als EMD in Canada en de VS), Pfizer, Takeda en de Wellcome Trust [106169/ZZ].

<ol>
	<li>Guccione, E., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation,+functions+and+relevance+of+arginine+methylation.">The regulation, functions and relevance of arginine methylation.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).</li><li>Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+RGG/RG+motif.">Defining the RGG/RG motif.</a> Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).</li><li>Lorton, B. M., Shechter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+arginine+methylation.">Cellular consequences of arginine methylation.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 76 (15), 2933-2956 (2019).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+Who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).</li><li>Frankel, A., Brown, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+kinetic+data:+What+the+numbers+tell+us+about+PRMTs.">Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs.</a> Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).</li><li>Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Se&#241;a, C. C., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+protein+arginine+methyltransferases.">Chemical probes for protein arginine methyltransferases.</a> Methods. 175, 30-43 (2020).</li><li>Savitsky, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+production+of+human+proteins+for+crystallization:+The+SGC+experience.">High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience.</a> Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).</li><li>Gileadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressing+the+human+proteome+for+affinity+proteomics:+Optimizing+expression+of+soluble+protein+domains+and+in+vivo+biotinylation.">Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation.</a> New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5, 135 (2008).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-insect+cell+expression+systems.">Baculovirus-insect cell expression systems.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).</li><li>Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector.">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).</li><li>Invitrogen Life Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system. , (2010).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).</li><li>Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Production+Using+the+Baculovirus+Expression+System.">Protein Production Using the Baculovirus Expression System.</a> Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).</li><li>Rieffel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cell+culture+in+reagent+bottles.">Insect cell culture in reagent bottles.</a> MethodsX. 1, 155-161 (2014).</li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Een van de voordelen van BEVS in insectencellen is het vermogen van de post-translationele modificatiemachines om complexere modificaties zoals fosforylering, myristoylatie en glycosylatie mogelijk te maken. Samen met het zeer efficiënt vouwen van zoogdiereiwitten vergemakkelijken deze modificaties grote hoeveelheden gemodificeerd en gevouwen eiwit dat geschikt is voor fysiologisch relevante downstreamexperimenten16.
Hier beschreven we gedetailleerde protocollen van de BEVS met de nadruk op kritische elementen voor succesvolle expressiescreening van meerdere constructies van PRMT-eiwitten en grootschalige PRMT-eiwitproductie in het Baculovirus-expressieplatform: 1) Het gebruik van regelmatige, aanpasbare en programmeerbare meerkanaalspipetten om de biologische materialen over te brengen tussen 24- en 96 - putcelkweekplaten en -blokken in de stadia van bacmide-DNA- en virusgeneratie; een verzameling van de recombinante virussen, versterking van virale volumes van de recombinante virussen en voorbereiding van de screeningsblokken voor eiwitexpressie. 2) Hoge prestaties en kosteneffectieve transfectiereagentia voor de generatie van recombinante virussen. 3) Suspensiecultuur van met baculovirus geïnfecteerde insectencellen (SCBIIC) voor grootschalige eiwitproductie. 4) Gebruik van hooggevulde 2,8 L Fernbach shakekolven om de Sf9-suspensiecultuur te behouden en 2,5 L Tunair-shakekolven en 5 L reagensflessen voor de grootschalige eiwitproductie.
Speciale overwegingen en redenen voor de transformatie- en transfectiestappen. Hoewel een commercieel protocol aanbeveelt om 100 μL competente cellen te gebruiken voor één transformatie14,is de transformatie-efficiëntie van commerciële DH10Bac E. coli competente cellen zo hoog als 1 x10 8 kve/ μg DNA, dus we gebruiken slechts 4 μL. Dit is genoeg voor elke transformant om geïsoleerde witte recombinante kolonies te verkrijgen voor de bacmide DNA-isolatie. Aanhangende Sf9-cellen in de 24-put transfectieplaat werden gezaaid met een celdichtheid van 2 x10 5 /ml in 0,5 ml serumvrije insectenmedia. Dit volume is voldoende om een gelijkmatige dekking van het werkoppervlak van de put te garanderen. Tegelijkertijd verdunt het de transfectiemix niet te veel, wat de transfectie-efficiëntie verbetert. Transfectiereagentia zijn niet giftig voor de Sf9-cellen en media-uitwisseling is niet nodig. In plaats van een mediawissel wordt na 4-5 uur na transfectietijd nog eens 1,5 ml media met 10% (v/v) FBS in de transfectieplaat toegevoegd om de celgroei te vergemakkelijken. De transfectie-efficiëntie van beide transfectiereagentia is hoog. Toch verschijnen met X-tremeGene 9 de tekenen van infectie in de getransfecteerde cellen (figuur 2) 10-12 uur eerder dan bij het JetPrime-reagens, dus we kiezen tussen deze reagentia, afhankelijk van het werkschema van de volgende stappen in de protocollen, wat enige flexibiliteit biedt in het algehele proces.
