Name: production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System at JoVE.com

Les auteurs souhaitent remercier Dalia Barsyte-Lovejoy d’avoir pris le temps de fournir des commentaires précieux et critiques sur le manuscrit et tous nos collègues de la CGT qui ont travaillé avec la famille de protéines PRMT exprimées à partir du système vectoriel d’expression du baculovirus.
Le CGS est un organisme de bienfaisance enregistré (numéro 1097737) qui reçoit des fonds d’AbbVie, bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Génome Canada par l’entremise de l’Institut de génomique de l’Ontario [OGI-196], de l’UE et de l’EFPIA par l’entremise de l’entreprise conjointe Innovative Medicines Initiative 2 [subvention EUbOPEN 875510], de Janssen, de Merck KGaA (alias EMD au Canada et aux États-Unis), de Pfizer, de Takeda et du Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].

<ol>
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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

L’un des avantages du BEVS dans les cellules d’insectes se concentre sur la capacité de la machinerie de modification post-traductionnelle à permettre des modifications plus complexes telles que la phosphorylation, la myristoylation et la glycosylation. Associées au repliement très efficace des protéines de mammifères, ces modifications facilitent de grandes quantités de protéines modifiées et repliées adaptées aux expériences en aval physiologiquement pertinentes16.
Ici, nous avons décrit les protocoles détaillés du BEVS mettant l’accent sur les éléments critiques pour le criblage réussi de l’expression de multiples constructions de protéines PRMT et la production à grande échelle de protéines PRMT dans la plate-forme d’expression de Baculovirus: 1) L’utilisation de pipettes multicanaux régulières, réglables et programmables pour transférer les matériaux biologiques entre 24 et 96 - plaques et blocs de culture cellulaire de puits aux stades de la génération d’ADN bacmid et de virus; une collection des virus recombinants, une amplification des volumes viraux des virus recombinants et la préparation des blocs de criblage de l’expression protéique. 2) Réactifs de transfection haute performance et rentables pour la génération de virus recombinants. 3) Culture en suspension de cellules d’insectes infectées par le baculovirus (SCBIIC) pour la production de protéines à grande échelle. 4) Utilisation de fioles de secouage Fernbach à volume élevé de 2,8 L pour maintenir la culture en suspension sf9 et de flacons de secouer Tunair de 2,5 L et de bouteilles de réactifs de 5 L pour la production de protéines à grande échelle.
Considérations spéciales et justification des étapes de transformation et de transfection. Bien qu’un protocole commercial recommande d’utiliser 100 μL de cellules compétentes pour une transformation14,l’efficacité de transformation des cellules commerciales compétentes en DH10Bac E. coli est aussi élevée que 1 x 108 ufc / μg d’ADN, nous n’utilisons donc que 4 μL. Ceci est suffisant pour que chaque transformant obtienne des colonies recombinantes blanches isolées pour l’isolement de l’ADN bacmid. Les cellules Sf9 adhérentes dans la plaque de transfection de 24 puits ont été ensemencées à une densité cellulaire de 2 x10 5 /mL dans 0,5 mL de milieux d’insectes sans sérum. Ce volume est suffisant pour assurer une couverture uniforme de la surface de travail du puits. Dans le même temps, il ne dilue pas trop le mélange de transfection, ce qui améliore l’efficacité de la transfection. Les réactifs de transfection ne sont pas toxiques pour les cellules Sf9, et l’échange de médias n’est pas nécessaire. Au lieu d’un changement de support, un support supplémentaire de 1,5 mL contenant 10% (v / v) FBS est ajouté dans la plaque de transfection à 4-5 heures après le temps de transfection pour faciliter la croissance cellulaire. L’efficacité de transfection des deux réactifs de transfection est élevée. Pourtant, avec X-tremeGene 9, les signes d’infection dans les cellules transfectées (Figure 2) apparaissent 10-12 h plus tôt qu’avec le réactif JetPrime, nous choisissons donc entre ces réactifs en fonction du calendrier de travail des prochaines étapes des protocoles, ce qui offre une certaine flexibilité dans le processus global.
Le criblage d’expression de test de protéine peut être mis en place avec des virus P2 si la quantité des virus recombinants initiaux, recueillis à partir de la plaque de transfection et étiquetés comme P1, est un facteur limitant à utiliser pour le criblage d’expression de protéine.