Eiwittestexpressiescreening kan worden opgezet met P2-virussen als de hoeveelheid van de initiële recombinante virussen, verzameld uit de transfectieplaat en gelabeld als P1, een beperkende factor is om te gebruiken voor de eiwitexpressiescreening.
Overwegingen bij het verplaatsen van kleine naar grote cultuurvolumes. Historisch gezien werd aangenomen dat optimale celgroei een hoog luchtruim vereist in de suspensiecultuur van Sf9-celonderhoud en opschalproducties. In 2014 werd echter gemeld dat het hoge luchtruim in kweekschepen minder kritisch is dan eerder werd gedacht17. Een kweekvat dat is opgezet met behulp van de juiste aangepaste schudsnelheid naar de orbitale worp van het schudplatform, zal voldoende zuurstofoverdracht bieden, zelfs in de suspensiecultuur met een hoog vulvolume door kleine luchtbellen voor een langere tijd te creëren en te behouden. Met deze aanpak kunnen in de handel verkrijgbare insectencellen met een hogere schudsnelheid worden gekweekt binnen een normaal bereik van de verdubbelingstijd van de cellen zonder dat dit ten koste gaat van de hoge levensvatbaarheid van de cellen.
Zo zijn we 6 jaar geleden begonnen met het verhogen van het suspensiekweekvolume in een schudkolf tijdens celonderhoud en introduceerden we een ander type kweekvat voor eiwitproductie terwijl we de schudomstandigheden aanpasten en controleerden (figuur 6). Om optimale omstandigheden in deze kweekvaten vast te stellen, hebben we de Sf9-celkweekparameters bewaakt, zoals celverdubbelingstijd, samen met cel levensvatbaarheid, grootte en vorm, staat van aggregatie en infecteerbaarheid van cellen.
Bijvoorbeeld, voor Sf9 cel onderhoud, in de 2.8 L Fernbach shake kolven, kweek we 2 L in plaats van 0.8 L van de Sf9 suspensiecellen schudden bij 150 tpm bij 27 °C en de levensvatbaarheid van de cel is meestal dicht bij 99%, met gelijkmatig gevormde gezonde delende cellen. Voor de opschamproductie infecteren we 4 L cellen in 5 L reagensflessen die op hoge snelheid schudden als 145 tpm bij een verlaagde temperatuur van 25 °C. De meest gebruikte incubators met een ingebouwd schudplatform kunnen 6 x 2,8 L schudkolven of 6 x 5 L reagensflessen of 10 x 2,5 L Tunair-shakekolven bevatten. De capaciteit van het ene schudplatform, als we Fernbach-schudkolven en reagensflessen vullen tot 1/3 versus tot het hoge vulvolume van de vaten, is dus 4,8 L versus 12 L met 2,8 L Fernbach-schudkolven en 10 L versus 24 L met 5 L reagensflessen (figuur 6). Het onderhoud van de ophangcelcultuur en de opschafproductie in de kweekvaten met een hoog vulvolume hebben ons geholpen de beperkingen van de productievolumes te overwinnen en een grootschalig platform te adopteren. Dit is dus zeer nuttig voor laboratoria zonder toegang tot bioreactoren en/of beperkte ruimte in de productiepijplijnen.
Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor de productie en zuivering van eiwitconstructies met verschillende affiniteitstags door geschikte harsen te gebruiken en zuiveringsbuffers te wijzigen, zoals is beschreven in het sgc-gepubliceerde paper6 voor de met vlag getagde full-length eiwitten van PRMT4, 7, 9 en het His-tagged PRMT5-MEP50-complex en PRMT6. Hoewel we een BEVS-protocol beschrijven voor de PRMT-familie van eiwitten, kan dezelfde aanpak worden toegepast op elke andere eiwitfamilie.