Considérations lors du passage de petits à grands volumes de culture. Historiquement, on croyait que la croissance cellulaire optimale nécessite un espace d’air élevé dans la culture de suspension de la maintenance des cellules Sf9 et des productions à l’échelle. Cependant, en 2014, il a été signalé que l’espace en haute mer dans les navires de culture est moins critique qu’on ne le pensait auparavant17. Un récipient de culture installé à l’aide d’une vitesse de secousse ajustée de manière appropriée au jet orbital de la plate-forme de secousse fournira un transfert d’oxygène suffisant même dans la culture de suspension à volume de remplissage élevé en créant et en maintenant de petites bulles d’air pendant une période plus longue. Avec cette approche, les cellules d’insectes disponibles dans le commerce peuvent être cultivées à une vitesse de secousse plus élevée dans une plage normale du temps de doublement des cellules sans sacrifier la viabilité cellulaire élevée.
Ainsi, il y a 6 ans, nous avons commencé à augmenter le volume de culture en suspension dans une fiole secouée pendant l’entretien des cellules et avons introduit un type différent de récipient de culture pour la production de protéines tout en ajustant et en surveillant les conditions de secousse (Figure 6). Pour établir des conditions optimales dans ces vaisseaux de culture, nous avons surveillé les paramètres de culture cellulaire Sf9 tels que le temps de doublement cellulaire ainsi que la viabilité, la taille et la forme des cellules, l’état d’agrégation et l’infectiosité des cellules.
Par exemple, pour l’entretien des cellules Sf9, dans les flacons de shake de Fernbach de 2,8 L, nous cultures 2 L au lieu de 0,8 L des cellules de suspension Sf9 secouant à 150 tr / min à 27 ° C et la viabilité cellulaire est proche de 99%, avec des cellules de division saines de forme uniforme. Pour la production à grande échelle, nous infectons 4 L de cellules dans des bouteilles de réactifs de 5 L secouant à grande vitesse à 145 tr / min à une température abaissée de 25 ° C. Les incubateurs les plus couramment utilisés avec une plate-forme de secousse intégrée peuvent contenir des flacons de secouage de 6 x 2,8 L ou des bouteilles de réactif de 6 x 5 L, ou des flacons de secouage Tunair de 10 x 2,5 L. Ainsi, la capacité de la plate-forme de secousse unique, si nous remplissons les flacons de secouage Fernbach et les bouteilles de réactifs à 1/3 par rapport au volume de remplissage élevé des récipients est de 4,8 L contre 12 L en utilisant des flacons de secouer Fernbach de 2,8 L et de 10 L contre 24 L en utilisant des bouteilles de réactifs de 5 L(Figure 6). L’entretien de la culture cellulaire en suspension et la production à grande échelle dans les récipients de culture avec un volume de remplissage élevé nous ont aidés à surmonter les limites des volumes de production et à adopter une plate-forme à grande échelle. Ainsi, cela est très utile pour les laboratoires qui n’ont pas accès aux bioréacteurs et/ou dont l’espace dans les pipelines de production est limité.
Ce protocole pourrait être facilement adapté à la production et à la purification de constructions protéiques avec différentes étiquettes d’affinité en utilisant des résines appropriées et en modifiant les tampons de purification comme cela a été décrit dans l’article6 publié par SGC pour les protéines pleine longueur marquées par drapeau de PRMT4, 7, 9, et le complexe PRMT5-MEP50 marqué par His et PRMT6. Bien que nous décrivions un protocole BEVS pour la famille prmt des protéines, la même approche peut être appliquée à n’importe quelle autre famille de protéine.