Eiwit arginine methyltransferases (PRMT's) methylaat arginine residuen in een monomethyl of symmetrisch/asymmetrisch dimethyl mode. De repetitieve RG/RGG/GRG-sequenties hebben bij de meeste PRMT 's de voorkeur en zijn te vinden in een grote verscheidenheid aan eiwitten1,2. Arginine gemethyleerde eiwitten zoals histonen of transcriptiefactoren en splicingfactoren reguleren transcriptie, splicing en chromatinestructuur3,4. Toenemende kennis van diverse regulatie van substraat- en cofactorgebruik, omzet en kinetiek van PRMT's, evenals de generatie van selectieve remmers, hebben mechanistisch licht geworpen op deze enzymen en hun complexen5,6. Niet alle PRMT-familieleden worden echter in dezelfde mate bestudeerd; PRMT9 werd bijvoorbeeld pas onlangs ontdekt als lid van de PRMT-familie1. Structuur- en enzymfunctiestudies voor deze eiwitten vereisen voldoende, vaak milligram, hoeveelheden recombinant eiwit om beschikbaar te zijn.
Het Escherichia coli (E. coli) prokaryotische expressiesysteem is meestal de eerste keuze voor expressiescreening met behulp van meerdere constructies voor een bepaald eiwit7,8,9. E.coli-gebaseerde expressie resulteert echter niet altijd in voldoende hoeveelheden PRMT-eiwitten in hun actieve vormen, zoals we met name hebben opgemerkt voor PRMT5 en PRMT7 (zie hieronder). Prst's die zich niet in E. coli uitdrukken of door de eukaryotische expressiemachines moesten worden geproduceerd, werden dus onderverdeeld in vectoren die geschikt waren voor de expressiescreening in het alternatieve baculovirusexpressievectorsysteem (BEVS). Terwijl E. coli-uitgedrukte monsters van PRMT1, PRMT3 en PRMT8 uitgebreid zijn gebruikt voor in vitro assays en kristallografie, vereisen andere PRMT's zoals PRMT5, waarvoor MEP50-bindende partner van zijn dual methyltransferase-domein vereist is, en PRMT's zoals PRMT7 en 9, insectencelexpressie om voldoende hoeveelheden actief eiwit te verkrijgen. Over het algemeen hebben de gestandaardiseerde methyltransferase-assays met gemiddelde doorvoer voor PRMT4, 5, 6, 7 en 9 de BEVS gebruikt in insectencellen6. Het baculovirusexpressievectorsysteem (BEVS) is een veelzijdig platform voor de productie van recombinante eiwitten die de eukaryotische expressiemachines vereisen die post-translationele modificaties mogelijk maken die essentieel zijn voor biochemische, biofysische en structurele studies10,11,12. Verschillende BEVS'en zijn commercieel beschikbaar gekomen sinds het eerste gemelde gebruik van baculovirussen in 1983 voor eiwitexpressie13. De meeste van deze protocollen gebruiken verschillende strategieën voor de overdracht van de expressie plasmide in insectencellen. Deze omvatten Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, enz. Ons protocol is gebaseerd op het meest gebruikte systeem in BEVS, het Bac-to-Bac-systeem14, dat is ontworpen om het gen /cDNA dat codeert voor het eiwit van belang (POI, hier de PRST's) over te brengen naar het baculovirusgenoom dat wordt gehandhaafd in een gespecialiseerde stam van E. coli via sitespecifieke omzetting15.