Résidus de méthyltransférases d’arginine de protéine d’arginine d’arginine symétrique ou symétrique/asymétrique. Les séquences répétitives RG/RGG/GRG sont fortement préférées par la plupart des PRMTs et se retrouvent dans une grande variété de protéines1,2. Les protéines méthylées par l’arginine telles que les histones ou les facteurs de transcription et les facteurs d’épissage régulent la transcription, l’épissage et la structure de la chromatine3,4. La connaissance croissante de la régulation diverse de l’utilisation du substrat et des cofacteurs, du chiffre d’affaires et de la cinétique des PRMTs, ainsi que la génération d’inhibiteurs sélectifs, ont apporté une lumière mécaniste sur ces enzymes et leurs complexes5,6. Cependant, tous les membres de la famille prmt ne sont pas étudiés dans la même mesure; par exemple, PRMT9 n’a été découvert que récemment comme appartenant à la famille PRMT1. Les études de structure et de fonction enzymatique de ces protéines nécessitent des quantités suffisantes, souvent en milligramme, de protéines recombinantes pour être disponibles.
Le système d’expression procaryote Escherichia coli (E. coli)est généralement le premier choix pour le criblage d’expression utilisant de multiples constructions pour une protéine donnée7,8,9. Cependant, l’expressionà base de E. coli n’entraîne pas toujours des quantités suffisantes de protéines PRMT sous leurs formes actives, comme nous l’avons noté en particulier pour PRMT5 et PRMT7 (voir ci-dessous). Ainsi, les PRMF qui ne se sont pas exprimé dans E. coli ou qui devaient être produites par la machinerie d’expression eucaryote ont été subclonées en vecteurs appropriés pour le criblage de l’expression dans le système vectoriel d’expression alternative du baculovirus (BEVS). Alors que les échantillons de PRMT1, PRMT3 et PRMT8 exprimés par E. coli ont été largement utilisés pour des essais in vitro et la cristallographie, d’autres PRMT tels que PRMT5, qui nécessite un partenaire de liaison MEP50 de son double domaine de méthyltransférase, et des PRMTts tels que PRMT7 et 9, nécessitent l’expression de cellules d’insectes pour obtenir des quantités suffisantes de protéines actives. Dans l’ensemble, les tests normalisés de méthyltransférase à moyen débit pour PRMT4, 5, 6, 7 et 9 ont utilisé le BEVS dans les cellules d’insectes6. Le système vectoriel d’expression des baculovirus (BEVS) est une plateforme polyvalente pour produire des protéines recombinantes nécessitant la machinerie d’expression eucaryote qui permet des modifications post-traductionnelles essentielles pour les études biochimiques, biophysiques et structurelles10,11,12. Plusieurs BEVS sont devenus disponibles dans le commerce depuis la première utilisation signalée de baculovirus en 1983 pour l’expression des protéines13. La plupart de ces protocoles emploient différentes stratégies pour le transfert du plasmide d’expression dans les cellules d’insectes. Ceux-ci incluent Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, etc. Notre protocole est basé sur le système le plus couramment utilisé dans le BEVS, le système Bac-to-Bac14,qui est conçu pour transférer le gène/ADNc codant pour la protéine d’intérêt (POI, ici les PRMT) dans le génome du baculovirus maintenu dans une souche spécialisée de E. coli via une transposition spécifique au site15.
En bref, le vecteur de transfert de plasmide contenant le gène d’intérêt a été transformé en cellules compétentes DH10Bac E. coli pour générer de l’ADN bacmid viral recombinant. Les cellules Sf9 adhérentes ont ensuite été transfectées avec de l’ADN bacmid. Quatre à cinq jours après transfection, des baculovirus de recombinaison initiaux sécrétés dans le milieu de culture cellulaire ont été récupérés et marqués comme virus P1. Les stocks de baculovirus P1 ont ensuite été utilisés pour l’amplification du virus (c.-à-d. la génération de stocks de baculovirus P2) et le dépistage de l’expression des protéines. Sur la base des résultats du criblage de l’expression, les virus P2 pour la meilleure construction d’expression de la protéine ont été identifiés et utilisés pour générer des cultures en suspension de cellules d’insectes infectées par le baculovirus (SCBIIS) pour la production de protéines à grande échelle. Ici, nous décrivons nos protocoles détaillés et décrivons la raison d’être de nos choix de réactifs et de récipients de culture pour soutenir notre stratégie de développement d’une méthodologie plus rapide, rentable et évolutive pour obtenir des quantités suffisantes de protéines recombinantes souhaitées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.8L Nalgene&#160; Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>29171-854</td>
			<td>For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Blocks RB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19583</td>
			<td>For incubation of&#160; 4ml of suspension&#160; Sf9 cells&#160; for protein&#160; expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5671095</td>
			<td>For SDS-PAGe analysis of the purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Reagent Reservoir</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229290</td>
			<td>&#160;Reservoir used for diluted transfection reagent&#160; and Sf9 cells suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cap mat, for use with square well, 2 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>381080</td>
			<td>Used to cover 96 well block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>For LB-agar selection paltes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airpore Tape Sheets</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19571</td>
			<td>To cover 24 well blocks for protein expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allega X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacmid DNA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>non-catalog item</td>
			<td>Bacmid DNA for baculovirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-Gal, 1g</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA 8.1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30722116</td>
			<td>Tissue&#160; culture treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Resuspension Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCRS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell&#160;Lysis Solution 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKCLS500</td>
			<td>For Bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR&#160; Tissue Culture Plates, 96 well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td>For transfection mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 1250, filter reload, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>94420818</td>
			<td>Tips for&#160; programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (25 mM each)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1-ClipTip&#160; Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 &#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4672090BT</td>
			<td>Programmable and adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4&#160; XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 &#956;L</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>LTS EA6-300XLS</td>
			<td>Ranin adjustable multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 &#181;m ultra high molecular weight polyethylene membrane</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>201005-100</td>
			<td>For protein purification in expression screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>SS-6003C</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 10x10ml</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L</td>
			<td>Wisent Biocenter</td>
			<td>301-045-LL</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue, Ultrafast Protein Stain</td>
			<td>Expedeon Protein Solutions</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td>For protein gel (SDS-PAGE) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>IPT001.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPRIME Transfection Reagent&#160; Provided with&#160; jetPRIME buffer</td>
			<td>POLYPLUS TRANSFECTION Inc</td>
			<td>114-01</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&#38;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterblock 96 deep well 2.4mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>780285-FD</td>
			<td>Used in the transformation and expression screening procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10361012</td>
			<td>Competent cells for bacmid DNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartorius 725240</td>
			<td>12 channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization Solution, 0.5&#160;L</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKNS0500</td>
			<td>For bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick&#160; Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td>Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX&#160; Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 500ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-500</td>
			<td>For&#160; suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 125ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-125</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning&#160; 250ml</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4444-250</td>
			<td>For suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe&#160;Nucleic&#160;Acid&#160;Staining&#160;Solution</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, 0.9&#160;mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSKPMRN30</td>
			<td>For suspension buffer for bacmid DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roll &#38; Grow Spherical Glass Plating Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>115000550</td>
			<td>For&#160; spread&#160; of bacterial&#160; cells across the surface of an agar plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LTS-A-300&#956;L-768/8 (tips)</td>
			<td>Ranin</td>
			<td>30389253</td>
			<td>Tips for ranin multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian</td>
			<td>cytivalifesciences</td>
			<td>SH3039602</td>
			<td>Addition to the serum free medim for&#160; the transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12659017</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td>
			<td>Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td>SH3027802</td>
			<td>Serum free insect cells growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape Pad</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td>Tape Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hcl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TET701.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For&#160; assessment of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITLAB&#160; Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>V100889</td>
			<td>For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Digital Mini Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10055-006</td>
			<td>Incubator for adherent Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#160; Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-606</td>
			<td>Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA73370-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGene 9 DNA&#160; Transfection Reagent&#160; 1.0 M</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system

Protéine arginine méthyltransférases (PRMTs) résidus de méthylate arginine sur une grande variété de protéines qui jouent des rôles dans de nombreux processus cellulaires. PrmTs peut mono- ou diméthylate arginine groupes guanidino symétriquement ou asymétriquement. L’enzymologie de ces protéines est un domaine complexe et intensément étudié qui nécessite des quantités de milligrammes de protéines recombinantes de haute qualité. Le système de vecteur d’expression de baculovirus (BEVS) utilisant des cellules d’insectes à nucléopolyédrovirus multiple d’Autographa californica (AcMNPV) et de Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) a été utilisé pour le dépistage de l’expression et la production de nombreux PRMT, y compris prmt 1, 2 et 4 à 9. Pour dépister simultanément l’expression de plusieurs constructions de ces protéines, y compris les domaines et les fragments tronqués ainsi que les protéines pleine longueur, nous avons appliqué des méthodes évolutives en utilisant des pipettes multicanaux réglables et programmables, combinées à des plaques et des blocs de 24 et 96 puits. Dans l’ensemble, ces ajustements de méthode ont permis une génération à grande échelle d’ADN bacmid, de virus recombinants et de criblage de l’expression des protéines. L’utilisation de récipients de culture avec un volume de remplissage élevé de suspension cellulaire Sf9 a aidé à surmonter les limitations d’espace dans le pipeline de production pour la production de protéines à grande échelle en lot unique. Ici, nous décrivons des protocoles détaillés pour l’expression efficace et rentable des PRMTs fonctionnels pour des études biochimiques, biophysiques, et structurales.