Kortom, de plasmide transfervector met het gen van belang werd omgezet in DH10Bac E. coli competente cellen om recombinant virale bacmid DNA te genereren. Aanhangend Sf9 cellen werden vervolgens getransfecteerd met bacmid DNA. Vier tot vijf dagen na transfectie werden de eerste recombinante baculovirussen die in het celkweekmedium werden uitgescheiden, teruggevonden en gelabeld als het P1-virus. De P1-baculovirusvoorraden werden vervolgens gebruikt voor virusversterking (d.w.z. generatie van P2-baculovirusvoorraden) en eiwitexpressiescreening. Op basis van de resultaten van de expressiescreening werden P2-virussen voor de beste expressieconstructie van het eiwit geïdentificeerd en gebruikt om suspensieculturen van met baculovirus geïnfecteerde insectencellen (SCBIIS) te genereren voor de grootschalige eiwitproductie. Hier beschrijven we onze gedetailleerde protocollen en beschrijven we de beweegredenen achter onze reagens- en kweekvatkeuzes ter ondersteuning van onze strategie om een meer tijdsefficiënte, kostenefficiënte en schaalbare methodologie te ontwikkelen om voldoende hoeveelheden gewenste recombinante eiwitten te verkrijgen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.8L Nalgene&#160; Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>29171-854</td>
			<td>For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Blocks RB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19583</td>
			<td>For incubation of&#160; 4ml of suspension&#160; Sf9 cells&#160; for protein&#160; expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5671095</td>
			<td>For SDS-PAGe analysis of the purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Reagent Reservoir</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229290</td>
			<td>&#160;Reservoir used for diluted transfection reagent&#160; and Sf9 cells suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cap mat, for use with square well, 2 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>381080</td>
			<td>Used to cover 96 well block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>For LB-agar selection paltes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airpore Tape Sheets</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19571</td>
			<td>To cover 24 well blocks for protein expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allega X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacmid DNA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>non-catalog item</td>
			<td>Bacmid DNA for baculovirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-Gal, 1g</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA 8.1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30722116</td>
			<td>Tissue&#160; culture treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Resuspension Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCRS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell&#160;Lysis Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCLS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR&#160; Tissue Culture Plates, 96 well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td>For transfection mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 1250, filter reload, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>94420818</td>
			<td>Tips for&#160; programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (25 mM each)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1-ClipTip&#160; Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 &#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4672090BT</td>
			<td>Programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4&#160; XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 &#956;L</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>LTS EA6-300XLS</td>
			<td>Ranin adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 &#181;m ultra high molecular weight polyethylene membrane</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>201005-100</td>
			<td>For protein purification in expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>SS-6003C</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 10x10ml</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>301-045-LL</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue, Ultrafast Protein Stain</td>
			<td>Expedeon Protein Solutions</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td>For protein gel (SDS-PAGE) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>IPT001.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPRIME Transfection Reagent&#160; Provided with&#160; jetPRIME buffer</td>
			<td>POLYPLUS TRANSFECTION Inc</td>
			<td>114-01</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&#38;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterblock 96 deep well 2.4mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>780285-FD</td>
			<td>Used in the transformation and expression screening procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10361012</td>
			<td>Competent cells for bacmid DNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartorius 725240</td>
			<td>12 channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization Solution, 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKNS0500</td>
			<td>For bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick&#160; Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td>Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX&#160; Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 500ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-500</td>
			<td>For&#160; suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 125ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-125</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 250ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-250</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe&#160;Nucleic&#160;Acid&#160;Staining&#160;Solution</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, 0.9&#160;mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKPMRN30</td>
			<td>For suspension buffer for bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roll &#38; Grow Spherical Glass Plating Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>115000550</td>
			<td>For&#160; spread&#160; of bacterial&#160; cells across the surface of an agar plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LTS-A-300&#956;L-768/8 (tips)</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>30389253</td>
			<td>Tips for ranin multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian</td>
			<td>cytivalifesciences</td>
			<td>SH3039602</td>
			<td>Addition to the serum free medim for&#160; the transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12659017</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td>
			<td>Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td>SH3027802</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape Pad</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td>Tape Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hcl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TET701.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For&#160; assessment of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITLAB&#160; Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>V100889</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Digital Mini Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10055-006</td>
			<td>Incubator for adherent Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-606</td>
			<td>Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA73370-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGene 9 DNA&#160; Transfection Reagent&#160; 1.0 M</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system

Eiwit arginine methyltransferases (PRMTs) methylaat arginine residuen op een breed scala van eiwitten die een rol spelen in tal van cellulaire processen. PRMT's kunnen mono- of dimethylaat arginine guanidino groepen symmetrisch of asymmetrisch. De enzymologie van deze eiwitten is een complex en intensief onderzocht gebied dat milligramhoeveelheden recombinant eiwit van hoge kwaliteit vereist. Het baculovirus expressie vectorsysteem (BEVS) met behulp van Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) en Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insectencellen is gebruikt voor expressie screening en productie van vele PRMT's, waaronder PRMT 1, 2 en 4 tot en met 9. Om tegelijkertijd te screenen op de expressie van meerdere constructies van deze eiwitten, waaronder domeinen en afgeknotte fragmenten, evenals de volledige eiwitten, hebben we schaalbare methoden toegepast met behulp van instelbare en programmeerbare meerkanaals pipetten, gecombineerd met 24- en 96-put platen en blokken. Over het algemeen maakten deze methodeaanpassingen een grootschalige generatie bacmide-DNA, recombinante virussen en eiwitexpressiescreening mogelijk. Het gebruik van kweekvaten met een hoog vulvolume van Sf9-celsuspensie hielp om ruimtebeperkingen in de productiepijplijn te overwinnen voor grootschalige eiwitproductie in één batch. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor de efficiënte en kosteneffectieve expressie van functionele PRST's voor biochemische, biofysische en structurele studies.

Een overzicht van het BEVS-protocol is beschreven in figuur 1. Meerdere expressieconstructies van PRST's, waaronder full-length, domeinen en afgekapte fragmenten, werden gegenereerd in het Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) volgens interne strategieën met een poging om het slagingspercentage te verhogen voor het identificeren van oplosbare en stabiele eiwitten met een relatief hoog expressieniveau7,9. Geïnteresseerde lezers worden aangemoedigd om de definities en methodologie van de SGC te herzien om een "fragment" te ontwerpen als het segment van de gensequentie dat is opgenomen in een expressiekloon, "domein" als een pfam-geannoteerd structureel domein en "construct" als het fragment gekloond in een expressievector, die allemaal in detail zijn beschreven in een eerdere publicatie7. Expressieconstructies van PRMT's die in dit protocol worden gepresenteerd, zijn voor de productie van de polyhistidine-gelabelde eiwitten gekloond in de pFBOH-MHL-vector, een afgeleide van de pFastBac1-vector. In figuur 4presenteren we SDS-PAGE-analyse van de met zijn gelabelde oplosbare constructies van PRMT1, 2, 4-9 gezuiverd uit pellets verzameld na 4 ml productie in Sf9-cellen (stap 3.1.4). Full-length (FL) PRMT1 en PRMT9 worden niet gepresenteerd in deze gel, aangezien FL PRMT1 is geproduceerd uit E. coli, en FL PRMT9 geproduceerd door BEVS is gezuiverd door Flag-tag6. De afgeknotte constructies van PRMT1, FL PRMT4 en alle PRMT8-constructies vertonen een relatief hoge opbrengst, maar eiwiteluaten bevatten fracties van co-gezuiverde verontreinigingen. Deze constructies vereisen verdere optimalisatie van de zuiveringsprotocollen. Er zijn dus aanvullende benaderingen nodig om de zuiverheid van deze eiwitten uit opschakproducties te verbeteren, zoals een vermindering van de hoeveelheid nikkelparels in het stadium van de incubatie met een verduidelijkt lysaat; een verhoging van de imidazolconcentraties in de wasbuffers; decolleté van de His-tag met TEV protease, gevolgd door toepassing op een Ni-affiniteitshars; en aanvullende zuiveringsstappen zoals grootte-uitsluiting en ionenuitwisselingschromatografie. De constructies van PRMT2 vertonen een aanzienlijk lagere opbrengst in vergelijking met andere eiwitten en full-length PRMT2-eiwitten, vergezeld van een sterke verontreinigingsband. Scale-up productie en twee stappen van zuiveringen zoals IMAC en grootte-uitsluiting bevestigden een laag expressieniveau voor deze constructie, samen met de aanhoudende aanwezigheid van de co-zuiverende verontreiniging voor het FL-eiwit. Pure eiwitten zijn verkregen voor het PRMT5-complex dat is geproduceerd en gezuiverd met zijn obligate bindende partner, MEP50. De afgeknotte constructie van PRMT9 heeft bijna twee of drie keer lager expressieniveau, dicht bij 1,5 mg/L, in vergelijking met andere PRMT's. Niettemin zijn de recombinante virale voorraden van deze constructie gebruikt voor de opschalproductie, werden diffracerende kristallen verkregen en werd de structuur voor dit eiwit opgelost, samen met PRMT4, 6 en 7 (figuur 5).
Voor de opschafproducties werden de overeenkomstige P2-virussen gebruikt om de suspensiecultuur van Sf9-insectencellen te infecteren. Deze stap genereert 50/100/200 ml met baculovirus geïnfecteerde cellen die geïnfecteerde cellen en P3-virussen in het supernatant bevatten. Voor de grootschalige eiwitproductie werden 2 L Sf9-cellen gekweekt in elk van de 2,8 L Fernbach-schudkolven bij 150 tpm, 27 °C (figuur 6). Op de dag van productie > 2 L Sf9-cellen (levensvatbaarheid van cellen 97%) in 2,5 L Tunair shakekolven of 4 L in 5 L reagensflessen werden verdund tot een celdichtheid van 4 x 106/ml. Deze cellen werden rechtstreeks geïnfecteerd met 10-12 ml/l suspensiekweek van met baculovirus geïnfecteerde insectencellen en geïncubeerd bij een verlaagde temperatuur van 25 °C bij 145 tpm. Infectie van de productiebatch rechtstreeks met een suspensiecultuur van met baculovirus geïnfecteerde insectencellen verminderde aanzienlijk moeizame en tijdrovende stappen in de versterking van het virusvolume, met uitzondering van de extra behandeling van de geïnfecteerde cellen, en voorkwam vermindering van titer- en virusdegradatie. Het onderhoud en de opschafproductie van SF9-celkweek zijn uitgevoerd in de kweekvaten met een hoog vulvolume om een grootschalige eiwitproductie in één batch aan te nemen (figuur 6).