Une vue d’ensemble du protocole BEVS est présentée à la figure 1. De multiples constructions d’expression de PRMTs, y compris des fragments complets, des domaines et tronqués, ont été générées au Consortium de génomique structurelle (SGC, Toronto) selon des stratégies internes dans le but d’augmenter le taux de réussite pour identifier les protéines solubles et stables avec un niveau d’expression relativement élevé7,9. Les lecteurs intéressés sont encouragés à examiner les définitions et la méthodologie de la CGT de la conception d’un « fragment » comme le segment de la séquence de gènes incorporé dans un clone d’expression, « domaine » comme un domaine structurel annoté PFAM et « construction » comme le fragment cloné dans un vecteur d’expression, qui ont tous été décrits en détail dans une publication antérieure7. Les constructions d’expression des PRT présentées dans ce protocole sont destinées à la production des protéines marquées à la polyhistidine clonées dans le vecteur pFBOH-MHL, qui est un dérivé du vecteur pFastBac1. Sur la figure 4,nous présentons l’analyse SDS-PAGE des constructions solubles his-marquées de PRMT1, 2, 4-9 purifiées à partir de pastilles collectées après 4 mL de production dans des cellules Sf9 (étape 3.1.4). Prmt1 pleine longueur (FL) et PRMT9 ne sont pas présentés dans ce gel, puisque FL PRMT1 a été produit à partir de E. coli,et FL PRMT9 produit à partir de BEVS a été purifié par Flag-tag6. Les constructions tronquées de PRMT1, FL PRMT4 et toutes les constructions PRMT8 montrent un rendement relativement élevé, mais les éluats protéiques contiennent des fractions de contaminants co-purifiés. Ces constructions nécessitent une optimisation supplémentaire des protocoles de purification. Des approches supplémentaires sont donc nécessaires pour améliorer la pureté de ces protéines à partir de productions à grande échelle, telles qu’une réduction de la quantité de billes de nickel au stade de l’incubation avec un lysat clarifié; une augmentation des concentrations d’imidazole dans les tampons de lavage; clivage de l’his-tag avec de la TEV protéase, suivi d’une application sur une résine d’affinité Ni ; et des étapes de purification supplémentaires telles que l’exclusion de taille et la chromatographie par échange d’ions. Les constructions de PRMT2 montrent un rendement significativement inférieur par rapport à d’autres protéines et à la protéine PRMT2 pleine longueur accompagnée d’une forte bande de contaminants. La production à grande échelle et deux étapes de purification telles que l’IMAC et l’exclusion de taille ont confirmé un faible niveau d’expression pour cette construction ainsi que la présence persistante du contaminant co-purifiant pour la protéine FL. Des protéines pures ont été obtenues pour le complexe PRMT5 produit et purifié avec son partenaire de liaison obligatoire, MEP50. La construction tronquée de PRMT9 a presque deux ou trois fois plus bas niveau d’expression, près de 1,5 mg/L, par rapport à d’autres PRMT. Néanmoins, les stocks viraux recombinants de cette construction ont été utilisés pour la production à grande échelle, des cristaux diffracting ont été obtenus, et la structure a été résolue pour cette protéine avec PRMT4, 6 et 7(Figure 5).