Full-length PRMT 4, 5 (in complex met MEP50), 6, 7, en 9 eiwitten geproduceerd uit het Baculovirus gemedieerde productieplatform zijn gebruikt voor kinetische karakterisering en remmer compound screening op de SGC6. Kristalstructuren werden opgelost en afgezet in de Protein Data Bank (PDB) voor de volledige of afgeknotte vormen van de eiwitten PRMT 4, 6, 7 en 9 met verschillende chemische sondes en remmers. Expressieplasmiden voor deze PRST's werden gedeponeerd in de Addgene plasmid repository (Addgene is een distributiepartner van de SGC, https://www.addgene.org/) en zijn beschikbaar voor de onderzoeksgemeenschap (Figuur 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg"> Figuur 1: Schematisch overzicht van de stappen van het baculovirus expressieproces <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg"> Figuur 2: Baculovirus Geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde Sf9-cellen. Tekenen van infectie zijn structurele veranderingen in de insectencellen, zoals een toename van 25-50% in de celdiameter, vergrote celkernen, gelijkmatig afgeronde vorm, verlies van proliferatie en aanhankelijkheid aan het oppervlak van de kweekschaal, evenals een afname van de levensvatbaarheid van de cel. Witte schaalbalk 200 μm. De hier gepresenteerde tekenen van infectie zijn hetzelfde voor de getransfecteerde cellen met behulp van zowel transfectiereagentia, JetPrime en X-tremeGene 9. Het getoonde voorbeeld is voor het JetPrime transfectie reagens. (A) Niet-geïnfecteerde Sf9-cellen als besturingselement. (B) Met baculovirus geïnfecteerde Sf9-cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg"> Figuur 3: Bindplaatassemblage voor snelle zuivering van testexpressie-eiwitten. Zie tekst voor meer informatie, stappen 3.2.1-2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg"> Figuur 4: Resultaten van de screening van eiwitexpressie. Eiwitexpressiescreeningsresultaten van de baculovirusgemedieerde eiwitproductie in 4 ml Sf9-suspensiecultuur die is geïnfecteerd met overeenkomstige P1-recombinante virussen voor verschillende PRMT's en het PRMT5-MEP50-complex. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg"> Figuur 5: Samenvatting van expressieconstructies voor PRMT4, 6, 7 en 9 gebruikt voor kristalstructuurstudies bij het Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC). De kristalstructuren werden opgelost en afgezet in de Protein Data Bank (PDB) voor de volledige lengte of afgeknotte vormen van eiwitten PRMT 4, 6, 7 en 9 met verschillende chemische sondes en remmers. Expressieplasmiden voor deze PRCT's werden gedeponeerd in de Addgene plasmid repository en zijn beschikbaar voor de onderzoeksgemeenschap (Addgene is een distributiepartner van de SGC, https://www.addgene.org/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg"> Figuur 6: Sf9 insectencelonderhoud en eiwitproductie in de verschillende kweekvaten: (A) 2,8 L Fernbach kolf voor celonderhoud en eiwitproductie. Het gebruik van het vulvolume van 72% verhoogt de doorvoersnelheid met 2,5 keer in één schudplatform. (B) Tunair shakekolven (slechts 9 van de 10 kolven zijn op deze foto weergegeven) en reagensflessen met een vulvolume van 80% verhogen de productiecapaciteit van het schudplatform drastisch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Het baculovirus expressie vectorsysteem (BEVS) is een robuust platform voor expressiescreening en productie van eiwit arginine methyltransferases (PRMT's) voor biochemische, biofysische en structurele studies. Milligram hoeveelheden materiaal kunnen worden geproduceerd voor de meerderheid van PRMT's en andere eiwitten van belang die een eukaryotische expressie platform vereisen.