Pour les productions de scale-up, les virus P2 correspondants ont été utilisés pour infecter la culture en suspension de cellules d’insectes Sf9. Cette étape génère 50/100/200 mL de cellules infectées par le baculovirus contenant des cellules infectées et des virus P3 dans le surnageant. Pour la production de protéines à grande échelle, 2 L de cellules Sf9 ont été cultivées dans chacune des fioles de Fernbach de 2,8 L à 150 tr/min, 27 °C(figure 6). Le jour de la production, 2 L de cellules Sf9 (viabilité cellulaire > 97%) dans des flacons de secouage Tunair de 2,5 L ou 4 L dans des flacons de réactifs de 5 L ont été dilués à une densité cellulaire de 4 x 106/mL. Ces cellules ont été infectées directement par 10-12 mL/L de culture en suspension de cellules d’insectes infectées par le baculovirus et incubées à une température abaissée de 25 °C, à 145 rpm. L’infection du lot de production directement par une culture en suspension de cellules d’insectes infectées par le baculovirus a réduit de manière significative les étapes laborieuses et chronophages dans l’amplification du volume du virus, à l’exclusion de la manipulation supplémentaire des cellules infectées, et a évité la réduction du titre et de la dégradation du virus. L’entretien de la culture cellulaire SF9 et la production à grande échelle ont été effectués dans les récipients de culture avec un volume de remplissage élevé pour adopter une production de protéines à grande échelle dans le lot unique(Figure 6).
Les protéines PRMT 4, 5 (en complexe avec MEP50), 6, 7 et 9 produites à partir de la plate-forme de production médiée par baculovirus ont été utilisées pour la caractérisation cinétique et le criblage des composés inhibiteurs au SGC6. Les structures cristallines ont été résolues et déposées dans la banque de données sur les protéines (PDB) pour les formes pleine longueur ou tronquées des protéines PRMT 4, 6, 7 et 9 avec diverses sondes et inhibiteurs chimiques. Les plasmides d’expression de ces PRT ont été déposés dans le dépôt de plasmides Addgene (Addgene est un partenaire distributrice de la CGT, https://www.addgene.org/) et sont à la disposition du milieu de la recherche(figure 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg"> Figure 1: Aperçu schématique des étapes du processus d’expression du baculovirus Veuillez cliquer ici pour voir une version <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg"> Figure 2: Baculovirus Cellules Sf9 infectées et non infectées. Les signes d’infection sont des changements structurels dans les cellules de l’insecte, tels qu’une augmentation de 25 à 50% du diamètre de la cellule, des noyaux cellulaires élargis, une forme uniformément arrondie, une perte de prolifération et une adhérence à la surface de la boîte de culture, ainsi qu’une diminution de la viabilité cellulaire. Barre d’échelle blanche 200 μm. Les signes d’infection présentés ici sont les mêmes pour les cellules transfectées utilisant les deux réactifs de transfection, JetPrime et X-tremeGene 9. L’exemple particulier montré est pour le réactif de transfection JetPrime. (A) Cellules Sf9 non infectées comme témoin. (B) Cellules Sf9 infectées par le baculovirus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg"> Figure 3: Assemblage de plaque de liaison pour une purification rapide des protéines d’expression de test. S’il vous plaît voir le texte pour plus de détails, étapes 3.2.1-2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg"> Figure 4: Résultats du criblage de l’expression protéique. Résultats de criblage d’expression de protéine de la production négociée par baculovirus dans 4 mL de culture de suspension sf9 infectée par les virus recombinants P1 correspondants pour différents PRMT et le complexe PRMT5-MEP50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg"> Figure 5: Résumé des constructions d’expression pour PRMT4, 6, 7 et 9 utilisées pour les études sur la structure cristalline au Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC). Les structures cristallines ont été résolues et déposées dans la banque de données sur les protéines (APB) pour les formes pleine longueur ou tronquées des protéines PRMT 4, 6, 7 et 9 avec diverses sondes chimiques et inhibiteurs. Les plasmides d’expression de ces PRT ont été déposés dans le dépôt de plasmides Addgene et sont à la disposition de la communauté de recherche (Addgene est un partenaire distributrice du CGT, https://www.addgene.org/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg"> Figure 6: Entretien des cellules d’insectes Sf9 et production de protéines dans les différents récipients de culture : (A)Fiole de Fernbach de 2,8 L pour l’entretien des cellules et la production de protéines. L’utilisation du volume de remplissage de 72% augmente le débit de 2,5 fois dans une plate-forme de secousse. (B) Les fioles de secouage Tunair (seules 9 fioles sur 10 sont présentées sur cette photo) et les bouteilles de réactifs avec un volume de remplissage de 80 % augmentent considérablement la capacité de production de la plate-forme de secousse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Le système de vecteur d’expression de baculovirus (BEVS) est une plate-forme robuste pour le criblage d’expression et la production des méthyltransférases d’arginine de protéine (PRMTs) à utiliser pour des études biochimiques, biophysiques et structurelles. Des quantités milligrammes de matière peuvent être produites pour la majorité des PRT et d’autres protéines d’intérêt nécessitant une plate-forme d’expression eucaryote.

Production de protéines PRMT recombinantes à l’aide du système vectoriel d’expression du baculovirus

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

L’objectif global de ce protocole est le criblage d’expression de la construction multiple des methyltransferases d’arginine de protéine dans la production à grande échelle pour obtenir la quantité de milligramme de la protéine pour des études biochimiques, biophysiques, et structurales dans le mode moyen supporté et rentable dans la couverture de la plate-forme d’expression S, système vectoriel d’expression de baculovirus. La Dre Alma Seitova présentera les étapes suivantes. Diluer les cellules SF9 à croissance exponentielle à la densité cellulaire finale de 0,4 million par mil dans le milieu d’insecte sans sérum, et verser dans le réservoir de réactif stérile.Utilisez une pipette multicanal programmable pour ensemencer 0,5 mils de cellules SF9 diluées dans chaque puits de la plaque de 24 puits. Ce volume est suffisant pour assurer une couverture uniforme de la surface de travail du puits. Dans le même temps, il ne dilue pas trop le mélange de transfection, ce qui permet une efficacité de transfection.Étiquetez un puits de la plaque comme cellule seulement, et utilisez-le comme contrôle pour la comparaison de la cellule transfectée et non transfectée afin d’évaluer les signes potentiels d’infection. Incuber les plaques à 27 degrés jusqu’à ce que nécessaire, environ une heure, pour laisser les cellules se fixer aux plaques de culture cellulaire. Diluer le réactif de transfection bien mélangé dans le milieu d’insecte non complété et un réservoir de réactif stérile, et mélanger doucement pendant 10 secondes.À l’aide d’une pipette à 12 canaux, transférer 102 microlitres du réactif de transaction dilué dans une plaque stérile 96 MicroWell. Transférer 10 microlitres de 0,2 microgramme par microlitre d’ADN bacmid recombinant dans le puits correspondant de la plaque MicroWell de 96 puits et mélanger en secouant doucement, en tapotant la plaque sur les côtés. Incuber le mélange de transfection pendant 15 à 20 minutes pour une formation complexe.À l’aide d’une pipette réglable à six canaux conçue pour le transfert entre une plaque de 96 et 24 puits, superposez le mélange de transfection sur les cellules en goutte d’eau dans les puits correspondants des plaques de transfection et incuber pendant quatre heures à 27 degrés. Pour assurer une distribution uniforme du mélange de transfection sur la monocouche des cellules, basculez doucement les plaques d’avant en arrière plusieurs fois pendant le temps d’incubation. Quatre à cinq heures après le temps de transfection, ajoutez 1,5 mils de milieux d’insectes sans sérum.Complétez-le avec 10% final de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur et 1% antibiotique et antimycotique. Incuber des cellules dans un incubateur à 27 degrés pendant 72 à 96 heures. Basculez doucement les plaques de transfection une fois par jour lorsque cela est possible.Recherchez les signes d’infection évidents dans les cellules transfectées entre 72 et 96 heures après la transfection. Quatre à cinq jours après la transfection, les signes de l’infection devraient être évidents dans les cellules transfectées en comparaison avec les cellules de contrôle sous un microscope inversé, et les baculovirus recombinants initiaux sécrétés dans le milieu de culture cellulaire devraient être prêts à recueillir. Utilisez un multicanal électronique programmable pour permettre simultanément la collecte des virus P1, l’infection des cellules SF9 fraîchement ensemencées dans l’infection des cellules de suspension dans leurs 24 blocs de puits avec 150 microlitres des virus P1.Faites tourner le reste des stocks viraux P1 collectifs pendant 15 minutes, couvrez les 24 blocs de puits avec une culture en suspension des cellules SF9 infectées avec une feuille AirPore. Incuber le bloc de 24 puits à 27 degrés avec des secousses à 245 RPM pendant 72 à 96 heures. Quatre jours avant le temps de production prévu, diviser les cellules SF9 à croissance exponentielle, à une densité cellulaire finale de 2 millions par mil en soie dentaire de verre Erlenmeyer