Productie van recombinante PRMT-eiwitten met behulp van het Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Het algemene doel van dit protocol is expressie screening van meervoudige constructie van eiwit arginine methyltransferases in grootschalige productie om de milligram hoeveelheid van het eiwit te verkrijgen voor biochemische, biofysische en structurele studies in het medium ondersteunde, kostenefficiënte modus in de dekking van expressieplatform S, baculovirus expressie vector systeem. Dr.Alma Seitova zal de volgende stappen presenteren. Verdun de exponentieel groeiende SF9-cellen tot de uiteindelijke celdichtheid van 0,4 miljoen per mil in de serumvrije insectenmedia en giet in het steriele reagensreservoir.Gebruik een programmeerbare meerkanaals pipet om 0,5 mils van de verdunde SF9-cellen naar elke put van de 24-putplaat te zaaien. Dit volume is voldoende om een gelijkmatige dekking van het werkoppervlak van de put te garanderen. Tegelijkertijd verdunt het de transfectiemix niet te veel, wat transfectie-efficiëntie mogelijk maakt.Label één put van de plaat alleen als cel en gebruik deze als een controle voor de vergelijking van de getransfecteerde en niet-getransfecteerde cel om te beoordelen op mogelijke tekenen van infectie. Incubeer de platen op 27 graden tot het nodig is, ongeveer een uur, om de cellen zich aan de celkweekplaten te laten hechten. Verdun goed gemengd transfectiereagens in het niet-aangevulde insectenmedium en een steriel reagensreservoir en meng voorzichtig gedurende 10 seconden.Breng met behulp van een 12-kanaals pipet 102 microliters van het verdunde transactiereagens over in een steriele 96 MicroWell-plaat. Breng 10 microliter van 0,2 microgram per microliter recombinant bacmide-DNA over in de overeenkomstige put van de 96-well MicroWell-plaat en meng door zachtjes te schudden en de plaat van de zijkanten te tikken. Incubeer de transfectiemix gedurende 15 tot 20 minuten voor een complexe formatie.Met behulp van een verstelbare zeskanaals pipet die is ontworpen voor de overdracht tussen een 96- en 24-putplaat, bedekt u de transfectiemix op de cellen in overeenkomstige putten van de transfectieplaten en incubeert u gedurende vier uur bij 27 graden. Om een gelijkmatige verdeling van de transfectiemix over de monolaag van de cellen te garanderen, schommelt u de platen tijdens de incubatietijd voorzichtig meerdere keren heen en weer. Voeg vier tot vijf uur na transfectietijd 1,5 mils serumvrije insectenmedia toe.Vul het aan met 10% finale van warmte-inactief foetale runderserum en 1% antibioticum en antimycoticum. Incubeer cellen in een incubator van 27 graden gedurende 72 tot 96 uur. Schommel indien mogelijk één keer per dag voorzichtig met de transfectieplaten.Zoek naar tekenen van infectie die zichtbaar zijn in getransfecteerde cellen op 72 tot 96 uur na transfectietijd. Vier tot vijf dagen na transfectie moeten tekenen van infectie zichtbaar zijn in de getransfecteerde cellen in vergelijking met de controlecellen onder een omgekeerde microscoop, en de eerste recombinante baculovirussen die in het celkweekmedium worden uitgescheiden, moeten klaar zijn om te verzamelen. Gebruik een programmeerbaar elektronisch meerkanaals om tegelijkertijd de verzameling van P1-virussen mogelijk te maken, de infectie van vers gezaaide SF9-cellen in de infectie van suspensiecellen in hun 24 putblokken met 150 microliters van de P1-virussen.Draai de rest van de collectieve P1 virale voorraden gedurende 15 minuten, bedek de 24 putblokken met suspensiecultuur van de geïnfecteerde SF9-cellen met een AirPore-vel. Incubeer de 24 putblok op 27 graden met schudden bij 245 RPMs gedurende 72 tot 96 uur. Vier dagen voor de geplande productietijd splitste exponentieel groeiende SF9-cellen, met een uiteindelijke celdichtheid van 2 miljoen per mil in Erlenmeyer glasshake floss met baffles in serumvrije insectenmedia met 1% definitief antibioticum en antimycoticum.Deze stap genereert suspensiecultuur van geïnfecteerde insectencellen en P2-virussen in het supernatant voor de infectie van nieuwe cellen in de productiebatch. Voeg de overeenkomstige P2-virussen toe en incubeer geïnfecteerde cellen bij de lagere temperatuur van 25 graden om de celgroei te vertragen, schuddend bij 165 RPMs op een orbitale shaker met een slag van één inch. Vier dagen voor de geplande productietijd zaait Seed twee liter exponentieel groeiende SF9-cellen in insectenserumvrije media tot de celdichtheid van 1 miljoen per mil, in de 2,8 liter Fernbach-shakekolf.Schud de kolf op 27 graden met schudden bij 150 RPMs. Onderzoekswetenschapper Ashley Hutchinson zal het volgende protocol demonstreren. Splits vier liter exponentieel groeiende SF9-cellen en insectenserumvrije media tot de uiteindelijke celdichtheid van 4 miljoen per mil in de grote reagensflessen van vijf liter.Voeg 10 tot 12 mils van de suspensiecultuur van de met baculovirus geïnfecteerde insectencellen toe. Incubeer de geïnfecteerde cultuur van de SF9-cellen in een shaker die 145 RPM schudt bij een lagere temperatuur van 25 graden Celsius gedurende 72 tot 96 uur. Milligramhoeveelheden van verschillende recombinante eiwitten uit de PRMT-familie drukken zich uit in de onmiddellijke productie van het baculovirus in SF9-cellen en worden gebruikt voor biochemische biofysische instructiestudies, zoals te zien is in figuur vijf.Bij sgc, werden de kristalstructuren opgelost in gedeponeerd in de eiwitdatabank voor de volledige lengte of afgeknotte vormen van de proteïnen PRMT4, 6, 7, en 9 met diverse chemische sonde en inhibitoren. Expressieplasmiden voor deze PRMT's werden gedeponeerd om genverzameling door SGC toe te voegen en zijn beschikbaar voor de onderzoeksgemeenschap. In deze video hebben we de nadruk gelegd op belangrijke elementen voor een succesvolle expeditiescreening van hun meervoudige constructie van de eiwit arginine methyltransferases in de grootschalige productie in het baculovirus expressiesysteem.Het gebruik van de reguliere verstelbare en programmeerbare meerkanaals pipetten maakte hun hele proces sneller dan efficiënt. Gebruik van hoogwaardige en minder celtoxische cellen voor de cellen, transfectiereagens voor de generatie van recombinante virussen leidde tot kostenefficiënter en dit transfectieprotocol voor celbehandeling. Infectie van de grootschalige partij voor eiwitproductie met suspensiecultuur van baculovirus geïnfecteerd in zes cellen verminderde de arbeid aanzienlijk in tijdrovende stap in vitale starterversterking.Is bijvoorbeeld het centrifugaal maken van dit met speciale cultuur van geïnfecteerde cellen. Dat is natuurlijk in uitgesloten de extra behandeling van de geïnfecteerde cellen in voorkomen in hun strakkere in virusafbraak. Het onderhoud van de ophangcultuurkweekcel in deze schaalvergrotingsproductie in het kweekschip was een hoog veldvolume dat ons hielp om de beperking van het productievolume te overwinnen en een grootschalig platform te adopteren.Dit is zeer nuttig voor de laboratoria zonder toegang tot de bioreactoren of beperkte ruimte in de productiepijplijn. Hoewel ons protocol is beschreven voor de eiwitten van de eiwit arginine methyltransferases familie, dezelfde aanpak kan worden toegepast op elke andere eiwitfamilie die expressieplatform nodig heeft om een voldoende hoeveelheid van hun eiwit te verkrijgen voor biochemische biofysische instructiestudies.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Proteïne Expressie, Kristallisatie en Biofysische Studies van a<em&gt; Bacillus</em&gt; -conserveerd nucleotide pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Voorbijgaande expressie in Nicotiana Benthamiana verlaat voor de productie van de Triterpene op een voorbereidende schaal

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Wijzigen Baculovirus expressievectoren voor de productie van plantaardige eiwitten in Insect cellen uitgescheiden

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

De grootschalige productie van recombinante RNAs op een circulaire steiger met behulp van een systeem van Viroïde afkomstige in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Gebruik van recombinante Fusion eiwitten in een fluorescerende Protease Assay Platform en hun In-gel renaturatie

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering van membraan transporters door Heterologeuze expressie in E. coli en productie van membraan blaasjes

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Celvrije productie van proteoliposomen voor functionele analyse en antilichaamontwikkeling gericht op membraaneiwitten

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...