shake avec des chicanes dans des milieux d’insectes sans sérum contenant 1% d’antibiotique final et d’antimycotique.Cette étape générera une culture en suspension de cellules d’insectes infectées et de virus P2 dans le surnageant pour l’infection de nouvelles cellules dans le lot de production. Ajoutez les virus P2 correspondants et incuber les cellules infectées à la température inférieure de 25 degrés pour ralentir la croissance cellulaire, en secouant à 165 RPM sur un agitateur orbital avec un trait d’un pouce. Quatre jours avant le temps de production prévu, ensemencez deux litres de cellules SF9 à croissance exponentielle dans des milieux sans sérum d’insectes à la densité cellulaire de 1 million par mil, dans le flacon de secouer Fernbach de 2,8 litres.Agiter le ballon à 27 degrés en secouant à 150 RPM. Le chercheur Ashley Hutchinson démontrera le protocole suivant. Diviser quatre litres de cellules SF9 à croissance exponentielle et de milieux sans sérum d’insectes à la densité cellulaire finale de 4 millions par mil dans les grandes bouteilles de réactifs de cinq litres.Ajouter 10 à 12 mils de la culture en suspension des cellules d’insectes infectées par le baculovirus. Incuber la culture infectée des cellules SF9 dans un agitateur secouant 145 RPM à une température inférieure de 25 degrés Celsius pendant 72 à 96 heures. Des quantités de milligramme de plusieurs protéines recombinantes de la famille PRMT expriment dans la production immédiate de baculovirus dans les cellules SF9 sont utilisées pour des études pédagogiques biophysiques biochimiques, comme on peut le voir dans la figure cinq.Au SGC, les structures cristallines ont été résolues dans déposées dans la banque de données de protéines pour les formes pleine longueur ou tronquées des protéines PRMT4, 6, 7 et 9 avec diverses sondes chimiques et inhibiteurs. Les plasmides d’expression de ces PRT ont été déposés pour ajouter la collecte de gènes par SGC et sont disponibles pour le milieu de la recherche. Dans cette vidéo, nous avons souligné les éléments clés pour le criblage réussi d’expédition de leur construction multiple des methyltransferases d’arginine de protéine dans la production à grande échelle dans le système d’expression de baculovirus.L’utilisation des pipettes multicanaux réglables et programmables régulières a rendu l’ensemble de leur processus plus rapide qu’efficace. L’utilisation de haute performance et moins toxique cellulaire pour les cellules, réactif de transfection pour la génération de virus recombinants a conduit à plus rentable et ce protocole de transfection de manipulation cellulaire. L’infection du lot à grande échelle pour la production de protéines avec la culture en suspension du baculovirus infecté dans six cellules a réduit de manière significative les travaux dans l’étape de temps de temps dans l’amplification vitale de démarrage.Est par exemple, centrifuger cela avec une culture spéciale de cellules infectées. C’est bien sûr exclu la manipulation supplémentaire des cellules infectées dans éviter dans leur plus serré dans la dégradation du virus. Suspension culture culture cellule maintenance dans cette mise à l’échelle de la production dans le récipient de culture était un volume de champ élevé nous aider à surmonter la limitation du volume de production et d’adopter une plate-forme à grande échelle.Ceci est très utile pour les laboratoires qui n’ont pas accès aux bioréacteurs ou dont l’espace dans le pipeline de production est limité. Bien que notre protocole ait été décrit pour les protéines de la famille de methyltransferases d’arginine de protéine, la même approche peut être appliquée à n’importe quelle autre famille de protéines exigeant la plate-forme d’expression d’obtenir une quantité suffisante de leur protéine pour des études pédagogiques biophysiques biochimiques.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Expression de protéines recombinantes, cristallisation et études biophysiques d&#39;une<em&gt; Bacillus</em&gt; Pyrophosphorylase nucléotidique conservée, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Recherche

Biochimie

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